肺炎克雷伯菌榆中分离株OmpK17基因的克隆、生物信息学分析及免疫原性研究

试验旨在研究肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)外膜蛋白OmpK17基因序列特征及其免疫原性。参照GenBank中肺炎克雷伯菌外膜蛋白OmpK17基因序列(登录号:U52843.1)设计1对特异性引物,应用PCR技术扩增获得了肺炎克雷伯菌榆中分离株(YZ株)OmpK17基因CDS序列,应用相关软件及程序对OmpK17基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列进行生物信息学分析,构建其原核表达载体pET-OmpK17,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了表达。表达产物纯化后免疫新西兰兔制备多抗血清,应用ELISA和Western blotting分析了重组蛋白的免疫原性。结果显示,肺炎克雷伯菌YZ株外膜蛋白OmpK17基因高度保守,其CDS序列全长513 bp,编码170个氨基酸,与GenBank中其他肺炎克雷伯菌OmpK17基因序列同源性均高于99.6%;OmpK17蛋白分子质量约为18.5 ku,具有较强的亲水性,含有1个信号肽、1个跨膜区和6个抗原决定簇区域,是一种具有桶状三维结构的跨膜蛋白。SDS-PAGE结果显示,OmpK17基因在大肠杆菌中获得表达且表达产物主要以包涵体形式存在。ELISA及Western blotting结果表明,肺炎克雷伯菌OmpK17蛋白具有良好的免疫原性。本研究克隆和表达了肺炎克雷伯菌OmpK17基因及其编码蛋白,并证实该蛋白具有良好的免疫原性,为OmpK17基因的生物学特性研究和肺炎克雷伯菌检测方法的建立奠定了基础,为肺炎克雷伯菌基因工程疫苗的研发提供了理论依据。     

貂源肺炎克雷伯菌耐药性、毒力及免疫原性分析

为分析山东地区貂源肺炎克雷伯菌(KPN)分离株的血清型、耐药性、毒力和免疫原性,本研究从临床患有肺炎症状的水貂肺脏组织中采用常规分离培养鉴定方法、16S rRNA PCR方法和分型PCR方法,分离鉴定出10株K2型KPN(QD/Kp1～QD/Kp10),采用109 cfu/mL的QD/Kp8腹腔注射健康易感水貂,进行动...     

肺炎克雷伯菌外膜磷酸孔蛋白PhoE的生物信息学和免疫原性分析

为了探究肺炎克雷伯菌外膜磷酸孔蛋白(PhoE)的生物信息学特征和免疫原性,本试验通过在线服务器MultAlin分析不同肺炎克雷伯菌参考株的PhoE氨基酸序列保守性;通过ProtParam和SOMPA分析该蛋白的理化性质和二级结构;通过SWISS-MODEL进行PhoE同源建模;利用IEDB、DNASTAR软件预测该蛋白的优势B细胞抗原表位;通过质粒构建、重组蛋白表达和纯化获得PhoE重组蛋白,免疫接种小鼠后,应用Western blot和ELISA评价其免疫原性。氨基酸序列分析结果显示,PhoE是一种保守性较强的稳定亲水性蛋白质,其主要位于菌体外膜中;PhoE包含的α-螺旋、β-折叠和无规卷曲构成占比较大;并且其可形成三聚体的稳定桶形结构。经软件预测和筛选,PhoE具有7个优势性B细胞抗原表位,分别是Y⁴³FSDYDSKDGDQT⁵⁵、F⁸¹SGNKTESDSSQK⁹³、Q¹⁷²GKNEGREAKKQNGD¹⁸⁶、S²¹⁰DRTNDQ...     

狂犬病毒河南分离株G基因的克隆与生物信息学分析

狂犬病(狂犬病)是由狂犬病病毒引起的在全球范围内广泛传播的人兽共患病,一旦感染死亡率几乎为100%.RV属于弹状病毒科,狂犬病毒属,其基因组为单股负链RNA病毒,基因组大小约为12kb,基因组从3'-5'方向有5个结构基因,分别编码核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和转录大蛋白(L).其中G蛋白可以结合细胞受体并与细胞融合,同时G蛋白为病毒中和抗体(Virus Neutralization antibody,VNA)的靶蛋白,可以提供抵抗病毒的完全保护力.因此,以G蛋白为研究对象对于狂犬病的防控有重要意义.     

