猪繁殖与呼吸综合征病毒M/GP5糖蛋白复合物可通过唾液酸依赖途径与唾液酸黏附素受体结合

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是世界范围内威胁猪健康的最主要的因素,被认为是当今养猪业中最重要的病毒病。在过去的几年中,对病毒侵入宿主细胞的研究使许多病毒受体及病毒进入调控因子被鉴定出来。然而,与这些大分子相对应的病毒组分仍不清楚,这使得合理开发新型疫苗变得很困难。该研究的主要目的是鉴定巨噬细胞上的关键性PRRSV受体—唾液酸黏附素相对应的病毒组分。为此,作者构建了可溶性的唾液酸黏附素并对其进行验证。在唾液酸依赖途径中,可溶性的唾液酸黏附素可以与PRRSV结合,并阻断PRRSV对巨噬细胞的感染,因此可以确定唾液酸黏附素是巨噬细胞上PRRSV所必需的受体。尽管唾液酸也存在于膜糖蛋白GP3、GP4和GP5中,但是只有PRRSV的M/GP5糖蛋白复合物被证实为唾液酸黏附素的配基。试验结果发现,两者之间的相互作用依赖于唾液酸黏附素结合唾液酸的能力及GP5上的唾液酸。这些研究结果不仅有利于更好的了解PRRSV的生物学特性,而且该研究结果及研究方法是开发PRRSV新型疫苗的关键。     

α-干扰素在猪流感病毒感染急性期的作用

细胞因子，尤其是α-干扰素（IFN-α）在控制流感病毒感染过程中发挥着重要作用。为了研究IFN-α在流感过程中的作用，给感染流感病毒的模型动物猪接种IFN-α中和单克隆抗体（Abs）K9。首先确定了IFN-α中和Abs的最佳接种剂量与接种途径，据此研究Abs对猪流感病毒感染的效果。给猪气管内接种半数鸡胚感染量为10^6的H1N1流感病毒，接种18h后，分别给试验猪气管内和腹膜内注射高剂量的IFN—α中和Abs和对照Abs。     

α-干扰素在猪流感病毒感染急性期的作用

细胞因子,尤其是α-干扰素（IFN-α）在控制流感病毒感染过程中发挥着重要作用。为了研究IFN-α在流感过程中的作用,给感染流感病毒的模型动物猪接种IFN-α中和单克隆抗体（Abs）K9。首先确定了IFN-α中和Abs的最佳接种剂量与接种途径,据此研究Abs对猪流感病毒感染的效果。     

α-干扰素在猪流感病毒感染急性期的作用

细胞因子,尤其是α-干扰素（IFN-α）在控制流感病毒感染过程中发挥着重要作用。为了研究IFN-α在流感过程中的作用,给感染流感病毒的模型动物猪接种IFN-α中和单克隆抗体（Abs）K9。首先确定了IFN-α中和Abs的最佳接种剂量与接种途径,据此研究Abs对猪流感病毒感染的效果。给猪气管内接种半数鸡胚感染量为106的H1N1流感病毒,接种18 h后,分别给试验猪气管内和腹膜内注射高剂量的IFN-α中和Abs和对照Abs。试验猪分别于接种后0、24、30、487、2 h安乐死。在接种后24和30 h,接种K9猪的气管-肺泡灌洗液中IFN-α明显减少,并伴随IL-6和IL-12的减少,而对照抗体处理组TNF-α和IL-1的水平未受影响。最重要的是,IFN-α中和单克隆抗体处理组动物出现临床症状推迟了24 h,同时伴随IFN-α的减少,但是并没有对病毒的复制及肺脏的病变产生明显的影响。试验结果表明,IFN-α对IL-6和IL-12有诱导作用,3种细胞因子在抗猪流感中起重要作用。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪的传染病,对养猪业危害很大.GP5蛋白是PRRSV ORF5基因编码的一个糖基化的囊膜蛋白,具有较好的免疫原性,能够诱导产生中和抗体.因此,GP5蛋白在PRRSV的致病性、诊断、预防与控制等方面研究中具有重要意义,是研制基因工程疫苗的最佳候选基因.近年来对GP5蛋白的研究取得了重要的进展,现就GP5蛋白的特征、免疫作用及疫苗等方面做一综述.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体依赖增强作用研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起母猪繁殖障碍和仔猪的呼吸道症状而导致高病死率的传染病,PRRSV抗体依赖增强作用(ADE)是造成PRRS免疫失败的重要因素,受到国内外学者的高度重视。近年来,对ADE的机理已进行了深入的研究,主要是巨噬细胞通过FcγR介导摄取PRRSV引发ADE现象。论文综述了PRRSV的结构蛋白和ADE机理,为PRRS的进一步研究和疫苗的研发提供参考。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP3/GP5/M真核表达载体的构建及其体液免疫应答

