猪miR-23a靶向调控Smad3基因表达的研究

为了确定miR-23a是否靶向调控Smad3基因,试验利用NotⅠ和XhoⅠ酶构建包含Smad3-3′-UTR的野生型(psiCHECKTM-2-W-Smad3-3′-UTR)和突变型双荧光酶报告载体(psiCHECKTM-2-M-Smad3-3′-UTR),并在PK-15细胞中转染miR-23amimics、miR-23ainhibitor及其阴性对照,采用双荧光酶检测试剂盒检测荧光素酶活性,用实时荧光定量PCR和Western blotting法分别检测Smad3基因的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,将含Smad3-3′-UTR的野生型和突变型双荧光酶报告载体与miR-23amimic共转染PK-15细胞,野生型报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其阴性对照组(P<0.05);转染miR-23amimics能显著下调Smad3基因mRNA及其蛋白表达水平(P<0.05);而转染miR-23ainhibitor组与miR-23ainhibitor阴性对照组相比,Smad3基因蛋白表达差异不显著(P>0.05)。综合上述结果可知,猪miR-23a可靶向作用于Smad3基因。     

猪miR-199a-3p对mTOR基因表达的调控

通过生物信息学预测miR-199a-3p与mTOR-3′UTR的结合位点,人工合成猪mTOR-3′UTR及突变型片段克隆至双荧光素酶载体上,构建野生型(psiCHECK-2-W-mTOR-3′-UTR)和突变型(psiCHECK-2-M-mTOR-3′-UTR)双荧光素酶报告质粒。给PK-15细胞分别转染miR-199a-3p mimics、negative control和mTOR-3′-UTR野生型/突变型双荧光素酶报告载体,用双荧光素酶试剂盒检测荧光素酶活性,分别采用RT-qPCR和Western blot检测mTOR基因的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,将含mTOR-3′-UTR的野生型和突变型双荧光素酶报告质粒与miR-199a-3p mimic共转染PK-15细胞,野生型报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其阴性对照组(P0.05);转染miR-199a-3p mimics能显著下调mTOR基因mRNA和蛋白的表达(P0.05),而转染miR-199a-3p Inhibitor组和Inhibitor-NC组相比,mTOR基因蛋白表达差异不显著(P0.05)。成功构建了猪野生型及突变型mTOR-3′-UTR双荧光素酶报告质粒,通过双荧光素酶试验、RT-qPCR及Western blot证实miR-199a-3p与猪mTOR-3′-UTR存在靶向调控关系。     

猪ITGB1与mi R-181a靶向关系的验证

实验旨在探讨猪miR-181a与整合素β1(ITGB1)基因mRNA的靶向关系。通过生物信息学预测miR-181a与ITGB1-3'UTR的结合位点,人工合成猪ITGB1-3'UTR及突变型片段连接到双荧光素酶载体(psiCHECK-2)上,构建野生型(psiCHECK-2-W-ITGB1-3'-UTR)和突变型(psiCHECK-2-M-ITGB1-3'-UTR)双荧光酶报告载体。培养PK15细胞分别转染miR-181amimics、negativecontrol和psiCHECK-2-WITGB1-3'-UTR、psiCHECK-2-M-ITGB1-3'-UTR,用双荧光酶检测试剂盒检测荧光素酶活性,qRT-PCR检测ITGB1基因mRNA表达水平,Western blot检测ITGB1蛋白表达水平。将含psiCHECK-2-W-ITGB1-3'-UTR、psiCHECK-2-M-ITGB1-3'-UTR分别与miR-181amimic共转染PK-15细胞。结果表明:psiCHECK-2-W-ITGB1-3'-UTR组的荧光素酶活性极显著低于其阴性对照组(P0.01);转染miR-181a mimics能极显著下调ITGB1基因mRNA的表达量(P0.01),显著下调ITGB1蛋白表达量(P0.05),而转染miR-181a Inhibitor组和Inhibitor-NC组相比,ITGB1基因mRNA和蛋白表达量差异均不显著(P0.05)。本研究成功构建了猪野生型及突变型ITGB1-3'-UTR双荧光素酶报告质粒,并证实miR-181a与猪ITGB1-3'-UTR存在靶向关系。     

