成都市猫泛白细胞减少症病毒、星状病毒和肠道冠状病毒的分子流行病学调查

为了解成都市区猫泛白细胞减少症病毒(FPV)、猫星状病毒(FAstV)和猫肠道冠状病毒(FECoV)的分子流行情况,本试验采集了315份家养猫和34份社区流浪猫的肛门拭子,含228份临床发病猫样本和121份临床健康猫样本,采用PCR方法对所有样本进行病毒核酸检测。同时,根据动物年龄、生活状态和免疫情况等因素进行病原流行分析,并根据病毒基因片段序列构建遗传进化树。结果显示,FPV、FAstV和FECoV的检出率分别为38.4%(134/349)、23.2%(81/349)和19.5%(68/349)。在混合感染方面,以FPV/FAstV(9.5%,33/349)、FAstV/FECoV(4.6%,16/349)和FPV/FECoV(4.3%,15/349)双重感染为主。基于部分基因序列的分析结果显示,样本间FPV VP2基因序列的同源性为95.1%～100%,发病猫毒株分为两个分支,其中一支与葡萄牙毒株(GenBank登录号:KT240136)和加拿大毒株(GenBank登录号:MF069445)遗传关系较近;另一支与中国的CPV毒株(GenBank登录号:KY937664)关系较近。样本间FAstV ORF1b基因序列同源性为90.9%～99.7%,发病猫的毒株的两个分支中一支与葡萄牙毒株(GenBank登录号:KF374704)和美国毒株(GenBank登录号:KM017743)关系较近;另一分支与中国香港毒株(GenBank登录号:KF499111)关系紧密。样本间FECoV的N基因序列同源性范围为89.3%～100%,与美国毒株(GenBank登录号:FJ938059)、意大利毒株(GenBank登录号:GU017092/GU017107)和中国毒株(GenBank登录号:KT852997)关系密切。调查结果表明,成都市区猫携带病毒性腹泻病原的情况较为普遍,部分猫存在多病原混合感染,且病毒基因序列存在明显变异,增加了病原流行及带毒猫发病的风险,需积极地进行临床防控。     

猫细小病毒的分离与鉴定

为丰富猫细小病毒(FPV)流行病学资料和制备灭活疫苗,通过猫肾传代细胞(F81)培养方法从疑似感染FPV病猫粪便中分离病毒.对分离到的病毒进行理化性质分析和FPV特异性检测引物PCR鉴定,然后对FPV的VP2基因进行扩增测序.理化性质分析结果与FPV特性均相符,VP2基因测序结果与GenBank已发表的FPV标准株VP2基因序列对比分析,核苷酸序列同源性达到99.0％,证明该分离毒株为猫细小病毒.该毒株的成功分离进一步充实了我国FPV病毒库,也为灭活疫苗的制备奠定了基础.     

猫细小病毒CC-1株NS1全基因的克隆及序列分析

根据GenBank中收录的猫细小病毒(FPV)CU-4株基因序列设计引物,扩增本实验室分离保存的FPV CC-1株NS1基因,并进行序列测定。结果表明,该毒株NS1基因序列长度约为2.35 kb,该基因的阅读框总长为2007 bp,编码668个氨基酸。该序列与FPV193/70株、PLI-IV株、TU-2株、CU-4株、94-1株和X J-1株的NS1基因比较,核苷酸的同源性分别为99.0%、98.9%、98.8%、98.7%、98.6%、99.4%,氨基酸的同源性分别为98.8%、98.7%、98.5%、98.7%、98.5%、99.3%。该毒株与犬细小病毒(CPV)、貂细小病毒(MEM)、大鼠细小病毒(RPV)、猪细小病毒(PPV)、鹅细小病毒(GPV)、鼠细小病毒(MVM)NS1的进化树分析表明,它与MEM和CPV的亲缘关系比较近,与PPV的亲缘关系较远。     

虎源猫瘟热病毒的分离和鉴定

为了分离并鉴定发病虎粪便和脾脏中的1株疑似猫瘟热病毒(FPV),试验将金标记FPV试纸条初步鉴定阳性的虎粪样经无菌处理,接种于猫肾传代(CRFK)细胞。结果表明:经细胞传代成功分离猫瘟热病毒,命名为FPV-HLJ;该毒株接种细胞后能够产生明显细胞病变(CPE);病毒细胞培养液能凝集猪红细胞(凝集效价达26～28),但不能凝集鸡红细胞;电镜观察可见大量外观呈圆形或六边形,大小20～23nm的病毒粒子;对该病毒VP2全基因克隆并测序,该基因全长均为1755个核苷酸,编码584个氨基酸,与FPV标准毒株CU-4(GenBank登录号M38246)VP2基因大小相同,其决定抗原性、血凝性和宿主特异性的几个关键位点的氨基酸符合FPV的氨基酸序列特征,证明该毒株为猫瘟热病毒。     