一株湖羊肺炎克雷伯菌的分离与鉴定

从某湖羊养殖场发病死亡的成年湖羊的肾脏中分离到1株革兰阴性短杆菌,形态特征与生化试验结果基本符合肺炎克雷伯氏菌的特征。药物敏感性试验显示,该分离菌株对氨苄西林、哌拉西林、头孢唑啉、头孢哌酮、卡拉霉素、庆大霉素、诺氟沙星、氧氟沙星高敏,而对氟苯尼考、青霉素、苯唑西林、红霉素、四环素、多西环素、万古霉素、复方新诺明等药物具有耐药性。以细菌16S rRNA基因通用引物进行PCR扩增,将所测序列与GenBank中的序列进行BLAST比对,结果其与肺炎克雷伯菌的同源性高达99.9%以上,进一步确定该分离菌株为肺炎克雷伯菌。     

一株猪源肺炎克雷伯氏菌的分离鉴定及耐药性、耐药基因的检测

为了确定发病母猪组织是否感染病原菌及调查病原菌耐药情况,试验对发病母猪组织进行细菌分离培养,经过培养观察、生化试验、16S rRNA测序确定分离菌株,对分离菌株进行药敏试验、小鼠致病性试验、耐药基因检测、常见血清型分型及毒力基因检测。结果表明:分离得到一株肺炎克雷伯氏菌。分离菌株的16S rRNA测序结果与NCBI上18株肺炎克雷伯氏菌参考菌株序列同源性均在99%以上。分离菌株接种在血琼脂培养基上会发生α溶血现象,且具有多重耐药性,携带四环素类tet耐药基因,氨基糖苷类aph(3′)-Ia、strA、strB耐药基因,磺胺类sul 1、sul 2耐药基因及超广谱β-内酰胺酶(ESBL)耐药基因blaSHV,与耐药表型结果一致。分离菌株血清型分型为K20型,含有ureA、wabG、uge毒力基因。在小鼠致病性试验中,以浓度为6.15×10~8cfu/mL的菌液进行攻毒,能够使小鼠在22 h内死亡,表明分离菌株对小鼠具有致病性。说明本试验所分离得到的猪源肺炎克雷伯氏菌具有严重的耐药性和强致病性。     

羊源肺炎克雷伯菌的分离鉴定及毒力基因检测

为了调查内蒙古通辽市某羊场发病羊死亡的原因,对疑似致病菌进行分离、鉴定及部分生物学特性研究.对病死羊进行剖检,无菌条件下采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏等组织脏器进行细菌分离培养;对分离菌进行小鼠致病性试验、细菌生化检测、16S rDNA基因扩增及同源性比对分析和药物纸片扩散法敏感性试验.结果显示,分离菌株符合肺炎克雷伯菌生...     

狐狸源肺炎克雷伯氏菌分离株生物学特征分析

为确定狐狸源肺炎克雷伯氏菌的致病性、耐药性、耐药机制及其生物被膜(BF)形成能力,本研究对分离自病死狐狸的10株肺炎克雷伯氏菌进行形态特征、培养特性、生化试验、16S r RNA鉴定及khe基因鉴定,利用K-B法检测其药敏性,利用PCR方法检测了其耐药基因、荚膜血清型、毒力基因,利用96孔微量板测定BF形成能力并进行了分离菌对小鼠的致病性试验。结果显示,这10株肺炎克雷伯氏菌均对多种常用抗菌药物耐药,均可以引起小鼠发病或死亡,但BF形成能力有明显差异。部分菌株携带floR、mcr-1、TEM等耐药基因和wabG、fimH、uge、rmpA等毒力基因,89F-2、58F-2、60N-1属于K1血清型。本研究结果为狐狸源肺炎克雷伯氏菌病的检测、诊断及防治提供了实验依据。同时,本实验首次从狐狸源肺炎克雷伯氏菌中检测到粘菌素耐药基因mcr-1,这将为黏菌素的临床使用和风险评估提供技术参考。     