牛GHR基因与miR-139靶向关系的验证

旨在构建牛生长激素受体(Growth hormone receptor,GHR)基因3′非翻译区(Untranslated region,UTR)双荧光素酶载体,并确定miR-139与牛GHR基因的靶向关系。本研究采用生物信息学方法预测miR-139与牛GHR基因3′UTR的结合位点;人工合成牛GHR基因3′UTR及突变型片段并克隆至双荧光素酶载体psiCHECK-2上,构建野生型(psiCHECK2-GHR-W 3′UTR)及突变型(psiCHECK2-GHR-M 3′UTR)双荧光素酶报告质粒。将培养的Hela细胞分为4组,分别共转染miR-139mimic或阴性对照和psiCHECK2-GHR-W 3′UTR重组质粒或psiCHECK2-GHR-M 3′UTR重组质粒,然后用双荧光素酶检测试剂盒检测4组细胞中荧光素酶活性。之后培养奶牛乳腺上皮细胞,分别设对照组、阴性对照组、miR-139 mimic及miR-139inhibitor组,对阴性对照组、miR-139mimic组及miR-139inhibitor组分别转染阴性对照、miR-139mimic或miR-139inhibitor,利用qPCR(Realtime quantitative PCR)进一步检测各组miR-139及GHR基因的mRNA表达。结果,通过双酶切试验证实成功构建了野生型及突变型重组双荧光素酶报告质粒psiCHECK2-GHR-W 3′UTR和psiCHECK2-GHR-M 3′UTR;当野生型重组质粒psiCHECK2-GHR-W 3′UTR和miR-139mimic共转染Hela细胞后,双荧光素酶报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其他处理组(P0.05)。qPCR进一步证实miR-139能显著下调奶牛乳腺上皮细胞中GHR基因mRNA的表达(P0.05)。本研究成功构建了牛野生型及突变型GHR基因3′UTR双荧光素酶报告质粒;双荧光素酶试验及qPCR证实miR-139与牛GHR基因3′UTR存在靶向关系。     

β-miR-33a特异调控HADHB基因3′UTR靶标位点验证

为验证β-miR-33a与候选基因HADHB3′UTR是否存在特异性识别的靶标关系,本试验将β-miR-33amimics、β-miR-33ainhibitor及NC质粒分别转染至奶牛乳腺上皮细胞,通过Real-time(qPCR)验证β-miR-33a与HADHB基因mRNA水平表达量的关系。利用PCR获得奶牛HADHB3′UTR 201bp DNA片段,将其克隆到pmiR-RB-REPORTTM双荧光素酶报告载体中,获得野生型载体,利用定点突变技术将HADHB3′UTR种子区-CAATGCA定点突变-CATGTAGC,获得突变型载体。将野生型载体和突变型载体分别与β-miR-33a-mimics组成双荧光素酶报告系统,转染至奶牛乳腺上皮细胞,48h后测定其荧光活性。结果显示,奶牛乳腺上皮细胞中转染的野生型与突变型载体的双荧光活性存在显著性差异(P<0.05),由此证明,在奶牛乳腺上皮细胞中β-miR-33a可以与HADHB3′UTR的靶位点-CAATGCA特异性结合。     

牦牛Smad 4基因3′UTR区双荧光素酶载体构建及与bta-miR-146a的靶向验证

旨在鉴定牦牛Smad4基因与bta-miR-146a的靶向关系,为探究它们在牦牛卵巢卵泡发育过程中的可能分子调控机制提供理论基础。利用miRBase数据库和MEGA 6.0软件分析miR-146a在不同物种中的保守性,同时利用TargetScan软件预测其潜在靶基因,通过构建psiCHECK2双荧光素酶报告基因载体进行靶向验证。生物信息学分析结果显示,miR-146a成熟序列在脊椎动物中具有高度的保守性,并预测到178个与卵巢卵泡发育相关的潜在靶基因,从中选取Smad4基因分析发现其3′非编码区域(3′UTR)与bta-miR-146a存在结合位点;进一步成功构建牦牛Smad4基因3′UTR野生型及突变型psiCHECK2双荧光素酶报告质粒,荧光素酶活性检测结果显示,bta-miR-146amimic对牦牛Smad4基因3′UTR野生型报告质粒荧光活性有明显的下调作用,分别与突变型及NC对照组差异显著(P0.05)。本研究初步证实,牦牛Smad4基因是bta-miR-146a的靶基因,从而提示btamiR-146a可能通过调控Smad4基因在牦牛卵巢卵泡发育过程中的表达发挥作用。     

