油酸和亚油酸对山羊乳腺细胞甘油三酯含量及乳脂合成相关基因表达的影响

为探讨外源添加油酸和亚油酸对体外培养的奶山羊乳腺上皮细胞甘油三酯(TG)含量和乳脂肪合成相关基因表达的影响,试验以奶山羊乳腺上皮细胞为研究对象,分别用0、50、100、200μmol/L油酸和0、20、40、80μmol/L的亚油酸处理细胞24h,检测细胞内TG的含量;采用实时荧光定量PCR法检测细胞内乳脂合成相关基因mRNA水平的变化。结果显示,100、200μmol/L的油酸和40、80μmol/L亚油酸均显著促进细胞内TG的合成(P<0.05)。实时荧光定量PCR结果表明,添加100、200μmol/L油酸可显著上调二酰甘油酰基转移酶2(DGAT2)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)及脂肪酸合成酶(FASN)基因的表达(P<0.05),显著抑制硬脂酰辅酶A去饱和酶1(SCD1)基因的表达(P<0.05),而对过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因的表达无显著影响(P>0.05)。添加20μmol/L亚油酸可显著抑制ACC和FASN基因的表达(P<0.05);亚油酸浓度为40和80μmol/L时可显著上调DGAT2基因的表达(P<0.05),抑制SCD1和SREBP1基因的表达(P<0.05),对ACC、FASN和PPARγ基因表达均无显著影响(P>0.05)。综上所述,100～200μmol/L油酸和40～80μmol/L亚油酸对奶山羊乳腺上皮细胞乳脂肪合成具有较好的促进效果。     

油酸对奶牛乳腺上皮细胞内甘油三酯含量和乳脂肪合成相关基因表达的影响

本试验旨在探讨油酸对奶牛乳腺上皮细胞内甘油三酯含量和乳脂肪合成相关基因表达的影响。选取中国荷斯坦奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)为试验材料,经纯化培养后,培养基中添加0(对照)、50、100、200、400μmol/L油酸,继续培养24 h。通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞活力;利用试剂盒检测胞内甘油三酯的含量;采用实时定量PCR法检测乳脂肪合成相关基因的表达。结果表明:油酸浓度为200、400μmol/L时,BMECs相对增殖率显著低于对照组与其他试验组(P0.05);添加100、200μmol/L的油酸促进了胞内甘油三酯的合成(P0.05);添加油酸上调了二酰甘油酰基转移酶(DGAT)基因表达量,50μmol/L的油酸显著上调了乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARGγ)基因表达量(P0.05),100~400μmol/L的油酸显著抑制了硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)、脂肪酸结合蛋白3(FABP3)、固醇调节原件结合蛋白1(SREBP-1)基因表达量。综上所述,50~100μmol/L的油酸对BMECs乳脂肪合成具有较好的促进效果。     

干扰CREB基因对奶山羊乳腺上皮细胞脂质合成相关基因表达及甘油三酯合成的影响

旨在筛选奶山羊cAMP应答元件结合蛋白CREB(cAMP response element binding protein)基因的siRNA,揭示干扰该基因后对乳腺上皮细胞中乳脂合成相关基因表达及甘油三酯合成的影响。本研究通过qRT-PCR方法从西农萨能奶山羊乳腺组织中扩增CREB基因完整的CDS区,进行序列分析和不同泌乳时期表达水平分析,合成靶向CREB基因的siRNA,利用荧光定量PCR筛选有效siRNA,并检测脂质合成相关基因的表达,采用试剂盒检测细胞内甘油三酯含量。结果表明:1)克隆得到全长为984 bp的奶山羊CREB基因的CDS区(GenBank登录号:MK158073),并对其进行生物信息学分析。2)该基因在奶山羊泌乳盛期乳腺组织的表达量为干奶期的1.93倍(P0.05)。3)成功筛选到靶向CREB基因的有效siRNA,干扰效率为72%(P0.01);并将其在奶山羊乳腺上皮细胞进行转染,通过qRT-PCR检测脂质合成相关基因的表达,与对照组相比,干扰CREB基因后显著抑制了FASN、ACACA、SCD1、FABP3、LPL、CPT1B、GPAM和DGAT2基因表达量(P0.05),并显著增加了HSL基因表达量(P0.05);且细胞内甘油三酯含量被显著下调(P0.05)。综上所述,CREB基因在奶山羊原代乳腺上皮细胞中很可能通过调控脂质代谢相关基因的表达及甘油三酯含量对山羊的乳脂合成过程发挥重要作用。     