牦牛病毒性腹泻病毒全基因测序及生物信息学分析

从牦牛(Yak)体内分离出牛病毒性腹泻/黏膜病病毒(BVDV/MDV),参考GenBank中已收录的BVDV-Ⅰ型的全基因组序列,设计了19对引物,通过RT-PCR方法,对牛病毒性腹泻病毒牦牛株进行克隆及测序,得到其全基因组序列(GenBank登录号:JQ799141),序列全长12214 nt,其中5'-UTR长288 nt,3'-UTR长232 nt。将牦牛株BVDV全基因序列与GenBank中登录的其他8株BVDV病毒全基因序列进行同源性比对及系统进化分析,结果表明,牦牛株BVDV与BVDV-Ⅰ型毒株出于同一分支,但与其他8株BVDV毒株全基因序列同源性均不高,有可能属于新的独立基因型或基因亚型,仍需进一步研究证实。     

猫泛白细胞减少症病毒的分离鉴定及VP2基因遗传变异分析

为了探究呼和浩特地区猫泛白细胞减少症病毒(Feline panleukopenia virus, FPV)的流行毒株及其VP2基因的遗传变异情况,试验采用病毒分离、形态学观察、PCR方法及间接免疫荧光试验对疑似感染FPV猫的粪便进行检测,通过动物致病性试验检测病毒的致病性,采用PCR方法扩增病毒的VP2基因并测序,分析其遗传变异情况。结果表明：分离毒株在F81细胞中培养96 h后出现细胞病变;电镜观察到直径为25 nm左右的病毒粒子;PCR检测可扩增得到大小约为1 555 bp的特异性条带;间接免疫荧光检测可观察到绿色荧光;分离株对猫具有致病性;测序后确定分离株为FPV,将其命名为HHHT-1株。HHHT-1株与GenBank中18株FPV参考毒株的同源性为98.8%～99.7%,与FPV-Beijing-01株、FPV-Shenyang-05株位于同一分支,遗传距离较近,同源性在99.4%～99.7%之间。HHHT-1株的VP2基因序列中只是个别碱基发生变化,编码的氨基酸未发生缺失。说明FPV的VP2基因变异率较低。     

2011年—2014年广西猪流行性腹泻病毒检测及其M基因的序列分析

本试验应用RT-PCR方法对2011年1月—2014年4月采自广西南宁、玉林等14个地区的331份仔猪腹泻粪便样品进行猪流行性腹泻病毒(PEDV)检测。结果显示331份样品中有210份为PEDV阳性,阳性率为63.44%。对其中25份阳性样品的PEDV M基因进行克隆和测序,将测序结果与GenBank中PEDV参考毒株的M基因序列进行同源性比对分析并构建系统进化树。25个PEDV M基因序列与51个参考毒株M基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%~99.9%、94.3%~99.6%。PEDV M基因遗传变异分析结果表明,广西2013年—2014年的PEDV流行毒株与北京、安徽、武汉、河北、广东等地2010年—2013年的流行毒株亲缘关系较近,而与中国早期分离株CH/S(GenBank登录号:JN547228)、疫苗株CV777(GenBank登录号:AF353511)和Attenuated DR13(GenBank登录号:JQ023162)的遗传距离较远。提示广西现流行的PEDV与早期毒株相比已发生较为明显的变异。     

猫细小病毒洛阳分离株VP2蛋白原核表达及多克隆抗体制备

【目的】研究旨在对猫细小病毒(Feline panleukopenia virus, FPV)洛阳分离株VP2蛋白进行原核表达和鼠源多克隆抗体制备。【方法】根据已公布的FPV VP2基因序列(GenBank登录号：EU018143.1)设计1对特异性引物,以洛阳地区7例疑似FPV感染猫粪便为样本提取DNA,对VP2基因进行PCR鉴定及测序,利用Mega 11.0软件对VP2基因进行遗传进化分析;应用在线软件预测分离株VP2蛋白结构特征并找出优势抗原表位,克隆VP2优势抗原(sVP2)并连接pET-32a(+)载体,构建pET-32a-sVP2重组质粒,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞后进行诱导表达,对重组蛋白表达条件进行优化,并使用SDS-PAGE与Western blotting方法进行鉴定;将pET-32a-sVP2用镍柱亲和层析蛋白纯化后免疫BABL/c小鼠,制备多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体效价。【结果】分离得到1株FPV,命名为LY-1。遗传进化分析发现,该毒株属于FPV-G2亚群,与北京株(GenBank登录号：MT270581)亲缘关系最近。生物信息学...     