miR-145-4调控蛋鸭卵泡发育机制的研究

【目的】本研究旨在揭示miR-145-4在蛋鸭卵泡发育中的作用及调控机制。【方法】分离培养蛋鸭卵泡颗粒细胞,转染miR-145-4相似物(mimic)、抑制物(inhibitor)后,利用实时荧光定量PCR法检测细胞增殖凋亡相关基因的表达情况,采用RNAhybrid和Targetscan程序预测miR-145-4的靶基因及其与靶基因磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚单位α(phosphatidylinositol-3-kinase catalytic subunitα,PIK3CA)3′-UTR的结合位点,分别构建PIK3CA基因3′-UTR的野生型和突变型双荧光素酶载体,与miR-145-4 mimic和mimic-NC共转染蛋鸭卵泡颗粒细胞后,采用双荧光素酶报告系统验证miR-145-4与靶基因PIK3CA的结合关系,最后采用实时荧光定量PCR法检测miR-145-4对蛋鸭卵泡颗粒细胞中PIK3CA基因表达的影响。【结果】实时荧光定量PCR结果显示,与对照组相比,过表达miR-145-4后CyclinB2基因的表达量极显著降低(P<0.01),BCL2基因的表达量极显著增加(P<...     

猪miR-135a-5p预测靶基因APC的鉴定

本研究旨在鉴定猪miR-135a-5p靶向脂肪发育的相关基因。首先,利用生物信息学软件分析发现,结肠腺瘤性息肉病(APC)基因的3′非翻译区(3′UTR)具有两个与猪miR-135a-5p结合的潜在位点。其次,构建APC基因野生型(APC3′UTR)和突变型(APC3′UTR m1、APC3′UTR m2、APC3′UTR m3)3′UTR双荧光素酶载体,并分别将其与miR-135a-5p mimics、阴性对照(NC)共转染PK-15细胞后检测荧光活性。结果显示:miR-135a-5p mimics显著降低APC3′UTR和APC3′UTR m2载体的荧光活性(P0.05),而APC3′UTR m1和APC3′UTR m3载体的荧光活性得到完全恢复,表明miR-135a-5p主要结合在预测的第一个位点。进一步的分析表明,miR-135a-5p抑制猪前体脂肪细胞内源APC基因的mRNA和蛋白质表达水平。研究结果证实,猪miR-135a-5p靶向APC基因,且调控其表达。本试验为深入研究猪miR-135a-5p的生物学功能及其调控脂肪形成的作用机制提供了基础。     

KLF3基因3′-UTR区双荧光素酶报告载体及其突变载体的构建与活性鉴定

试验旨在构建锌指蛋白3(KLF3)基因3′-UTR区双荧光素酶基因报告载体及其突变载体,初步分析可能调控KLF3基因表达的miRNAs。首先通过PCR方法扩增KLF3基因的3′-UTR序列,将其克隆到经XhoⅠ、NotⅠ双酶切的双荧光素酶报告载体中;运用Targetscan软件预测可能与KLF3基因3′-UTR相互作用的miRNA;使用脂质体2000转染试剂将miRNAs mimics与构建好的KLF3基因3′-UTR段双荧光素酶报告载体或突变载体共转染于常规培养的293T细胞中,检测荧光素酶活性。结果表明,KLF3基因3′-UTR可能是miR-21的作用靶位点;双荧光报告显示,miR-21 mimics组(0.6900±0.0144)比突变组(1.000±0.0688)和空白对照组(1.000±0.0159)KLF3基因3′-UTR双荧光素酶基因报告载体和突变载体的活性降低了31%(P0.01)。本试验成功构建了含有KLF3基因3′-UTR段双荧光素酶基因报告载体与突变载体,初步证实miR-21对KLF3基因有调控作用。     