SIRT1/FoxO1通路对奶山羊乳腺上皮细胞脂质合成的影响

为研究SIRT1/FoxO1通路在奶山羊乳腺脂质合成中的作用,本实验采用0(对照)、50、100、150μmol/L的SIRT1激动剂(RES)处理奶山羊乳腺上皮细胞,qRT-PCR检测脂质代谢相关基因的表达,检测细胞中甘油三酯含量,油红O染色法观察脂滴的积累情况。结果表明:100μmol/L RES处理组的SIRT1和FoxO1基因的相对mRNA表达量高于对照组(P<0.05),乳脂关键调控因子SREBP1和PPARγ表达量下降(P<0.05);SIRT1/FoxO1通路激活后,脂肪酸合酶FASN(P<0.01)、脂肪酸去饱和酶SCD1(P<0.01)和脂肪酸转运酶CD36(P<0.05)表达量均下降;而脂解相关基因HSL和ATGL的表达上调(P<0.05)。SIRT1/FoxO1激活后,细胞中甘油三酯含量显著降低(P<0.05),脂滴积累减少。综上可知,SIRT1/FoxO1通路负调控奶山羊乳腺上皮细胞脂质合成,为改善羊奶营养价值和风味提供基础资料。     

雌激素对奶山羊乳腺上皮细胞脂肪酸合成酶(FASN)基因表达和脂肪酸含量的影响

为了研究不同处理浓度的17β-雌二醇对奶山羊乳腺上皮细胞脂肪酸合成酶(FASN)基因表达和细胞中脂肪酸含量的影响,分别添加0、25、100、250和500μmol/L 17β-雌二醇处理原代培养的奶山羊乳腺上皮细胞。采用实时荧光定量PCR检测细胞中FASN基因mRNA的表达,并用气相色谱仪测定奶山羊乳腺上皮细胞中的脂肪酸成分。结果:25μmol/L 17β-雌二醇可促进FASN基因表达(P0.05),辛酸和癸酸的百分含量显著增加,棕榈酸和硬脂酸的百分含量下降;100μmol/L 17β-雌二醇抑制FASN基因表达(P0.05),辛酸和癸酸的百分含量增加,亚麻酸含量降低,其他脂肪酸含量变化不显著;250μmol/L极显著促进FASN基因表达,辛酸、癸酸和月桂酸的百分含量显著增加,豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和花生酸的含量显著减少;500μmol/L 17β-雌二醇极显著促进FASN基因表达,辛酸、癸酸、月桂酸和棕榈酸的百分含量显著增加,豆蔻酸、硬脂酸和花生酸的含量显著下降。     