6株奶牛乳房炎肺炎克雷伯菌的分离、鉴定及生物学特性

为研究陕西关中地区奶牛乳房炎肺炎克雷伯菌的流行情况,从某规模化奶牛场无菌采集乳样53份,进行细菌分离鉴定。通过细菌形态学观察、生化试验以及16S rRNA序列分析,共分离出6株肺炎克雷伯菌,并对其进行药物敏感性、生物被膜形成、random amplified polymorphic DNA(RAPD)分型以及小鼠致病性的试验。生化特性结果表明6株肺炎克雷伯菌对各种糖的分解能力无明显差异。药敏试验结果表明,6株菌均对恩诺沙星、阿米卡星、环丙沙星、链霉素、庆大霉素、四环素、美罗培南、头孢曲松和头孢他啶敏感,对青霉素和氨苄西林耐药。生物被膜表型检测结果表明,6株菌均可产生生物被膜,其中菌株KP4为中等黏附,其他5株为弱黏附,生物被膜成分中均含有胞外多糖,不含卷曲菌毛和纤维素。RAPD分型结果表明,分离的6株菌株共分3个基因型,其中C型占50.00%(3/6),B型占33.33%(2/6),A型占16.67%(1/6)。小鼠致病性结果表明,分离株对小鼠均具有较强的致病性,被感染小鼠的肝脏、脾脏和肺脏均有不同程度的出血。本试验为防控陕西省内肺炎克雷伯菌引起的奶牛乳房炎提供依据。     

水貂肺炎克雷伯菌的分离鉴定及耐药性分析

【目的】 肺炎克雷伯菌是人畜共患的条件致病菌, 是引起水貂肺炎的常见病原菌之一。试验主要对吉林省某水貂养殖场送检的6只患有肺炎的病死水貂进行细菌分离鉴定及耐药性分析, 为指导临床合理用药提供依据。【方法】 通过分离纯化方法从样品中分离菌株并进行PCR鉴定, 应用多位点序列分型技术(MLST)进行菌株ST分型。通过感染小鼠了解菌株的致病性, PCR检测血清型及毒力基因的携带情况; 运用琼脂稀释法检测分离菌株对18种药物的敏感性, 并通过PCR检测分离菌株耐药基因的携带情况。【结果】 分离得到的6株菌株经PCR鉴定为肺炎克雷伯菌; MLST分析结果表明6株菌株分别有6种ST型, 分别为: ST2594、ST1782、ST2844、ST2330、ST86和ST661。致病性分析结果显示, 6株菌株均可引起小鼠死亡, 共检测出6种毒力基因, 未检测到毒力较强的血清型。药敏试验结果显示, 6株肺炎克雷伯菌对头孢他啶、头孢曲松、亚胺培南、美罗培南、阿米卡星较敏感, 对链霉素、庆大霉素、卡那霉素、青霉素、氨苄西林、环丙沙星、恩诺沙星、左氧氟沙星、多西环素和氟苯尼考较耐药。耐药基因检测结果显示, 6株菌株共检测出bla_SHV、bla_TEM-1、bla_CTX-M-1G、aadA1、aac(3’)-Ⅳ、aac(3’)-Ⅱc、aph(4’)-Ⅰa、aph(3’)-Ⅶ、aph(3’)-Ⅳ、aph(2’)-Ⅰb、rmtB、qnrB、qnrD、qnrS、qepA、oqxAB、floR和mcr-1 18种耐药基因。【结论】 分离到的6株肺炎克雷伯菌株为不同的种系进化, 并具有较强的致病性和耐药性, 为临床用药治疗带来困难。     

西藏部分地区牦牛源肺炎克雷伯菌的分离、鉴定、毒力及耐药基因分析

利用细菌分离纯化、生化鉴定、分子生物学及WHO推荐的K-B纸片法等研究方法,对从西藏不同地区采集的103份牦牛鼻拭子样品进行肺炎克雷伯菌的分离鉴定,对分离鉴定的疑似菌株进一步进行16S rDNA测序及系统发育分析,荚膜血清学分型、毒力基因和耐药表型及耐药基因检测.结果显示,从西藏林芝市、那曲市分离鉴定出8株牦牛源克雷伯...     

