小反刍兽疫病毒核蛋白单克隆抗体的制备与初步应用

针对小反刍兽疫病毒核蛋白制备特异性的单克隆抗体,并对其进行生物学特性鉴定和初步应用。以纯化的Bacmid-PPRV-N重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的致敏脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG作用下融合,获得单克隆抗体,并通过染色体技术等方法研究其生物学特性,将其作为竞争单抗,Bacmid-PPRV-N重组蛋白作为检测抗原建立竞争ELISA检测方法。结果表明:经克隆和间接ELISA筛选,获得了2株能稳定分泌抗小反刍兽疫病毒N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为5B11和3H10-3B8。生物学特性鉴定试验表明:5B11和3H10-3B8抗体类型和亚类均为IgG2b;5B11单抗腹水的效价达1∶819 200,3H10-3B8达1∶12 800;血清学试验证明2株单抗均能与Bacmid-PPRV-N重组蛋白抗原结合,具有高度的特异性;相加ELISA试验结果显示,5B11和3H10-3B8 2株单克隆抗体分别识别N蛋白上不同的抗原位点;2株杂交瘤细胞的染色体均为99～104。应用建立的c-ELISA检测方法对222份血清样品进行PPRV抗体的检测,与参考试剂盒比较得到98.20%的符合率。本研究获得了2株能稳定分泌抗PPRV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,以单抗5B11作为竞争抗体建立了PPRV的c-ELISA检测方法。     

Detection of Antibodies Against Peste des Petits Ruminants Virus in Sera of Cattle,Camels, Sheep and Goats in Sudan

Detection of antibodies against peste des petits ruminants virus in sera of cattle, camels, sheep and goats in Sudan.     

小反刍兽疫病毒竞争ELISA检测试剂盒生产工艺研究

为研究小反刍兽疫病毒（PPRV）竞争ELISA试剂盒的生产工艺,本试验利用昆虫细胞表达的PPRV核蛋白及其单克隆抗体,建立一种特异性高、敏感性强的PPRV竞争ELISA检测方法,并对该方法的各个步骤进行优化,确定该方法的最适条件,从而确定竞争ELISA的操作程序。并用该方法与OIE推荐的PPRV rC-ELISA抗体检测试剂盒同时检测来自西藏、内蒙古共977份临床羊、牛血清样本,结果显示特异性、敏感性、符合率分别达99.89%、93.82%、99.38%。本研究建立的PPRV竞争ELISA方法为该病毒检测试剂盒的研制奠定技术基础,为小反刍兽疫的防控提供科学依据。     

小反刍兽疫研究现状

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants,PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种主要感染小反刍动物的急性、接触性传染病,发病率、死亡率高.近年来,小反刍兽疫(PPR)呈扩散的趋势,成为重要的跨国动物传染病之一,我国周边国家频繁器发该病.2007年7月25日暴发于西藏自治区日土县的我国首例小反刍尊疫疫情,更是对我国如何做好该病的防控工作提出了新的要求和挑战.为了增强广大兽医工作者和相关人士对本病的认识,文中就小反刍兽疫的病原学、流行病学、临床症状、病理特征以及诊断方法等方面的研究现状进行了综述.     

小反刍兽疫研究进展

小反刍兽疫病毒(PPRV)是副黏病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbolivirus)的成员,主要感染山羊、绵羊等小反刍动物,引起一种高度接触性病毒性传染病。小反刍兽疫为一种重大的外来性疾病,2007年在中国西藏自治区日土县首次发生。自2013年末以来中国新疆、青海、甘肃、宁夏、内蒙、湖南、辽宁等地频繁暴发小反兽疫疫情,给中国的畜牧业带来了巨大的损失,引起极大的重视。为更好的分析小反刍兽疫的病原特性及采取有效的防控措施,文章对小反刍兽疫的病原学及疫苗研究进展进行论述。     

小反刍兽疫疫苗研究进展

小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒引起的一种严重的烈性、接触性重大跨国动物疫病.目前,该病在我国已经发生,给我国畜牧业经济造成了巨大损失.同多数病毒性疾病的防制相同,对小反刍兽疫PPRS的防制仍以疫苗免疫预防为主.文章对小反刍兽疫的各类疫苗进行综述,以期为疫苗的合理应用提供技术帮助.     