脂肪酸对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白和乳脂合成相关基因表达量的影响

本试验旨在探寻促进奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)乳蛋白和乳脂合成的短链脂肪酸(乙酸、β-羟丁酸)和长链脂肪酸(油酸、亚油酸、亚麻酸)的组合添加模式,为调控乳成分合成提供理论依据。BMECs经分离、纯化后,选取第2代细胞,分为5组,对照组不添加脂肪酸,Ⅰ组和Ⅱ组添加的乙酸、β-羟丁酸浓度比例均为2.0(9.60 mmol/L)∶1.0(4.80 mmol/L),油酸、亚油酸、亚麻酸的浓度比例分别为2.0(17.30μmol/L)∶13.3(115.05μmol/L)∶1.0(8.65μmol/L)和9.6(75.20μmol/L)∶7.4(58.00μmol/L)∶1.0(7.80μmol/L);Ⅲ组和Ⅳ组添加的乙酸、β-羟丁酸的浓度比例均为1.0(7.20 mmol/L)∶1.0(7.20 mmol/L),油酸、亚油酸、亚麻酸的浓度比例分别为2.0∶13.3∶1.0和9.6∶7.4∶1.0,各组添加的短链脂肪酸(SCFA)和长链脂肪酸(LCFA)总浓度为14.541 mmol/L,每组3个重复。培养24 h后,检测细胞相对增殖率(RGR)、甘油三酯(TAG)的合成量以及乳蛋白和乳脂合成相关基因的表达量。结果表明:1)试验组BMECs RGR及TAG的合成量均显著高于对照组(P0.05);Ⅰ组RGR最高,TAG合成量最多。2)与对照组相比,Ⅱ组显著提高了核糖体蛋白S6激酶1(S6K1)、κ-酪蛋白(CSN3)基因的表达量(P0.05);Ⅳ组显著提高了CSN3、蛋白激酶B(AKT)、S6K1、真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)基因的表达量(P0.05);试验组信号转导和转录激活因子5(STAT5)基因的表达量显著降低(P0.05)。3)与对照组相比,试验组二酰甘油酰基转移酶2(DG AT2)基因的表达量显著提高(P0.05),脂肪酸合成酶(FASN)基因的表达量显著降低(P0.05)。综上所述,在培养液中添加7.20 mmol/L乙酸、7.20 mmol/Lβ-羟丁酸、75.20μmol/L油酸、58.00μmol/L亚油酸、7.80μmol/L亚麻酸对BM ECs乳蛋白和乳脂合成相关基因的表达量有较好的促进作用。     

茶皂素对奶牛乳腺上皮细胞增殖及乳脂合成关键酶的影响

本试验旨在研究茶皂素对乳腺上皮细胞增殖、乳脂合成关键酶的影响。采用酶消化法分离获取乳腺上皮细胞,经免疫荧光鉴定后,分别添加不同浓度[0(对照)、0.05、0.25、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00、40.00、60.00、80.00、100.00μg/mL]的茶皂素溶液培养,然后进行如下操作:1)采用噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度的茶皂素对乳腺上皮细胞增殖的影响;2)采用酶联免疫分析(ELISA)试剂盒测定细胞中乙酰辅酶A羧化酶(ACACA)、脂肪酸合成酶(FASN)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)的含量;3)采用实时荧光定量PCR的方法测定FASN、ACACA、SCD基因mRNA相对表达水平。结果显示:1)茶皂素浓度为0.05~20.00μg/mL对细胞增殖无显著影响(P0.05),浓度为20.00~100.00μg/mL时显著抑制细胞增殖(P0.05);2)细胞FASN、ACACA、SCD的含量在对照组和0.50、5.00、20.00μg/mL浓度组间无显著差异(P0.05);3)细胞与茶皂素共育24、48h后,与对照组相比,0.50、5.00、20.00μg/mL浓度组SCD基因mRNA相对表达水平显著降低(P0.05)。综合以上,茶皂素对奶牛乳腺上皮细胞增殖及乳脂合成关键酶SCD基因mRNA表达具有一定抑制作用。     

苜蓿黄酮对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白、乳脂和乳糖合成的影响

本试验旨在研究苜蓿黄酮对体外培养奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白、乳脂和乳糖合成相关基因表达的影响。将乳腺上皮细胞分成5组,每组培养基中分别含有0、25、50、75、100μg/m L苜蓿黄酮,细胞在37℃,5%CO2培养箱中培养72 h,然后检测相关基因的表达。结果表明:添加苜蓿黄酮具有降低乳腺上皮细胞的m TOR相对表达量的趋势(P=0.09),25μg/m L组的S6K1和e IF4E相对表达量显著低于50μg/m L组(P0.05),而对氨基酸转运蛋白无影响;苜蓿黄酮具有降低FATP1相对表达量的趋势(P=0.06),50μg/m L组PPAR-γ、SCD1和FASN相对表达量最高均显著高于0μg/m L(P0.05)组;50μg/m L组的Glut1和Glut4相对表达量显著高于25μg/m L组(P0.05),0μg/m L组的Glut8相对表达量显著低于50~100μg/m L组(P0.05),而β-1,4-Gal T相对表达量显著高于其他各组(P0.05),25μg/m L组的HK2相对表达量显著低于0μg/m L组(P0.05)。结果提示,苜蓿黄酮能够调节乳蛋白、乳脂和乳糖的合成。     