猫白血病病毒的检测及pol基因遗传进化分析

为调查猫白血病病毒(FeLV)在青岛地区的流行情况,对2018年—2019年在青岛地区动物医院采集的25份临床疑似患有猫白血病的病料进行FeLV的RT-PCR检测,并对阳性样品的PCR产物进行了测序和遗传进化分析。结果表明,25份样品中14份检测为FeLV阳性,检出率为56%,检出率较高。同源性分析表明,除4株毒株同源性为100%外,其余各毒株间同源性差异较大,在85.5%～99.6%之间,各毒株间发生了一定变异。遗传进化分析表明,13株毒株独自形成一个分支,与来自中国台湾的FeLV-TWK30毒株遗传进化关系较远。可见猫白血病病毒在青岛地区的感染已较为严重,加强监测及防疫已经刻不容缓。     

基因C型鸭甲肝病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析

为确定发病鸭场的致病原,并掌握该致病原的遗传进化特征,进行了临床病料的RT-PCR检测、病毒分离与鸭胚病变特征观察、分离毒株半数致死量(ELD50)测定、动物回归试验、VP1基因序列分析等研究。结果显示:临床病料样品经DHAV-C特异性引物检测为阳性,病料样品可引起10日龄鸭胚规律性死亡以及肝脏肿大、出血等特征性病变,分离毒株对鸭胚的ELD50为10^-6.32/0.1mL,分离毒株对雏鸭的致死率达100%,并可引起雏鸭精神沉郁、运动障碍、肝脏肿大出血等典型症状,分离毒株VP1基因序列与GenBank中登录的DHAV-C VP1基因的同源性在96.5%~100%之间,遗传进化关系中分离毒株与DHAV-C各毒株处于同一个分支,而与DHAV-A、DHAV-B处于不同分支。试验结果为研制针对DHAV-C流行毒株的诊断试剂和新型疫苗奠定了基础。     

猫细小病毒的遗传演化及分离毒株的致病性分析

本研究旨在了解猫细小病毒（feline parvovirus,FPV）流行株的遗传演化情况及分离毒株的致病性。2018—2020年,在山东地区采集54份疑似猫瘟粪便拭子,并通过PCR和VP2基因克隆进行VP2基因全长测序,构建遗传进化树,并推导出氨基酸序列并与疫苗株进行比对,分析遗传变异情况。用F81细胞分离培养1株FPV毒株,命名为FPV-QDC20,经电镜观察、间接免疫荧光、血凝试验、TCID₅₀测定、全基因测序及动物回归试验研究该毒株生物学特性。结果表明,采集样品中16份样品VP2基因全长测序成功,其中,15份为FPV,1份为猫源犬细小病毒（CPV）。构建系统进化树显示,本研究的FPV毒株均处于同一大分支,与中国其他地区已发表的FPV毒株亲缘关系较近,与欧洲分离株以及疫苗株亲缘关系较远。氨基酸序列分析表明,某些关键位点的改变可能导致宿主范围和感染性的改变,有可能导致免疫失败情况发生。毒株QDBL2毒株中出现了80、93、103三个FPV保守位点的变异,或许与犬猫细小病毒的共感染和重组有关。动物回归试验表明,毒株FPV-QDC20有较强致病性,试验猫出现典型的临床症状和病理变化,并最终死亡。本研究有助了解我国FPV毒株遗传演化方向,为将来的疫病监控和疫苗研究提供参考。     

哈尔滨地区猫白血病病毒流行情况及遗传变异分析

为了了解哈尔滨地区猫白血病的发病情况及猫白血病病毒的遗传变异情况,试验收集了哈尔滨地区51份猫的血液样本,用PCR方法扩增该病毒保守区域pol基因,并对阳性样本进行同源性分析与遗传进化分析。结果表明：25份样本检测结果为阳性,阳性率为49%。其中,公猫样本17份,母猫样本8份;<2岁猫样本有20份,2～4岁猫样本有3份,>10岁猫样本有2份,体重<3 kg猫样本有6份,3～6 kg猫样本有15份,>5 kg猫样本有4份。25份样本的核苷酸序列与参考序列的核苷酸相似性为89.2%～100%。遗传进化分析显示它们来自同一个分支,遗传关系较近,可能与地理分布有关。说明哈尔滨地区的猫白血病的发病率较高并且病毒基因型高度相似。     

