滑液支原体GDPD基因的原核表达、酶活性分析及亚细胞定位

为了解滑液支原体（Mycoplasma synoviae,MS）甘油磷酸二酯磷酸二酯酶（glycerophosphodoester phosphodiesterase,GDPD）的生物学功能,本试验参照GenBank中MS WVU1853株序列设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得MS WVU1853株GDPD基因,在测序及序列分析的基础上将其克隆至pET-28a（+）质粒构建原核表达载体pET-GDPD,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后经IPTG诱导表达,纯化表达产物并分析其酶促活性,进而制备其多克隆抗体,应用间接ELISA和Western blotting检测其免疫原性并分析其在MS内的分布。结果表明,MS WVU1853株GDPD基因CDS全长726 bp,编码242个氨基酸,重组蛋白分子质量约为28 ku。酶促活性检测表明,重组蛋白可催化对硝基苯磷酸二钠（pNPP）转化为对硝基苯酚,且其作用的最适pH为9.0,最佳温度为37℃,Pb²⁺具有较强的抑制作用,而Ca²⁺对其具有较强的促进作用。间接ELISA及Western blotting检测结果表明,MS GDPD具有良好的免疫原性,可刺激新西兰兔产生高水平的抗体,血清效价高达1：160000;亚细胞定位结果表明,MS GDPD在细胞膜和细胞浆内均有分布,但在细胞膜的含量略高于细胞浆。本研究结果为探究MS GDPD生物学功能提供了一定的参考依据。     

牛支原体pdhc基因的克隆、表达及其亚细胞定位

试验旨在研究牛支原体（Mycoplasma bovis,M.bovis）武威株二氢硫辛酰胺转乙酰酶（PDHc-E2）基因序列特征及其在牛支原体细胞中的位置。参照GenBank中牛支原体HB0801株pdhc基因（登录号：CP002058.1）设计引物,应用PCR扩增获得牛支原体武威株pdhc基因,在测序及序列分析的基础上,应用Overlap PCR完成点突变后将其克隆至pET-28a（+）中,构建原核表达载体pET-pdhc。pET-pdhc转化大肠杆菌Rosetta（DE3）感受态细胞后经IPTG诱导获得融合蛋白,将纯化蛋白免疫新西兰兔制备多抗血清,应用iELISA和Western blotting对牛支原体武威株PDHc-E2在细胞内的分布进行初步研究。结果显示,牛支原体武威株pdhc基因CDS全长735 bp,编码244个氨基酸,与国内牛支原体分离株HB0801、Hubei-1、CQ-W70、NM2012等基因序列完全一致,与国际标准株PG45同源性为99.2%,与无乳支原体（M.agalactiae）同源性为90.9%~91.2%,与加利福尼亚支原体（M.californicum）ST6株的同源性仅为78.4%,基因序列非常保守;通过Overlap PCR将该基因中4个编码色氨酸的TGA密码子突变为TGG,且完成点突变后的基因在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白大小约为29 ku,主要以可溶性形式存在,iELISA结果显示,重组蛋白PDHc-E2具有较高的免疫原性,可刺激新西兰兔产生高水平的抗体,血清效价高达1：100 000;亚细胞定位结果表明,制备的多抗血清与重组蛋白PDHc-E2、牛支原体全菌蛋白、牛支原体膜蛋白、牛支原体胞浆蛋白均能发生特异性结合,说明该蛋白在牛支原体细胞膜和细胞质中均有分布,为膜相关蛋白,但在细胞质中的分布多于细胞膜。本研究结果为进一步研究牛支原体的生物学功能提供了理论依据。     