bta-miR-29d-3p对奶牛乳腺上皮细胞乳脂代谢相关基因表达及甘油三酯含量的影响

为探索bta-miR-29d-3p与奶牛乳腺上皮细胞乳脂代谢相关基因表达及甘油三酯含量之间的调控关系，试验设计并合成bta-miR-29d-3p的模拟物和抑制物，通过瞬时转染技术将bta-miR-29d-3p的模拟物和抑制物转染到奶牛乳腺上皮细胞中，利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测bta-miR-29d-3p抑制或过表达后奶牛乳腺上皮细胞乳脂合成相关基因表达水平的变化，细胞内甘油三酯含量用试剂盒检测。结果显示：bta-miR-29d-3p过表达后甘油三酯合成相关基因二酰甘油酰基转移酶（DGAT1）、线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAM），脂肪酸合成相关基因乙酰辅酶A羧化酶A(ACACA)、脂肪酸合成酶（FASN），转录因子固醇调节元件结合蛋白1(SREBF1)的表达量显著降低（P <0.01），肝X受体Α（LXRA）表达量显著上升（P <0.01）。同时过表达bta-miR-29d-3p奶牛乳腺上皮细胞中甘油三酯含量显著降低（P <0.05）。干扰bta-miR-29d-3p显著增加了DGAT1、ACACA、FASN、GPAM、转录因子过氧化物酶体...     

染料木黄酮对3T3-L1细胞增殖与分化的影响

试验旨在研究染料木黄酮对3T3-L1细胞增殖与分化的影响以及对分化过程中相关基因表达的影响。以浓度为0、10、50、100、200μmol/L的染料木黄酮处理细胞,测定不同天数3T3-L1细胞相对增殖量、细胞合成脂肪量以及第8天与脂肪合成有关的基因PPARγ、FASN、LPL、ACC、HSL的相对表达量。结果表明：在增殖方面,染料木黄酮能显著抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖（P〈0.05）。随着染料木黄酮浓度的增加,细胞增殖的抑制作用越强。当浓度为200μmol/L时,细胞停止增殖。在分化方面,染料木黄酮能显著减少3T3-L1前脂肪细胞分化合成脂肪的量（P〈0.05）。随着染料木黄酮浓度的增加,细胞分化合成脂肪量减少。染料木黄酮能显著减少3T3-L1细胞与脂肪合成有关的基因PPARγ、FASN、LPL、ACC、HSL的相对表达量（P〈0.05）。在浓度为50μmol/L时,PPARγ基因相对表达量最低;在浓度为200μmol/L时,FASN基因相对表达量最低;在浓度为10μmol/L时,LPL基因相对表达量最低;在浓度为200μmol/L时,ACC基因相对表达量最低;在浓度为10μmol/L时,HSL基因相对表达量最低。分析推测,染料木黄酮通过抑制与脂肪合成相关基因的表达来减少脂肪合成量。     