miR-137-3p靶向MAX基因对前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的影响

【目的】研究miR-137-3p在前脂肪细胞(3T3-L1)分化过程中的功能及作用机制。【方法】收集诱导分化第0、2、4、6和8天的3T3-L1细胞,利用实时荧光定量PCR检测miR-137-3p相对表达量;将miR-137-3p的模拟物(mimics)、抑制物(inhibitor)和阴性对照(NC)分别转染3T3-L1细胞并诱导成脂分化,油红O染色观察脂滴形成情况,利用实时荧光定量PCR检测成脂标志基因CAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、C/EBPβ、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和脂肪酸结合蛋白4(FABP4)相对表达量,用Western blotting检测C/EBPβ、PPARγ和FABP4蛋白表达水平;利用TargetScan在线网站预测miR-137-3p的靶基因,比对候选靶基因3′-UTR区与miR-137-3p结合位点在不同物种间的序列保守性。分别将miR-137-3p mimics、NC与3′-UTR-WT和3′-UTR-Mut载体共转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告试验检测miR-137-3p与MYC相关因子X(MAX)基因的靶向关系。将s...     

miR-132-3p靶向UCP2调节绵羊前体脂肪细胞分化的研究

旨在研究miR-132-3p对绵羊前体脂肪细胞中UCP2基因的表达调控机制。本研究以绵羊皮下脂肪细胞为研究对象,检测miR-132-3p与UCP2在绵羊前体脂肪细胞中的作用机制;利用生物信息学软件预测miR-132-3p与UCP2的结合位点,并通过双荧光素酶报告试验验证miR-132-3p与UCP2的靶标关系;在绵羊前体脂肪细胞中过表达miR-132-3p,用RT-qPCR、Western blotting技术检测过表达后UCP2mRNA和蛋白的表达水平;最后,采用RT-qPCR检测绵羊前体脂肪细胞分化过程中UCP2和miR-132-3p的表达。结果表明,miR-132-3p在UCP2 3′-UTR上存在结合位点,并显著下调UCP2 3′-UTR重组双荧光质粒的相对荧光活性(P0.05);过表达miR-132-3p显著下调UCP2mRNA的表达(P0.05),且明显降低UCP2蛋白的表达量;绵羊前体脂肪细胞分化中期miR-132-3p与UCP2的表达存在负相关关系。综上表明,miR-132-3p通过特异性结合UCP2 3′-UTR抑制UCP2在mRNA和蛋白水平的表达,在一定程度上促进绵羊前体脂肪细胞的分化。     

chi-miR-128-3p和chi-miR-218对Nr1d2基因的靶向调控研究

为了探究chi-miR-128-3p和chi-miR-218对钟基因Nr1d2的靶向调控关系,以psiCHECKTM-2为载体,构建了野生型和突变型载体,转染293A细胞系,并通过双荧光素酶系统检测,chi-miR-218 mimics能使野生型荧光素酶活性极显著下降,而对突变型荧光素酶活性无影响,说明chi-miR-...     

miR-33a靶向Lipin1和IRS2调节绵羊前体脂肪细胞分化的研究

旨在揭示miR-33a在绵羊前体脂肪细胞分化中的生物学功能。本研究以15日龄雄性绵羊背部皮下前体脂肪细胞为试验材料,所有的试验均设立3个重复;利用生物信息学软件预测miR-33a的靶基因,并通过双荧光素酶报告试验对预测的潜在靶基因进行验证;用qPCR和Western blotting分别检测miR-33a、Lipin1和IRS2及其编码蛋白的表达,以揭示miR-33a与其靶基因在绵羊前体脂肪细胞分化中的表达规律;慢病毒介导实现miR-33a的过表达和干扰后,检测Lipin1、IRS2和成脂标志基因的表达,并用油红O染色检测脂滴沉积能力,以解析miR-33a对其靶基因的调节机制。生物信息学分析发现,miR-33a与Lipin1和IRS2 3′-UTR都存在结合位点,miR-33a显著下调Lipin1和IRS2野生型双荧光质粒的相对荧光活性(P0.05);在绵羊前体脂肪细胞分化中,miR-33a与Lipin1和IRS2的表达趋势相反;过表达miR-33a后,显著下调了Lipin1(P0.01)和IRS2(P0.05)及其编码蛋白以及成脂标志基因的表达;干扰miR-33a后,这些基因和蛋白的表达则显著上调;过表达miR-33a减少了脂滴沉积,干扰miR-33a促进了脂滴沉积。在绵羊前体脂肪细胞分化中,miR-33a与Lipin1和IRS2的表达呈负相关。miR-33a靶向Lipin1和IRS2的3′-UTR抑制绵羊前体脂肪细胞分化和脂滴沉积。     