牛支原体pdhc基因的克隆、表达及其亚细胞定位

试验旨在研究牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)武威株二氢硫辛酰胺转乙酰酶(PDHc-E2)基因序列特征及其在牛支原体细胞中的位置。参照GenBank中牛支原体HB0801株pdhc基因(登录号:CP002058.1)设计引物,应用PCR扩增获得牛支原体武威株pdhc基因,在测序及序列分析的基础上,应用Overlap PCR完成点突变后将其克隆至pET-28a(+)中,构建原核表达载体pET-pdhc。pET-pdhc转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞后经IPTG诱导获得融合蛋白,将纯化蛋白免疫新西兰兔制备多抗血清,应用iELISA和Western blotting对牛支原体武威株PDHc-E2在细胞内的分布进行初步研究。结果显示,牛支原体武威株pdhc基因CDS全长735bp,编码244个氨基酸,与国内牛支原体分离株HB0801、Hubei-1、CQ-W70、NM2012等基因序列完全一致,与国际标准株PG45同源性为99.2%,与无乳支原体(M.agalactiae)同源性为90.9%~91.2%,与加利福尼亚支原体(M.californicum)ST6株的同源性仅为78.4%,基因序列非常保守;通过Overlap PCR将该基因中4个编码色氨酸的TGA密码子突变为TGG,且完成点突变后的基因在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白大小约为29ku,主要以可溶性形式存在,iELISA结果显示,重组蛋白PDHc-E2具有较高的免疫原性,可刺激新西兰兔产生高水平的抗体,血清效价高达1∶100 000;亚细胞定位结果表明,制备的多抗血清与重组蛋白PDHc-E2、牛支原体全菌蛋白、牛支原体膜蛋白、牛支原体胞浆蛋白均能发生特异性结合,说明该蛋白在牛支原体细胞膜和细胞质中均有分布,为膜相关蛋白,但在细胞质中的分布多于细胞膜。本研究结果为进一步研究牛支原体的生物学功能提供了理论依据。     

牛支原体EF-Tu基因的克隆表达、亚细胞定位及间接ELISA方法建立

旨在获得牛支原体延伸因子EF-Tu蛋白,分析其在牛支原体菌体内的分布情况,建立EF-Tu间接ELISA法,为进一步研究牛支原体EF-Tu的生物学功能提供理论依据,也为建立牛支原体有效的血清学诊断方法和亚单位疫苗的研制奠定基础。参照Uniprot数据库中M.bovis PG45株EF-Tu基因序列,应用Overlap PCR扩增获得EF-Tu基因并将其克隆至pMD19-T载体,测序正确后,构建pET32a-EF-Tu原核表达载体,转化大肠杆菌BL21表达菌,IPTG诱导表达,纯化后的表达产物免疫新西兰兔(New Zealand rabbit)制备多克隆抗体,利用间接ELISA测定高免血清抗体效价,用Western blot和间接ELISA法初步定位EF-Tu在菌体内的分布,通过优化反应条件,建立间接ELISA检测法。结果表明:重组蛋白EF-Tu约为66ku,主要以可溶性形式表达;采用间接ELISA测定的多克隆抗体效价为1:6400;Western blot和ELISA表明该蛋白在牛支原体细胞质和细胞膜中均有表达,且含量相当。利用EF-Tu建立的ELISA法具有很好的特异性和敏感性。通过原核表达系统成功得到牛支原体延伸因子的重组蛋白,该蛋白分布于菌体细胞质和膜表面,且含量基本相当。本研究所建立的EF-Tu ELISA法适合大规模的血清学诊断检测。     

伪狂犬病毒SL株gL基因的克隆、原核表达、抗体制备及亚细胞定位

通过PCR从伪狂犬病毒(PRV)SL株基因组中扩增出gL基因,将产物亚克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,测序验证后将重组质粒转化至E.coli Rosseta,进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测显示诱导表达蛋白约33 000,同预期大小相符,通过Western blot检测可知重组蛋白具有较好的抗原性。使用Ni 2+-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化重组蛋白,纯化后的重组蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,经琼脂扩散试验测定,效价达1∶8。通过免疫荧光技术进行PRV gL亚细胞定位检测,结果显示最早可在感染后4h的细胞质中检测到特异性荧光,并随着PRV的复制gL表达增加。试验结果为进一步研究gL基因的功能和PRV的致病机理提供了重要依据。     

文山牛SIRT2基因的克隆、表达及亚细胞定位

试验旨在克隆文山牛SIRT2基因,检测SIRT2基因在文山牛不同组织中的表达谱并进行序列分析,鉴定其在293A细胞系中的亚细胞定位。参照GenBank中牛SIRT2基因序列（登录号：NM_001113531.1）,在其保守区设计1对特异性引物,以cDNA为模板克隆文山牛SIRT2基因,进行同源性和系统进化分析;以GAPDH基因为内参分析SIRT2基因在文山牛心脏、肝脏、肾脏、肺脏、胃、结肠、肌肉、脂肪8个组织中的表达水平;构建pDsRed-SIRT2真核表达载体并转染到293A细胞系中表达,观察融合蛋白的亚细胞定位。结果表明,文山牛SIRT2基因开放阅读框全长1 173 bp,编码390个氨基酸,分子质量为43.3 ku,理论等电点为4.985;SIRT2编码蛋白整体表现为亲水性,带有负电荷。文山牛与水牛、白豚、蹄蝠等哺乳动物具有较高的同源性,在系统发育树中距离最近,但与树袋熊距离稍远,推测有袋目哺乳动物在进化过程中过早地与其他哺乳动物产生了遗传差异,在哺乳动物遗传相关的研究中需特殊考虑有袋目哺乳动物。实时荧光定量PCR结果显示,SIRT2基因在文山牛8个组织中均有表达,在肌肉和肝脏中的表达水平较高,与其他组织存在显著差异（P<0.05）。pDsRed-SIRT2融合蛋白主要定位于293A细胞的细胞质中,可能参与部分细胞器的运作及细胞内物质的运输,调节细胞稳态并在细胞繁殖过程中提供必要的能量物质。本试验结果为进一步探究牛SIRT2基因功能提供了一定的理论依据。     