山羊INSIG1基因超表达对乳腺上皮细胞中脂质合成的影响

本研究旨在通过构建西农萨能奶山羊胰岛素诱导基因1(INSIG1)的重组腺病毒(Adenovirus,Ad)超表达载体,研究该基因超表达后对乳腺上皮细胞中脂质合成的影响,从而为该基因在山羊乳腺脂质合成调控中的功能研究奠定基础。根据GenBank(登录号:JQ665439)中山羊INSIG1基因序列设计引物,PCR扩增得到其CDS区序列。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV后获得pAdTrack-CMV-INSIG1质粒,将该质粒PmeⅠ线性化后转入大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行同源重组,获得pAdEasy-INSIG1重组腺病毒超表达载体。该重组质粒经PacⅠ线性化后转染293A细胞进行病毒的包装及扩繁,利用LaSRT法测定其滴度。将获得的重组腺病毒AdINSIG1感染山羊原代乳腺上皮细胞,利用实时荧光定量PCR检测INSIG1及脂质合成相关基因的mRNA表达情况,利用GPO-Trinder酶学反应检测细胞中甘油三酯的含量。结果表明,成功构建了奶山羊INSIG1基因重组腺病毒超表达载体,获得了具有较高滴度(2×108 U·mL-1)的超表达腺病毒Ad-INSIG1;Ad-INSIG1感染山羊原代乳腺上皮细胞48h后,与Ad-GFP组相比,INSIG1基因的mRNA表达量上调约500倍,固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)和SREBP裂解活化蛋白(SCAP)的mRNA表达量无明显变化,参与脂肪酸从头合成(ACCα、FASN)及去饱和(SCD1)基因的mRNA表达量均显著下降(P0.05);参与甘油三酯合成的3个关键基因中,GPAM及DGAT2的mRNA表达量显著下降(P0.05),AGPAT6的表达无显著变化;同时,催化甘油三酯分解(ATGL)的基因mRNA表达量也显著下降(P0.05);细胞内甘油三酯含量无显著变化。综上所述,在山羊原代乳腺上皮细胞中,INSIG1能够抑制脂质合成相关基因的表达,对山羊乳腺脂质合成具有调控作用。     

CLA对奶牛乳腺上皮细胞脂肪酸合成相关酶的影响

为了研究体外添加c9,t11共轭亚油酸(CLA)和t10,c12 CLA对奶牛乳腺细胞(BMECs)中脂肪酸(FA)合成关键酶基因mRNA转录和SCD酶指数的影响,试验采用组织块分离培养BMECs,两种CLA浓度分别为0,50,100,150μmol/L,作用细胞24 h后采用荧光定量PCR(QRT-PCR)对目的基因进行相对定量。结果表明:与对照组相比,50μmol/L c9,t11 CLA显著抑制BMECs中的ACC、FAS、D5和D6基因mRNA,但150μmol/L却显著促进;50μmol/L t10,c12 CLA显著上调了ACC、SCD5、D5和D6基因的mRNA转录水平,对FAS转录无影响(P>0.05),但150μmol/L显著受到抑制;CLA均抑制SCD1的转录,促进SCD5转录。C9,t11 CLA使SCD酶指数显著增加,t10,c12 CLA则相反。     

干扰PTEN基因对奶山羊乳腺上皮细胞脂质合成相关基因的转录及脂肪酸组成的影响

旨在通过RNA干扰技术揭示蛋白酪氨酸磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)基因在奶山羊乳腺上皮细胞中对乳脂合成及脂肪酸组成的影响。利用RT-PCR方法扩增到西农萨能奶山羊乳腺组织中PTEN基因(GenBank登录号:MK158074.1)的CDS区,进行序列分析和不同泌乳时期差异转录分析。合成靶向该基因的siRNA,由RT-qPCR结果筛选出有效siRNA,将其转染至奶山羊的乳腺上皮细胞,进一步检测干扰该基因后对脂质合成相关基因转录水平及脂肪酸组成的影响。结果表明:本研究首次克隆到奶山羊(Capra hircus)PTEN基因的CDS区,全长为1 212 bp;经序列比对发现,山羊的PTEN基因核苷酸序列同牛(Bos taurus)、猪(Sus scrofa)和人(Homo sapiens)的相似度分别为99%、98%和97%,编码氨基酸序列相似性均在99%以上;蛋白质结构预测发现:其蛋白不存在跨膜结构域,亚细胞定位于细胞质中,N端具有保守的磷酸酶功能区;该基因在奶山羊泌乳盛期乳腺组织中的转录量较干奶期下降51.5%;合成的siRNA转染至乳腺上皮细胞后,成功筛选出理想的siRNA,干扰效率达到94%(P0.01);与对照组相比,干扰PTEN基因后显著上调SREBP1、FASN、ACACA、SCD1基因转录量(P0.01或P0.05),显著下调LPL、FABP3、ACOX1、CPT1B、GPAM、DGAT2和HSL基因转录量(P0.01或P0.05)。脂肪酸检测分析发现:干扰该基因能够显著上调C16:1的去饱和指数(P0.05),但对C18:1的去饱和指数没有显著影响。综上所述,PTEN基因能够调控乳腺上皮细胞中脂质合成相关基因的转录及脂肪酸组成,在奶山羊乳脂代谢中发挥重要作用。     