microRNA-425-5p对3T3-L1前体脂肪细胞增殖、分化的影响

为了探究miR-425-5p对小鼠3T3-L1前体脂肪细胞增殖、分化的影响效应,本试验采用实时荧光定量PCR检测miR-425-5p组织和细胞表达水平;运用CCK8、EdU、油红染色、甘油三酯含量分析等分别检测miR-425-5p对前体脂肪细胞增殖、分化的影响;利用生物信息学软件和双荧光素酶报告试验分别预测、验证miR-425-5p调控前体脂肪细胞分化的靶基因。结果表明,miR-425-5p在肥胖小鼠脂肪组织中低表达,在前体脂肪细胞增殖、分化过程中动态表达;与阴性对照相比,过表达miR-425-5p可促进前体脂肪细胞增殖,抑制脂肪细胞分化标志基因(PPARγ、C/EBPα、FAS等)表达,减少脂滴和甘油三酯积累;抑制miR-425-5p表达可抑制前体脂肪细胞增殖,阻止前体脂肪细胞诱导分化。在前体脂肪细胞分化过程中,过表达或抑制miR-425-5p可分别抑制或促进IGF1基因表达;与阴性对照相比,过表达miR-425-5p可抑制IGF1基因3′-UTR荧光活性,而突变miR-425-5p种子序列与IGF1基因3′-UTR的绑定位点可解除该抑制效果。综上所述,miR-425-5p可促进3T3-L1前体脂肪细胞增殖,并可直接靶向IGF1负向调控其分化。     

microRNA-425-5p对3T3-L1前体脂肪细胞增殖、分化的影响

为了探究miR-425-5p对小鼠3T3-L1前体脂肪细胞增殖、分化的影响效应,本试验采用实时荧光定量PCR检测miR-425-5p组织和细胞表达水平;运用CCK8、EdU、油红染色、甘油三酯含量分析等分别检测miR-425-5p对前体脂肪细胞增殖、分化的影响;利用生物信息学软件和双荧光素酶报告试验分别预测、验证miR-425-5p调控前体脂肪细胞分化的靶基因。结果表明,miR-425-5p在肥胖小鼠脂肪组织中低表达,在前体脂肪细胞增殖、分化过程中动态表达;与阴性对照相比,过表达miR-425-5p可促进前体脂肪细胞增殖,抑制脂肪细胞分化标志基因(PPARγ、C/EBPα、FAS等)表达,减少脂滴和甘油三酯积累;抑制miR-425-5p表达可抑制前体脂肪细胞增殖,阻止前体脂肪细胞诱导分化。在前体脂肪细胞分化过程中,过表达或抑制miR-425-5p可分别抑制或促进IGF1基因表达;与阴性对照相比,过表达miR-425-5p可抑制IGF1基因3′-UTR荧光活性,而突变miR-425-5p种子序列与IGF1基因3′-UTR的绑定位点可解除该抑制效果。综上所述,miR-425-5p可促进3T3-L1前体脂肪细胞增殖,并可直接靶向IGF1负向调控其分化。     