文山牛SIRT2基因的克隆、表达及亚细胞定位

试验旨在克隆文山牛SIRT2基因,检测SIRT2基因在文山牛不同组织中的表达谱并进行序列分析,鉴定其在293A细胞系中的亚细胞定位。参照GenBank中牛SIRT2基因序列(登录号:NM_001113531.1),在其保守区设计1对特异性引物,以cDNA为模板克隆文山牛SIRT2基因,进行同源性和系统进化分析;以GAPDH基因为内参分析SIRT2基因在文山牛心脏、肝脏、肾脏、肺脏、胃、结肠、肌肉、脂肪8个组织中的表达水平;构建pDsRed-SIRT2真核表达载体并转染到293A细胞系中表达,观察融合蛋白的亚细胞定位。结果表明,文山牛SIRT2基因开放阅读框全长1 173bp,编码390个氨基酸,分子质量为43.3ku,理论等电点为4.985;SIRT2编码蛋白整体表现为亲水性,带有负电荷。文山牛与水牛、白豚、蹄蝠等哺乳动物具有较高的同源性,在系统发育树中距离最近,但与树袋熊距离稍远,推测有袋目哺乳动物在进化过程中过早地与其他哺乳动物产生了遗传差异,在哺乳动物遗传相关的研究中需特殊考虑有袋目哺乳动物。实时荧光定量PCR结果显示,SIRT2基因在文山牛8个组织中均有表达,在肌肉和肝脏中的表达水平较高,与其他组织存在显著差异(P0.05)。pDsRed-SIRT2融合蛋白主要定位于293A细胞的细胞质中,可能参与部分细胞器的运作及细胞内物质的运输,调节细胞稳态并在细胞繁殖过程中提供必要的能量物质。本试验结果为进一步探究牛SIRT2基因功能提供了一定的理论依据。     

高羊茅FaRVE8基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

生物钟是一个复杂的调控网络,在环境的不断变化中促进植物的生长,REVEILLE8 (RVE8)是生物钟的重要基因。为探讨其分子机理,采用RT-PCR和RACE方法,克隆高羊茅叶片FaRVE8基因,结果显示,FaRVE8全长为1881 bp,有1236 bp的开放阅读框,编码411个氨基酸,同属于MYB样因子。遗传进化树表明其与禾本科植物二穗短柄草、节节麦、大麦的同源蛋白亲缘关系较近。利用荧光定量分析高羊茅叶片中FaRVE8在不同光照处理下的表达特征,结果表明,FaRVE8在不同光照处理下均有表达,且呈现出明显的昼夜节律。亚细胞定位显示FaRVE8定位在细胞核中,可能在细胞核中发挥重要作用。以上研究表明,FaRVE8在调节生物节律中有重要作用,为进一步探讨FaRVE8基因的功能和分子调控机制奠定基础。     

高羊茅FaRVE8基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

生物钟是一个复杂的调控网络,在环境的不断变化中促进植物的生长,REVEILLE8 (RVE8)是生物钟的重要基因。为探讨其分子机理,采用RT-PCR和RACE方法,克隆高羊茅叶片FaRVE8基因,结果显示,FaRVE8全长为1881 bp,有1236 bp的开放阅读框,编码411个氨基酸,同属于MYB样因子。遗传进化树表明其与禾本科植物二穗短柄草、节节麦、大麦的同源蛋白亲缘关系较近。利用荧光定量分析高羊茅叶片中FaRVE8在不同光照处理下的表达特征,结果表明,FaRVE8在不同光照处理下均有表达,且呈现出明显的昼夜节律。亚细胞定位显示FaRVE8定位在细胞核中,可能在细胞核中发挥重要作用。以上研究表明,FaRVE8在调节生物节律中有重要作用,为进一步探讨FaRVE8基因的功能和分子调控机制奠定基础。     