Economics of Prophylaxis against Peste des Petits Ruminants and Gastrointestinal Helminthosis in Small Ruminants in North Cameroon

Data on reproduction and mortality were collected over one year from 5100 sheep and 13 300 goats in treated and control flocks. The treated animals received vaccination against peste des petits ruminants (PPR) and anthelmintics twice a year. Productivity parameters (fecundity and mortality rates) obtained with and without prophylaxis were fitted into a benefit–cost economic analysis model and run for project lifespans varying from one to five years. At a 7% discount rate, the overall benefits for a project lifespan of five years were estimated as over 15 million FCFA and 11 million FCFA for sheep and goats, respectively. The benefit–cost ratio ranged from 2.26 to 3.27 in goats and 3.01 to 4.23 in sheep, depending on the project lifespan. It was concluded that PPR and gastrointestinal helminthosis are important causes of economic losses in small ruminants in Cameroon. A national or even a regional vaccination campaign against PPR and strategic anthelmintic treatment of small ruminants are recommended.     

小反刍兽疫分子生物学研究进展

小反刍兽疫(peste des petits ruminants,PPR)是由小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种急性、烈性、接触性传染病。山羊高度易感;牛、猪等动物也可以感染带毒,野生动物偶有发生。作者主要介绍了小反刍兽疫病毒各基因结构特点,6种结构蛋白的功能,以及小反刍兽疫的诊断技术等方面的最新研究进展。     

一步法实时定量RT-PCR检测小反刍兽疫病毒方法的建立

建立了检测小反刍兽疫病毒的快速、特异的基于Taqman的一步法实时定量RT-PCR方法。通过对GenBank已公布的小反刍兽疫病毒N基因序列进行序列比较分析,设计了一对特异性引物和一条Taqman探针。利用这对引物和探针对来自不同疫源地的小反刍兽疫病毒RNA样本进行检测,都获得了特异性扩增,但是,不与牛瘟病毒、海豚麻疹病毒等其他种的麻疹病毒属病毒发生交叉反应。本方法具有高度灵敏性,最低可检测到810拷贝的RNA模板。在模板浓度为8.1×102到8.1×108拷贝范围内,都呈现良好的线性关系,而且无论是组内和或组间重复的变异系数都很低。     

小反刍兽疫研究进展

小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒引起的一种重大烈性传染病,主要发生于山羊和绵羊等小反刍兽,在国际上已经得到广泛的重视。本文对小反刍兽疫的病毒病原学、流行病学、临床特征、病理变化以及诊断和疫苗研制等国际上的最新进展进行了全面综述。     

小反刍兽疫研究进展

小反刍兽疫(PPR)是由小反刍兽疫病毒(PPRV)引起的急性或亚急性传染病,为世界动物卫生组织(OIE)法定报告的动物疫病,易感动物以山羊、绵羊等小反刍动物为主。目前,小反刍兽疫主要流行于西非、中非、中东、阿拉伯半岛及南亚等地区。敏感特异的检测方法和高效的预防性疫苗将为该病的防控奠定良好的基础。论文对小反刍兽疫全球流行现状、诊断技术及疫苗研究进展进行了综述。     

小反刍兽疫诊断及其免疫防制的研究进展

小反刍兽疫(peste des petits ruminants,PPR)是由副黏病毒科麻疹病毒属小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)引起的一种急性、烈性、接触性传染病,目前已给中国养羊业造成巨大损失与威胁。作者对PPR的流行病学、诊断方法及疫苗研制进展等方面作一简要综述,以期为该病的防控提供有效的参考。     

小反刍兽疫病毒间接ELISA抗体检测方法的建立与初步应用

本研究利用原核表达的小反刍兽疫病毒核衣壳（N）蛋白作为标准抗原蛋白,建立PPRV抗体检测方法,同时对建立的检测方法的相关条件进行了优化。通过优化确定抗原的最佳包被浓度为10 mg/L,血清最佳稀释度为1∶40,二抗的使用浓度为1∶200,血清及二抗的最佳反应条件为37 ℃孵育60 min,底物的最佳反应时间为37 ℃ 15 min。通过批内及批间重复性的评价,变异系数均小于0.1,表明本检测方法具有较高的可重复性。经过临床样品检测证明,建立的检测方法可用于临床PPRV抗体的检测。     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂对小反刍兽疫病毒复制的影响