miR-200a对奶山羊乳腺上皮细胞乳脂合成相关基因mRNA表达的影响

旨在构建pAd-pri-miR-200a重组腺病毒,使其在奶山羊乳腺上皮细胞中稳定表达miR-200a,研究miR-200a对乳脂合成相关基因mRNA表达的影响。以西农萨能羊DNA为模板扩增pri-miR-200a。采用Ad-Easy系统构建重组腺病毒载体pAd-pri-miR-200a,并于HEK 293细胞株中进行病毒的包装、扩繁。TCI50法测定病毒滴度。qRT-PCR检测miR-200a及16个乳脂合成相关基因mRNA表达水平。序列分析结果显示,pri-miR-200a包括pre-miR-200a86bp和侧翼序列共297bp。酶切结果证实pAd-pri-miR-200a构建成功。Ad-pri-miR-200a滴度达8×109 PFU.mL-1。实时定量结果表明,Ad-pri-miR-200a(MOI为200)感染奶山羊乳腺上皮细胞72h,miR-200a的表达量较对照高出2.4倍。同时miR-200a的过表达引起10个基因mRNA表达量下调,6个基因mRNA表达量上调。其中脂肪酸从头合成相关基因FASN、脂滴生成相关基因TIP47及脂肪酸运输相关基因FABP4降幅较大,分别下降了0.47、0.89及0.65倍。而TAG生成相关基因DGAT1和脂解相关基因HSL较对照分别增加了0.52和1.49倍。本研究获得的重组腺病毒Ad-pri-miR-200a能在山羊乳腺上皮细胞中稳定表达miR-200a,同时miR-200a过表达影响乳脂合成相关基因mRNA表达水平。     

与脐带间充质干细胞共培养对乳腺上皮细胞乳脂合成及关键基因表达的影响

旨在探究奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)与脐带间充质干细胞(UC-MSCs)共培养对(BMECs)乳脂合成及关键基因表达的影响。试验共分为8组:共培养组为UC-MSCs和BMECs共培养条件下的不处理组、IGF-1R抑制剂AG1024处理组、Janus激酶和转录活化因子(JAK/STAT)信号通路信号阻断剂AG490处理组及AG1024+AG490处理组,对照组为BMECs单培养条件下的不处理组、IGF-1R抑制剂AG1024组、Janus激酶和转录活化因子(JAK/STAT)信号通路信号阻断剂AG490组及AG1024+AG490处理组。检测各组上清IGF-1、甘油三酯(TG)含量变化;RT-qPCR检测乙酰辅酶A羧化酶(ACACA),脂肪酸合成酶(FASN)和固醇调节元件结合蛋白(Sterol regulatory element binding proteins,SREBP1)基因的相对表达丰度。结果表明,共培养组IGF-1、TG含量均显著高于对照组(P0.05);AG1024处理对IGF-1具有极显著抑制效果(P0.01),显著降低TG含量及ACACA、FASN、SREBP1mRNA相对表达丰度(P0.05);AG490处理对ACACA、FASN、SREBP1mRNA的表达无显著影响(P0.05);AG1024和AG490共同处理较AG1024单独处理各项指标表现差异不显著(P0.05)。综上表明,脐带间充质干细胞能够通过IGF-1促进乳腺上皮细胞乳脂合成及关键基因的表达,JAK2/STAT5信号通路不参与脐带间充质干细胞对乳腺上皮细胞乳脂调控。     