草地早熟禾PpGA2ox基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

利用RACE技术从草地早熟禾中克隆赤霉素合成代谢的关键酶GA2-氧化酶基因(PpGA2ox),提交到GenBank,登录号为KX254272。其开放阅读框为1047bp,编码348个氨基酸。系统进化分析表明,PpGA2ox与大麦、小麦及二穗短柄草中的GA2ox亲缘关系较近。亚细胞定位结果显示,其编码的蛋白定位于细胞核和细胞质中。实时荧光定量分析表明,PpGA2ox在幼嫩叶片中的表达量最高,且受GA3、MeJA及IAA三种激素的诱导。     

鸭瘟病毒dUTPase基因克隆、原核表达及在病毒感染宿主亚细胞中的定位分析

根据笔者实验室新发现的鸭瘟病毒（DPV）dUTPase基因（GenBank登录号DQ486149）序列设计1对引物,PCR扩增后将产物亚克隆至pET32a（＋）原核表达载体,获得表达质粒pET32a-DU。然后将其转化至E．coliBL21（DE3）进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测显示诱导表达蛋白约66．8ku,与预期表达蛋白大小一致。薄层扫描分析表明重组蛋白占菌体总蛋白的36．2％,主要以包涵体的形式存在。重组蛋白纯化后制备兔抗血清,间接EUSA效价为1：409600。通过免疫荧光技术进行DPVdUTPase亚细胞定位检测,结果显示最早可在感染后4h的胞质中检测到特异性荧光,12h大量点状绿色荧光聚集于胞核;24h后胞核内点状荧光减弱,而胞质点状荧光增强;48h胞核和胞质荧光均显著减弱。本研究为DPVdUTPase基因功能和DPV致病机理的研究提供了重要数据。     

家蚕脂蛋白基因BmLp-c21的表达分析及蛋白质亚细胞定位

家蚕30 kD脂蛋白家族在家蚕的生长发育过程中具有重要的生理功能。从家蚕蛹cDNA文库中克隆到一条编码30kD蛋白质的基因cDNA序列,该序列全长2 803 bp,ORF为792 bp,编码含263个氨基酸残基的脂蛋白(low molecular 30K lipo-protein pBmHPC-21;GenBank登录号:Q00801),命名为BmLp-c21。将BmLp-c21克隆至原核表达载体pET-28a(+),转化E.coli Rosetta(DE3),IPTG诱导表达后通过亲和层析得到纯化的融合蛋白,并免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。亚细胞定位显示BmLp-c21主要存在于细胞质中,呈点状或者片状分布。通过实时荧光定量PCR和Western blotting方法,分别检测到家蚕不同发育时期和5龄幼虫不同组织中BmLp-c21 mRNA的转录水平与蛋白质的表达水平存在较大差异,在蛹期及5龄幼虫血淋巴中的mRNA转录水平和蛋白质表达水平最高。初步推测BmLp-c21在家蚕蛹的变态发育过程以及蚕体脂质的运输方面具有重要的功能。     

家蚕Mod基因的序列分析及表达与亚细胞定位研究

已知多数含BTB/POZ结构域的锌指蛋白对生物体的发育、分化及染色体重组等具有重要的调节作用。从已构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条编码MOD(mdg4)蛋白的基因序列(GenBank登录号:DN237077)。该基因序列的ORF长1 080 bp,编码359个氨基酸残基,蛋白含有BTB保守结构域和FLYWCH保守结构域,与黑腹果蝇、冈比亚按蚊、赤拟谷盗和埃及伊蚊的MOD多序列比对,其同源性不超过40%。表达、纯化带有His标签的家蚕MOD蛋白(BmMOD),并用纯化的融合蛋白免疫新西兰兔获得多克隆抗体。实时荧光定量PCR显示BmMod基因mRNA转录水平在家蚕蛾期及5龄幼虫的卵巢最高,推测BmMod基因在家蚕生殖腺发育过程中产生一定作用。利用纯化的BmMOD蛋白多克隆抗体进行Western blotting分析也表明该蛋白在家蚕蛾期及5龄幼虫卵巢中的表达量最高,验证了BmMod在家蚕生殖腺发育中的功能。亚细胞定位结果显示BmMOD蛋白几乎完全定位于家蚕卵巢上皮细胞(BmN)的细胞核中。     