27株牛源肺炎克雷伯菌gyrA和parC基因遗传分析

为了解重庆和四川地区牛源肺炎克雷伯菌分离株之间的进化关系,本试验通过PCR方法扩增27株肺炎克雷伯菌gyrA、parC基因并测序,对测序结果进行基因进化分析。结果表明,gyrA、parC基因片段扩增产物大小分别为420,382bp;27株分离株可分成4个大簇,荣昌分离株主要与ha06(中国·江苏)、NCTC11228(荷兰·乌特勒支)等聚类于Ⅰ簇;丰都分离株紧密聚类于Ⅱ簇;Ⅲ簇全为云阳分离株;自贡分离株聚类于Ⅰ、Ⅳ簇。     

奶牛肺炎克雷伯菌的分离鉴定

<正>2014年6月宁夏某奶牛场犊牛出现大量死亡现象,发病牛年龄均为10日龄以内,尤其以4日龄左右犊牛为主。临床表现为躺卧姿势不正常,头部抵于栅栏呆立不动,呼吸频率增加但呼吸浅表,腹式呼吸明显,表现虚弱,继而急速死亡。笔者从送检的1头病死犊牛体内分离到1株具有毒力的肺炎克雷伯菌,本研究对该病原体进行了细菌形态学观察、细菌鉴定、药敏分析和人工感染等试验,现将试验方法和研     

鸡肺炎克雷伯菌的分离鉴定

肺炎克雷伯菌属肠杆菌科,克雷伯菌属,含3个亚种[1],对动物均有一定致病性. 肺炎克雷伯菌可感染多种动物发病,对鸡也有一定致病性,但对宝万斯鸡的致病性尚未见报道.重庆市长寿海棠镇某鸡场120日龄宝万斯鸡感染死亡率2.3%.58日龄有10%左右出现吃食减少、精神差等病症.     

牛支原体新疆分离株P48基因的克隆、原核表达及重组蛋白免疫原性研究

试验旨在确定牛支原体P48基因的免疫原性,为进一步筛选牛支原体免疫保护性基因奠定基础。本研究以牛支原体新疆分离株为研究对象,运用Overlap PCR方法扩增得到点突变后的牛支原体新疆分离株P48基因,构建原核表达载体pET-32a(+)-P48,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,在诱导剂ITPG的诱导下获得重组蛋白P48,纯化后的重组P48蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,运用Western blotting和ELISA方法验证其反应原性和免疫原性。结果表明,试验成功构建原核表达载体pET-32a(+)-P48,重组蛋白P48大小约为66ku,纯化后的牛支原体P48重组蛋白免疫小鼠后可产生良好的免疫反应,血清抗体滴度达到较高水平(D450nm值为1.126)。Western blotting结果显示,抗牛支原体P48重组蛋白的鼠血清与牛支原体P48重组蛋白及牛支原体全菌蛋白抗原均能产生明显的抗原抗体反应,表明P48重组蛋白具有良好的免疫原性与反应原性,可作为牛支原体新型疫苗的候选基因,且牛支原体新疆分离株P48基因与国内外5株牛支原体P48基因的同源性很高,亲缘关系较近。     

肉牛上呼吸道肺炎克雷伯菌的分离鉴定及耐药分析

为研究重庆地区规模化肉牛场肉牛上呼吸道中肺炎克雷菌的带菌状况及耐药性。本研究从重庆荣昌、丰都两地肉牛上呼吸道分离细菌,采用形态学观察、生化鉴定及16SrRNA分子方法鉴定,获得12株肺炎克雷伯菌,分离率为19.7%,表明肺炎克雷伯菌是肉牛上呼吸道中主要的一种条件致病菌;分离菌株对庆大霉素,丁胺卡那霉素,头孢他啶,妥布霉素等药物敏感,对乙酰螺旋霉素,氨苄西林,苯唑西林耐药率达到100%,分离株存在多重耐药,但两个地区的分离株在耐药性上存在一定差异。     