鸡传染性支气管炎病毒广西株N、M基因的克隆与序列分析

为研究鸡传染性支气管炎病毒(IBV)广西流行株的遗传变异情况,本研究从广西发病鸡中分离鉴定了1株IBV。参照GenBank中IBV的核苷酸序列设计2对引物,利用RT-PCR技术对分离毒株的N、M基因进行了克隆、序列测定,并与GenBank中发表的国内外参考毒株进行比对分析。结果显示,N基因序列全长为1 230 bp,编码409个氨基酸,M基因序列全长为678 bp,编码225个氨基酸。与参考毒株相比,分离株的N基因核苷酸序列同源性为87.2%~93.3%,推导的氨基酸序列同源性为90.0%~94.4%;M基因的核苷酸序列同源性为83.6%~91.0%,推导的氨基酸序列同源性为82.7%~92.9%。在遗传进化树中,本试验分离株Guangxi156株与BJ株和LX4株两个参考株位于同一个分支上,亲缘关系较近,而与其他参考株属于不同的分支,亲缘关系较远。结果表明,本试验分离株是一株新的IBV变异株。     

小熊猫源犬瘟热病毒全基因序列的克隆及序列分析

本研究对军事兽医研究所病毒二室分离驯化后的小熊猫源犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)基因组进行全序列测定,并对其基因组特征及H基因遗传稳定性进行比较分析。根据GenBank公布的犬瘟热病毒全长基因组序列设计合成17对特异性引物,以小熊猫源犬瘟热病毒总RNA为模板,RT-PCR进行分段扩增,并克隆到pEASY-Blunt Simple载体中,经测序、拼接获得全长cDNA序列。结果显示,小熊猫源犬瘟热病毒全基因序列与GenBank登录号分别为AF014953、AY445077、AY542312、AY466011、AY386316、AF164967、EU716337、EU726268、AY443350、AB474397、GU138403和AY649446的12个不同毒株全基因序列的同源性分别为86.6%、92.4%、92.5%、92.5%、94.3%、96.3%、95.9%、87.1%、94.5%、92.3%、87.4%和94.6%,与标准强毒株A75/17株(AF164967)的亲缘关系最近,全基因同源性达96.3%,但与疫苗株Onderstepoort(AF014953)亲缘关系相对较远,同源性为86.6%。小熊猫源犬瘟热病毒H基因与其他不同地区具有代表性的30株CDV进化树分析显示,小熊猫源犬瘟热病毒属于Asia Ⅰ型,H蛋白中309－311位氨基酸残基所形成的潜在糖基化位点,为疫苗株没有而野毒株所共有的,并且可能与病毒的免疫原性有关。因此,致弱的小熊猫源CDV在预防免疫的针对性上可能强于已有的疫苗株。     

东北三省部分地区猫细小病毒VP2基因进化分析

为了研究我国东北三省部分地区猫细小病毒(Feline parvovirus, FPV)基因的遗传进化情况,试验用PCR方法对我国东北地区25份猫肛拭子进行检测,并对检测结果呈阳性的猫进行细小病毒VP2基因克隆测序,然后进行遗传进化分析。结果表明:经PCR扩增有10份为FPV阳性,其VP2基因序列与标准株M38246和疫苗株EU498681及EU498680的相似性达99.1%以上,有9株属于G1群,1株属于G2群。说明东北地区FPV基因型主要以G1群为主。     

6株猪圆环病毒2型全基因组克隆和序列分析

为了研究猪圆环病毒2型(PCV-2)不同毒株间的基因序列,试验采用PCR方法对有断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)典型症状发病猪的脾脏、淋巴结和肺脏等6份病料(TZ1～TZ6)进行分段扩增PCV-2全基因序列,测序后与GenBank中已知序列进行比对,并用DNAStar软件进行同源性分析及系统进化树的构建。结果表明:测序结果经与GenBank中已知PCV-2序列比较鉴定,确认PCR扩增的6个序列均为PCV-2序列,其长度均为1 767 bp。所得序列与国内毒株JX982227、 KX814348序列的同源性相对较高,为97.7%～99.0%;与国外毒株DQ915584、HQ231328、EF394779、AY424405序列的同源性相对要低一些,为95.8%～96.5%。6株毒株间的同源性较高,为99.1%～100%;TZ3和TZ5与JX982227亲缘关系最密切,6株毒株序列与KX814348的亲缘关系也较近,而与AY424405、HQ231328、EF394779、DQ915584的亲缘关系相对较远。     