旨在探究组蛋白去乙酰化酶抑制剂对小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)复制的影响,以确定组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)在PPRV复制过程中的作用。采用RT-qPCR法检测PPRV感染后Vero细胞HDACs(HDAC1~11) mRNA表达水平的变化;用针对不同类型HDACs的抑制剂处理感染PPRV的Vero细胞48 h,Western blot筛选影响PRPV N蛋白表达的抑制剂;应用筛选出的抑制剂处理感染PPRV的Vero细胞,通过RT-qPCR、Western blot和TCID₅₀法进一步分析抑制剂对病毒RNA、蛋白和病毒滴度的影响。结果显示,PPRV感染后,Vero细胞HDAC2 mRNA水平显著升高(P<0.05);SAHA、TMP269、MGCD0103处理后,PPRV N蛋白的表达量明显降低,且呈剂量负相关;SAHA、TMP269、MGCD0103也显著降低PPRV N RNA表达水平(P<0.05,P<0.05,P<0.01)和病毒滴度(P<0.05,P<0.05,P<0.01)。这表明Ⅱa类HDACs抑制剂和Ⅰ类HDACs抑制剂能抑制PPRV的复制,Ⅰ类HDACs (HDAC1~3)和Ⅱa类HDACs (HDAC4~5、HDAC7、HDAC9)可能参与调控PPRV的感染。     

小反刍兽疫的诊断与综合防控措施

小反刍兽疫是由小反刍兽疫病毒引起的一种急性、亚急性传染性疾病,主要感染绵羊、山羊及一些野生小反刍动物,发病率和死亡率均较高,给广大农牧民和养殖场造成巨大的经济损失。因此,对该病的诊断及综合防控措施进行概述,以期为该病的防控提供参考。     

Selection and identification of single-domain antibody against Peste des Petits Ruminants virus

BackgroundPeste des petits ruminants (PPR) is an infectious disease caused by the peste des petits ruminants virus (PPRV) that mainly produces respiratory symptoms in affected animals, resulting in great losses in the world''s agriculture industry every year. Single-domain variable heavy chain (VHH) antibody fragments, also referred to as nanobodies, have high expression yields and other advantages including ease of purification and high solubility.ObjectivesThe purpose of this study is to obtain a single-domain antibody with good reactivity and high specificity against PPRV.MethodsA VHH cDNA library was established by immunizing camels with PPRV vaccine, and the capacity and diversity of the library were examined. Four PPRV VHHs were selected, and the biological activity and antigen-binding capacity of the four VHHs were identified by western blot, indirect immunofluorescence, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) analyses. ELISA was used to identify whether the four VHHs were specific for PPRV, and VHH neutralization tests were carried out. ELISA and western blot analyses were used to identify which PPRV protein was targeted by VHH2.ResultsThe PPRV cDNA library was constructed successfully. The library capacity was greater than 2.0 × 10⁶ cfu/mL, and the inserted fragment size was approximately 400 bp to 2000 bp. The average length of the cDNA library fragment was about 1000 bp, and the recombination rate was approximately 100%. Four single-domain antibody sequences were selected, and proteins expressed in the supernatant were obtained. The four VHHs were shown to have biological activity, close affinity to PPRV, and no cross-reaction with common sheep diseases. All four VHHs had neutralization activity, and VHH2 was specific to the PPRV M protein.ConclusionsThe results of this preliminary research of PPRV VHHs showed that four screened VHH antibodies could be useful in future applications. This study provided new materials for inclusion in PPRV research.     

小反刍兽疫病毒M基因截短表达及鉴定

目的将小反刍兽疫病毒M蛋白基因截短表达后用于特异性单抗制备及临床抗体水平检测。方法:用在线分析软件BepiPred分析小反刍兽疫病毒M蛋白潜在的B细胞线性表位,以本实验室构建的pCR2.1T-PPRV M质粒为模板,扩增三段截短的M基因,纯化后的PCR产物分别与克隆载体pCR2.1T连接,筛选出的阳性重组质粒经双酶切后,分别与表达载体pET-32a(+)及pGEX-6p-1连接,再将鉴定为阳性的重组质粒转化入E.coli BL21(DE3)菌株诱导表达,并用SDS-PAGE及Western blot验证。结果 PCR产物电泳,得到与预期大小相符的特异性片段。对连接克隆载体及表达载体的重组质粒双酶切后,均出现与预期一致的片段,DNA测序表明,插入片段序列与小反刍兽疫Nigeria75/1株M蛋白基因完全一致。重组蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定,证明所构建的重组蛋白均获得高效表达,并均具有良好的反应原性。结论成功表达了小反刍兽疫截短M基因的蛋白,为制备特异性单抗及小反刍兽疫抗体检测奠定了一定基础。     

澳大利亚与我国小反刍兽疫应急预案的比较

我国于2007年首次暴发小反刍兽疫,随后疫情很快得到控制,但在2013年11月该病再次传入我国并造成多地暴发疫情。为了解国内外相关的防控应急策略,将我国2007年颁布的《小反刍兽疫防控应急预案》与澳大利亚2009年颁布的《小反刍兽疫应急预案》（第三版）进行比较,以期为我国小反刍兽疫的防控提供参考。