miR-18b-3p靶向SCD调控绵羊前体脂肪细胞分化的研究

本实验旨在研究miR-18b-3p及其靶基因SCD调控绵羊前体脂肪细胞分化的作用机制。采集3日龄公羊背最长肌,培养绵羊前体脂肪细胞并进行诱导分化,采用油红O染色检测细胞分化情况;通过TargetScan预测miR-18b-3p的靶基因,通过qRT-PCR测定miR-18b-3p、靶基因SCD以及分化标志基因PPARγ、CEBPα在分化过程中的时序性表达;分别转染miR-18b-3p过表达载体(mimics)或抑制载体(inhibitor)及阴性对照至前体脂肪细胞后,通过qRT-PCR及Western blot检测miR-18b-3p对SCD以及分化标志基因表达量的作用;采用双荧光素酶证明miR-18b-3p是否靶向SCD基因。结果表明:miR-18b-3p在分化过程中的表达量先上升后下降,在第6天表达量最高;SCD表达量低于阴性对照组(P0.01),PPARγ及CEBPα基因表达量均低于阴性对照组(P0.05),SCD蛋白表达量低于阴性对照组(P0.01),油红O染色面积减少(P0.05);转染miR-18b-3p inhibitor后,SCD、CEBPα基因表达量均高于阴性对照组(P0.01),PPARγ基因表达量高于阴性对照组(P0.05),SCD蛋白表达量高于阴性对照组(P0.01),油红O染色面积增加(P0.05);miR-18b-3p对SCD基因具有直接靶向作用。本实验首次在绵羊上证明miR-18b-3p可以通过靶向SCD抑制前体脂肪细胞分化,为绵羊选育给予分子育种技术支撑。     

miR-23b-3p对延边黄牛垂体细胞中生长激素分泌影响的研究

为了分析血液外胞体miRNA对延边黄牛垂体细胞中生长激素(GH)分泌的影响,试验选择在延边黄牛和韩延牛血液外胞体中存在显著差异表达的miR-23b-3p,分析其对延边黄牛垂体细胞中GH分泌的影响机制。首先进行延边黄牛垂体细胞的原代培养,然后将miR-23b-3p的mimics(miR-23b-3p-mi组)、mimics对照品(NC组)、inhibitor(miR-23b-3p-in组)、inhibitor对照品(iNC组)转染至已建立的垂体原代细胞中,48 h后收集细胞,提取总mRNA和总蛋白,利用实时荧光定量PCR(qPCR)和Western-blot技术分别检测GH mRNA转录和蛋白的表达情况;利用targetscan和RNAhybrid分析软件对miR-23b-3p的靶基因进行预测,再利用双荧光素酶报告基因系统对miR-23b-3p的靶关系进行了验证;最后利用实时荧光定量PCR和Western-blot技术分别检测miR-23b-3p靶基因的mRNA转录和蛋白表达情况。结果表明:miR-23b-3p-mi组的延边黄牛垂体细胞中GH mRNA转录和蛋白表达水平极显著低于NC组(P0.01),而miR-23b-3p-in组的延边黄牛垂体细胞中GH mRNA转录和蛋白表达水平显著高于iNC组(P0.05);miR-23b-3p靶向了垂体特异性转录因子(POU1F1)的3′UTR;miR-23b-3p-mi组的POU1F1 mRNA转录和蛋白表达水平极显著低于NC组(P0.01),而miR-23b-3p-in组的POU1F1 mRNA转录和蛋白表达水平极显著高于iNC组(P0.01)。说明miR-23b-3p可通过调节POU1F1基因的表达来调控延边黄牛垂体细胞GH的分泌,进而调控延边黄牛的生长发育。     

猪E2F3基因3′UTR双荧光素酶报告基因质粒构建及其与miR-10a-5p的靶向验证

为了鉴定miR-10a-5p与猪E2F3基因的靶向关系,试验从生物信息miRNA Base数据库查询miR-10a-5p的相关信息,并运用MEGA 6.0软件分析其保守性,通过Target Scan生物信息学网站预测其潜在的靶基因及结合位点,然后PCR扩增E2F3基因3′非编码区(3′UTR)片段,构建E2F3的野生型(E2F3-3′UTR-wt)和突变型(E2F3-3′UTR-mut)双荧光素酶报告基因质粒,并分别与miR-10a-5p mimics、mimics NC共转染至293T细胞中,检测双荧光素酶活性变化。结果表明:miR-10a-5p在7个物种间具有高度保守性,成熟序列均为UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGU;Target Scan生物信息学网站预测到miR-10a-5p具有包括E2F3基因在内的共241个潜在的靶基因;E2F3基因片段经PCR扩增获得大小约1 288 bp的清晰条带,测序结果与预期一致;转染miR-10a-5p mimics能显著降低猪E2F3基因野生型质粒双荧光素酶活性(P0.05)。说明猪E2F3基因3′UTR双荧光素酶报告基因质粒构建成功,且其与miR-10a-5p之间存在靶向关系。     