云南牟定狂犬病诊断及病毒部分N基因测序

自英国引进3株荧光素标记的针对狂犬病毒核蛋白的单克隆抗体,建立狂犬病直接免疫荧光诊断技术。根据已知狂犬病毒核蛋白(N或NP)基因序列,设计合成4对引物,建立狂犬病RT-PCR及套式PCR诊断技术。自牟定采集发病犬脑组织样品15份,免疫荧光及PCR诊断结果均为阳性。对PCR产物进行纯化后,克隆至pMD18-T载体测序(基因库登录号:EU095330),并与已知代表毒株对应序列进行比对及系统发育分析,结果表明:云南牟定狂犬病毒属于基因1型和血清1型毒株,与2006年广西发病犬分离毒株遗传关系密切,病毒部分N基因核苷酸及推导的氨基酸序列同源性分别为97.4%和99.0%。     

我国部分省份猪流行性腹泻病毒M基因的克隆测序及遗传进化分析

为了解我国部分省份猪流行性腹泻病毒(PEDV)的遗传进化情况,试验采用RT-PCR方法对2014—2017年采集的源自河南、河北、山西、山东、甘肃、湖北、江西等地区不同猪场的98份腹泻样品进行了PEDV检测,并对25份PEDV阳性样品进行M基因的克隆与测序和遗传进化分析。结果表明:25株M基因序列长度均为618 bp;25株M基因序列间核苷酸同源性为98.2%~100%,其编码的氨基酸序列同源性为97.8%~99.6%,与经典毒株CV777及国内外流行毒株核苷酸同源性为97.7%~98.6%,氨基酸序列的同源性分别为97.8%~98.7%;25株M基因序列与国内外早期分离株(如CV777、CH/S等代表毒株)不在一个进化分支上,与近年来分离株处在一个进化分支上。说明PEDV M基因一直处于变异进化过程中。     

川、渝、黔地区猪圆环病毒3型PCR检测及全基因组序列分析

为了解川、渝、黔地区猪圆环病毒3型(PCV3)的感染现状及流行毒株的分子遗传特征,本试验对2020年1月至2021年1月期间3省市共30个区县639份临床样本进行了检测,对阳性样本进行全基因组测序并与国内外毒株比对分析。结果显示,共检测到7份阳性样本,整体阳性率1.10%。5份阳性样本(重庆3份、四川1份、贵州1份)经过测序拼接,发现病毒全基因组长度均为2 000 bp, GenBank登录号分别为OK334614～OK334618,同源性比对显示与国内外毒株的相似性在98.2%～99.2%之间,与PCV2和PCV4的同源性较低,分别为44.9%～45.5%和46.3%～46.9%。通过对Cap蛋白的氨基酸序列分析,发现重庆和四川地区4份样本感染毒株的基因型均属于PCV3a型,而贵州地区样本感染毒株的第24和27位氨基酸分别为亮氨酸(L)和赖氨酸(K),为一种新的变异基因型,不属于目前分类标准下的任何一种。该结果为进一步了解PCV3的遗传变异及其在我国西南部分省份的分子流行特征提供了依据。     

河北省塞内卡病毒A VP2基因克隆和序列分析

为了解河北省塞内卡病毒A(SVA)VP2基因的变异及分子进化情况,试验设计了一对VP2基因扩增引物,通过RT-PCR方法扩增和克隆测序,利用MEGA 7.0软件对测序获得的VP2基因序列和GenBank上的参考序列进行遗传进化分析,运用MegAlign 5.0软件进行核苷酸和氨基酸同源性分析。结果表明：成功扩增并测序得到VP2基因序列,将该序列上传至GenBank,获得基因登录号为MZ031967,命名为SVA HB-BD株。该毒株与中国毒株核苷酸序列相似性为95.9%～99.6%;与原型毒株SVV-001(DQ64125-7核苷酸)相似性较低,为94.6%;与其他美国毒株(MN812946、MN812947、KC667560、MH704432、MN812938、MN812937、KU954086、NC011349)核苷酸相似性为93.0%～94.6%。SVA HB-BD株与2015—2016年分离毒株亲缘关系较近,处于同一分支,而与2017—2018年分离毒株亲缘关系较远。SVA HB-BD株与广东省分离毒株氨基酸序列相似性较高,并且在VP2蛋白中和表位位点高度保守。说明HB-BD株...