亮氨酸对奶牛乳腺上皮细胞内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响

本试验旨在研究亮氨酸(Leu)对泌乳奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳脂合成相关基因和蛋白表达的影响,以探讨Leu对乳脂合成的影响机理。将第3代BMECs随机分为6个处理,每个处理6个重复。6个处理培养液中Leu浓度分别为0.45、0.90、1.80、2.70、3.60和7.20 mmol/L,37℃、5%CO2培养48 h后测定BMECs内甘油三酯(TG)的含量及乳脂合成相关基因和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)与固醇调节元件结合蛋白(SREBP1)蛋白的相对表达量。结果显示:Leu浓度对BMECs内TG含量无显著影响(P0.05)。适宜浓度的Leu显著促进脂肪酸合成酶(FASN)和乙酰辅酶A羧化酶A(ACACA)基因的表达(P0.05),FASN基因的相对表达量以1.80~2.70 mmol/L Leu处理、ACACA基因的相对表达量以1.80~7.20 mmol/L Leu处理较高。Leu浓度显著影响BMECs内SREBP1基因及蛋白表达(P0.05),以1.80 mmol/L Leu的促进效果最好。虽然Leu显著抑制BMECs内脂肪酸结合蛋白3(FABP3)、脂蛋白脂酶(LPL)、乙酰甘油磷酸脂酰转移酶6(AGPAT6)、线粒体甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAM)和嗜乳脂蛋白亚家族1成员1(BTN1A1)基因的表达(P0.05),但只有高浓度(3.60~7.20 mmol/L)的Leu抑制作用较大。综合来看,Leu浓度影响BMECs乳脂合成相关基因及PPARγ和SREBP1蛋白的表达。Leu浓度为1.80~2.70 mmol/L时,对脂肪酸从头合成相关基因及调控因子SREBP1蛋白表达的促进效果较好,对TG合成及脂滴形成相关基因表达的抑制作用较小。     

干扰CREB基因对奶山羊乳腺上皮细胞脂质合成相关基因表达及甘油三酯合成的影响

旨在筛选奶山羊cAMP应答元件结合蛋白CREB（cAMP response element binding protein）基因的siRNA,揭示干扰该基因后对乳腺上皮细胞中乳脂合成相关基因表达及甘油三酯合成的影响。本研究通过qRT-PCR方法从西农萨能奶山羊乳腺组织中扩增CREB基因完整的CDS区,进行序列分析和不同泌乳时期表达水平分析,合成靶向CREB基因的siRNA,利用荧光定量PCR筛选有效siRNA,并检测脂质合成相关基因的表达,采用试剂盒检测细胞内甘油三酯含量。结果表明：1）克隆得到全长为984 bp的奶山羊CREB基因的CDS区（GenBank登录号：MK158073）,并对其进行生物信息学分析。2）该基因在奶山羊泌乳盛期乳腺组织的表达量为干奶期的1.93倍（P<0.05）。3）成功筛选到靶向CREB基因的有效siRNA,干扰效率为72%（P<0.01）;并将其在奶山羊乳腺上皮细胞进行转染,通过qRT-PCR检测脂质合成相关基因的表达,与对照组相比,干扰CREB基因后显著抑制了FASN、ACACA、SCD1、FABP3、LPL、CPT1B、GPAM和DGAT2基因表达量（P<0.05）,并显著增加了HSL基因表达量（P<0.05）;且细胞内甘油三酯含量被显著下调（P<0.05）。综上所述,CREB基因在奶山羊原代乳腺上皮细胞中很可能通过调控脂质代谢相关基因的表达及甘油三酯含量对山羊的乳脂合成过程发挥重要作用。     