日本结缕草ZjPPH2基因的克隆、亚细胞定位及表达分析

利用RACE技术从日本结缕草中克隆得到1个脱镁叶绿素脱镁叶绿酸水解酶基因ZjPPH2(GenBank登录号:MG870086)。其开放阅读框为1140bp,编码379个氨基酸。构建系统进化树发现,ZjPPH2蛋白与高粱亲缘关系最近。通过染色体步移的方法得到ZjPPH2基因ATG上游1699bp序列,PLACE在线预测结果表明,其启动子序列上具有响应ABA、MeJA、SA的调控元件及若干光响应元件。亚细胞定位结果显示,ZjPPH2定位于叶绿体。荧光定量数据表明,ZjPPH2基因在衰老叶片中的表达量最高,且受ABA、MeJA、SA及黑暗处理的调控。     

家蚕具有CHCH结构域的蛋白家族基因BmCH的原核表达和亚细胞定位

含有CHCH保守结构域的蛋白在不同物种中行使不同的功能。从家蚕蛹cDNA文库筛选获得一条cDNA序列,经生物信息学分析发现其编码蛋白含有一个CHCH保守结构域,将该基因命名为BmCH(GenBank登录号:DQ443425.1)。该序列开放阅读框大小为435 bp,编码144个氨基酸残基。将成功构建的重组质粒pET-28a(+)-BmCH转化到E.coli Rosetta(DE3)菌株,经IPTG诱导表达BmCH融合蛋白,用亲和层析进行纯化后,将融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。通过Westernblotting检测BmCH在家蚕4个发育时期和5龄幼虫组织中的表达情况与用荧光定量PCR检测BmCH在家蚕不同发育时期及5龄幼虫组织中的转录结果基本一致:该蛋白在卵、幼虫、蛹、蛾4个发育时期均有表达,其中在5龄幼虫期的表达量最高;该蛋白在5龄幼虫的表皮、精巢、中肠、丝腺和卵巢中有明显表达,在血淋巴、马氏管、脂肪体中的表达量较少,但差异不大,而在气管和头部没有表达。利用抗体的免疫荧光标记对BmCH在家蚕BmN细胞中的定位进行研究,观察到该蛋白主要分布在细胞质中。初步推测BmCH可能是家蚕生长发育的必需蛋白,参与多种细胞生命活动的过程。     

家蚕ycaCR基因的表达特征及蛋白质的亚细胞定位

ycaC相关蛋白含有一个保守的ycaC-related结构域,属于异分支酸酶超家族成员。从家蚕蛹cDNA文库中检索到一条EST序列,编码一个含ycaC-related保守结构域的蛋白质,将该cDNA的全长序列命名为BmycaCR(GenBank登录号:GU292794)。通过基因克隆、原核表达和纯化技术得到BmycaCR蛋白,用纯化的蛋白质为抗原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。Western blot检测BmycaCR蛋白在家蚕卵期的表达水平明显高于其它发育时期,蛋白质在5龄幼虫的睾丸、马氏管、气管、卵巢、表皮、肠和脂肪体中均有表达,而在头部、血液和丝腺中没有检测到阳性信号。荧光定量PCR检测BmycaCR在家蚕卵期的转录水平明显高于其它发育时期,在5龄幼虫各组织中,BmycaCR的转录水平由高到低依次为睾丸、气管、脂肪体、卵巢、表皮、肠、血液、马氏管、丝腺和头部。亚细胞定位显示BmycaCR蛋白在细胞核和细胞质中均有分布,可能发挥基本的生物学功能,并在靠近质膜区域有强的荧光信号,可能具有与其它蛋白质相互结合的功能。     

鸡TATA结合蛋白的亚细胞定位及基因组织表达特性分析

为探究鸡TATA结合蛋白(TATA-binding protein,TBP)的亚细胞定位以及TBP基因在鸡胚不同发育阶段不同组织中的表达情况,首先扩增鸡TBP基因的蛋白质编码区(CDS),将其亚克隆至真核表达载体pCMV-Myc构建重组真核表达载体pCMV-Myc-TBP,转染人胚胎肾细胞(HEK-293T),然后利用...     

紫花苜蓿MADS-box基因NMH7的亚细胞定位与表达分析

通过构建NMH7基因与绿色荧光蛋白基因融合的植物表达载体GFP- NMH7研究紫花苜蓿基因编码蛋白的亚细胞定位.用基因枪轰击洋葱表皮细胞的方法进行瞬时表达,结果表明:NMH7基因编码蛋白定位于细胞核;半定量RT- PCR分析紫化苜蓿NMH7基因的组织表达特性,结果表明:其在根、花蕾、花、荚果中都有表达,在花中表达量高于其他组织;NMH7基因的表达不受赤霉素诱导,脱落酸和茉莉酸甲酯能抑制其表达.