miR-215-5p通过靶向NCOA3基因抑制固始鸡腹部前脂肪细胞的增殖和分化

为揭示miR-215-5p在固始鸡腹部脂肪沉积中的作用机制,本研究采用实时荧光定量PCR,分析了miR-215-5p在14周龄固始鸡8种组织和腹部前脂肪细胞分化过程的表达特征;通过miR-215-5p mimics和inhibitors转染试验,利用CCK-8、EdU、油红O染色、甘油三酯含量测定等方法,分别评价了miR-215-5p对固始鸡腹部前体脂肪细胞增殖和分化的影响。结果表明:miR-215-5p在固始鸡腹脂和皮脂等组织中高表达,在前脂肪细胞分化过程具明显时序表达特征;当转染miR-215-5p mimics后,前体脂肪细胞中增殖标志基因CDK1和PCNA表达水平极显著下降(P0.01)、细胞周期阻滞因子p21表达水平极显著升高(P0.01),EdU阳性细胞比例和前脂肪细胞总数极显著降低;同时,可显著抑制脂肪细胞分化标志基因PPARG、CEBPA、FABP4和LPL的表达,减少脂肪细胞内脂滴生成和甘油三酯含量。与此不同,miR-215-5p inhibitors转染前脂肪细胞后,在增殖和分化上获得与miR-215-5p mimics转染后相反的结果。同时,采用双荧光素酶报告基因系统,验证了mi-R-215-5p的靶基因,过表达miR-215-5p可抑制核受体辅激活因子3 (nuclear receptor coactivator 3, NCOA3)基因3′-UTR区荧光活性,而突变NCOA3基因3′-UTR区与miR-215-5p种子序列的结合位点可解除其抑制效果。上述结果证明,miR-215-5p可抑制固始鸡腹部前脂肪细胞的增殖和分化,且在脂肪细胞分化过程中直接靶作用于NCOA3。因此,miR-215-5p是固始鸡腹部脂肪形成的一个负调控因子。     

miR-17-3p靶向KCTD15调控延边黄牛前体脂肪细胞分化

旨在探究miR-17-3p是否可以通过靶向KCTD15调节延边黄牛前体脂肪细胞的分化。本研究使用生物信息学软件鉴定miR-17-3p的同源性，预测miR-17-3p的靶基因；通过在延边黄牛的前体脂肪细胞中转染miR-17-3p mimic或miR-17-3p inhibitor及阴性对照实现细胞内miR-17-3p过表达或抑制表达；采用双荧光素酶报告基因检测系统确定miR-17-3p与KCTD15的靶标关系；使用qRT-PCR和Western blot技术在mRNA和蛋白水平上检测miR-17-3p对KCTD15基因以及脂代谢标志基因PPARγ和C/EBPα表达水平的影响。结果表明，生物信息学软件预测KCTD15可作为miR-17-3p的靶基因，且miR-17-3p在哺乳动物中具有较高的同源性；转染miR-17-3p mimic后脂代谢标志基因PPARγ和C/EBPα的mRNA和蛋白表达量显著或极显著高于转染NC-mimic的对照组（P<0.05或P<0.01）；抑制miR-17-3p的表达后，PPARγ和C/EBPα的表达量则显著或极显著低于对照组（P<0.05或P<0.01）；双荧光素酶报告基因验证分析显示，过表达miR-17-3p极显著抑制了含有KCTD15 3'UTR片段的载体的荧光活性（P<0.01）；过表达miR-17-3p也会显著或极显著抑制候选靶基因KCTD15 mRNA和蛋白质的表达量（P<0.05或P<0.01）；而抑制miR-17-3p的表达则会显著提高靶基因KCTD15的mRNA和蛋白质的表达量（P<0.05）。这些结果说明，miR-17-3p可能通过抑制KCTD15的表达促进延边黄牛前体脂肪细胞分化。