不同功能性油脂对乳腺上皮细胞乳脂合成基因表达的影响

通过将不同种类功能性油脂(亚麻籽油、油茶籽油以及菜籽油)添加到乳腺上皮细胞中,研究其对奶牛乳腺上皮细胞中SREBP基因相关信号通路表达的影响。试验选用奶牛乳腺上皮细胞(MAC-T)进行体外培养,然后在分化培养基中分别添加相同浓度的不同功能性油脂,利用实时荧光定量PCR方法检测其对甘油三酯合成基因(LPL、AGPAT3)、活化和转运基因(FASN、ACACA、SCD)表达的影响;检测其对脂肪酸网络调控基因(SREBP1C、PPARγ)表达的影响。结果表明,油茶籽油能促进ACACA、SREBP1C、FASN、AGPAT3以及SCD基因的表达,抑制PPARγ基因的表达;亚麻籽油和菜籽油对乳脂合成的相关基因基本没有促进作用,但是3种不同种类的功能性油脂均可以抑制PPARγ基因的表达。     

催乳激素对山羊脂肪酸合酶基因转录活性的影响

为探讨催乳激素对体外培养的山羊乳腺上皮细胞脂肪酸合酶(fatty acid synthase,FASN)基因转录活性的调控作用,试验分别用不同浓度的胰岛素(insulin,INS)、雌激素(estradiol,E_2)、催乳素(prolactin,PRL)及不同激素组合(INS+PRL、E_2+INS+PRL)处理山羊乳腺上皮细胞24h,提取细胞总RNA,采用实时荧光定量PCR检测催乳激素对FASN基因mRNA表达水平的影响。细胞转染山羊FASN基因启动子报告基因载体,同样用不同浓度的胰岛素、雌激素、催乳素及激素组合处理24h,利用双荧光素酶报告基因系统检测催乳激素对FASN基因启动子活性的影响。结果发现,用雌激素、催乳素处理山羊乳腺上皮细胞后,FASN基因启动子活性及mRNA水平极显著或显著上调(P0.01;P0.05),雌激素浓度为10、100μmol/L和催乳素浓度为0.1和1μg/mL时效果最为明显,而胰岛素对FASN基因的启动子活性及mRNA水平没有显著影响(P0.05)。用不同激素组合(INS+PRL、E_2+INS+PRL)处理细胞均能显著上调FASN基因启动子活性及mRNA表达水平(P0.05)。结果表明,雌激素和催乳素能够调控FASN基因的转录活性,为进一步研究泌乳过程中FASN基因的分子调控机制提供理论依据。     

维生素A对奶牛乳腺上皮细胞乳脂和乳蛋白合成相关基因表达的影响

本试验旨在研究维生素A对奶牛乳腺上皮细胞(BMECs)内乳脂和乳蛋白合成相关基因表达的影响。采用单因素完全随机试验设计,将第3代BMECs随机分为6个处理,每个处理6个重复,使用无血清培养基饥饿24 h后,采用维生素A浓度分别为0(对照)、0.05、0.10、0.20、1.00和2.00μg/m L的培养基培养24 h。结果表明:与对照组相比,1.00、2.00μg/m L维生素A可以显著提高相对增殖率以及甘油三酯(TG)含量(P0.05);维生素A能显著提高乳脂合成相关基因过氧化酶体增殖物激活受体γ(PPARG,0.05、0.10、0.20、1.00和2.00μg/m L)、固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1,0.05、0.10μg/m L)、硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD,0.05、0.10μg/m L)的基因表达量(P0.05);维生素A也能显著提高乳蛋白合成相关基因信号转导转录激活因子5(STAT5,0.20μg/m L)、αs1-酪蛋白(CSN1S1,0.05和0.10μg/m L)、κ-酪蛋白(CSN3,0.10μg/m L)基因表达量(P0.05);维生素A也能显著提高乳脂合成相关酶乙酰辅酶A羧化酶(ACACA)活性(0.05、0.10、0.20和1.00μg/m L)(P0.05)。结果提示,维生素A对BM ECs内乳脂、乳蛋白合成相关基因表达的促进效果呈浓度依赖性,以0.10μg/m L维生素A效果较好。