沧州地区猪源肺炎克雷伯菌分离菌株、耐药性及耐药基因检测

为了分析沧州地区猪源肺炎克雷伯菌耐药性及耐药基因流行情况,试验采用细菌学常规的分离鉴定方法和16S rRNA PCR法,从沧州地区不同养殖场中采集患呼吸道疾病猪肺脏、肝脏、鼻拭子等病料组织123份,分离得到了45株致病性肺炎克雷伯菌。采用K-B药敏纸片法和PCR法分别检测45株致病性肺炎克雷伯菌的耐药性及耐药基因流行情况。结果显示,45株致病性肺炎克雷伯菌分离菌株对阿莫西林、氨苄西林、氟苯尼考等9种药物耐药性较高,耐药率在55.6%以上;对其他药物耐药率在13.3%～22.2%;分离菌株呈现多重耐药现象,耐11、10种药物分离菌株最多,分别占分离菌株的24.4%、28.9%;bla_(TEM)、ant(3″)-Ⅰa、aph(3′)-Ⅱa、sul2、sul3五种耐药基因检出率较高,检出率在80.0%以上;bla_(SHV)、floR、qnrA三种耐药基因检出率在37.8%～46.7%;bla_(CTX-M)、mcr-1、qnrS、rmtB四种耐药基因未检出。说明该地区分离的45株致病性肺炎克雷伯菌耐药性严重,呈现多重耐药现象,携带耐药基因复杂。     

牛支原体新疆分离株P48基因的克隆、原核表达及重组蛋白免疫原性研究

试验旨在确定牛支原体P48基因的免疫原性,为进一步筛选牛支原体免疫保护性基因奠定基础。本研究以牛支原体新疆分离株为研究对象,运用Overlap PCR方法扩增得到点突变后的牛支原体新疆分离株P48基因,构建原核表达载体pET-32a （+）-P48,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,在诱导剂ITPG的诱导下获得重组蛋白P48,纯化后的重组P48蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,运用Western blotting和ELISA方法验证其反应原性和免疫原性。结果表明,试验成功构建原核表达载体pET-32a （+）-P48,重组蛋白P48大小约为66 ku,纯化后的牛支原体P48重组蛋白免疫小鼠后可产生良好的免疫反应,血清抗体滴度达到较高水平（D_{450 nm}值为1.126）。Western blotting结果显示,抗牛支原体P48重组蛋白的鼠血清与牛支原体P48重组蛋白及牛支原体全菌蛋白抗原均能产生明显的抗原抗体反应,表明P48重组蛋白具有良好的免疫原性与反应原性,可作为牛支原体新型疫苗的候选基因,且牛支原体新疆分离株P48基因与国内外5株牛支原体P48基因的同源性很高,亲缘关系较近。     

动物源肺炎克雷伯菌毒力基因及生物膜研究

为了解动物源肺炎克雷伯菌(KP)毒力基因分布和生物膜形成能力,本研究收集了67株不同动物源KP,采用PCR方法扩增8种毒力基因,采用结晶紫染色法检测这些菌株的生物膜形成能力。结果显示ureA、fimH、wabG和uge 4种毒力基因普遍存在于KP中,检出率分别为97.01%、92.54%、86.57%和82.09%;mag A、rmpA和iroNB基因的检出率较低,分别为17.91%、23.88%和26.87%。鸡源菌株和猪源菌株生物膜形成能力强于犬源菌株和兔源菌株,二者差异显著,但鸡源菌株与猪源菌株、兔源菌株与犬源菌株之间无明显差异。本研究表明KP生物膜形成能力与携带毒力基因种类有关。     

1株雏鸡致病性肺炎克雷伯菌分离鉴定与系统进化发育分析

为了确定引起雏鸡死亡的病原菌,从发病致死的雏鸡体内分离1株病菌,采用细菌常规的分离鉴定、16S rRNA基因测序、致病性试验、K-B药敏纸片法等分别对分离菌株进行鉴定、致病性及耐药性检测。结果显示,分离株鉴定为致病性肺炎克雷伯菌;其16S rRNA基因序列与GenBank登录的12株肺炎克雷伯菌参考株同源性在98%～99%之间,与肺炎克雷伯菌参考株KP262416.1聚于一支,与KJ803938.1聚于一大支,且与2株参考株存在密切的遗传进化关系;该菌株对头孢曲松、头孢克肟、恩诺沙星等4种药物敏感;对环丙沙星、新霉素、丁胺卡那霉素等6种药物中敏;对氨苄西林、阿莫西林、青霉素等6种药物耐药。