本试验旨在构建表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3、GP5和M蛋白的真核重组质粒。以PRRSV LN株为模板,采用PCR方法扩增出GP3、GP5、M基因片段,将扩增的GP5、M通过Linker序列串联成GP5-M,然后将GP3与GP5-M双酶切后插入pcDNA3.1(+)构建重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M,将其转染COS7细胞。PCR鉴定表明重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M含有PRRSV GP3、GP5-M基因,间接免疫荧光检测表明GP3、GP5-M蛋白在COS7细胞内获得表达。Western blotting检测证实GP3、GP5、M蛋白获得正确表达,并且所表达的GP3、GP5、M蛋白是融合蛋白。将pcDNA3.1-GP3-GP5-M免疫BALB/c小鼠,首免后2周可检测到特异性PRRSV中和抗体,首免后8周中和抗体效价最高可达1∶32。进一步将pcDNA3.1-GP3-GP5-M免疫断奶仔猪,首免后4周即可产生1∶4～1∶8的中和抗体。本试验成功构建了表达PRRSV GP3、GP5和M融合蛋白的真核重组质粒pcDNA3.1-GP3-GP5-M,中和抗体检测表明pcDNA3.1-GP3-GP5-M具有良好的免疫原性,从而为PRRSV基因工程疫苗的研制奠定基础。     

双重RT-PGR方法检测猪流感病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒

为建立特异、敏感的猪流感病毒(SIV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的双重RT-PCR检测方法,本研究根据GenBank登录的SIV M基因保守序列和PRRSV美洲型毒株的N基因保守序列,设计合成了2对特异引物,通过对扩增条件的优化,建立检测SIV和PRRSV的双重RT-PCR方法.检测结果显示:该方法可同时扩增出SIV(345 bp)和PRRSv(520 bp)的特异性片段;而猪瘟病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型及阴性鸡胚尿囊液核酸扩增结果均为阴性;对SIV和PRRSV 2种病毒混合液的最小检出量分别为102 EID50/0.1 mL和103TCID50/0.1 mL.应用双重RT-PCR和病毒分离法对12份临床疑似样品进行对比检测,结果表明:除双重RT-PCR检测到双阳性的3份混合感染病料中1份未分离到PRRSV外,其余2份均分离出病毒.证明该方法具有良好的特异性、敏感性,可以用于临床样品的早期快速检测.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和M基因重组腺病毒的构建及表达

为构建猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组腺病毒活载体疫苗,本研究将PRRSV GP5和M基因串联表达盒定向克隆至穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA多克隆位点处,获得重组穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA-GP5-M,与骨架质粒pacAd5 9.2-100共转染293AD细胞,包装出含有GP5和M基因的重组腺病毒rAd5-GP5-M。应用PCR技术、间接免疫荧光、Western blot分析,结果表明,GP5和M基因已经被成功整合到了腺病毒基因组上,且GP5和M蛋白在293AD细胞上均得到了表达;滴度测定表明,该重组腺病毒rAd5v-GP5-M的TCID50为10-6.5/mL;连续传代试验表明该重组腺病毒可在细胞内稳定繁殖,有效地转录并表达GP5和M蛋白,具有较高的遗传稳定性。该研究为PRRSV重组腺病毒疫苗的研制打下了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5/M蛋白可溶性表达及免疫原性分析

为表达出高可溶性的GP5/M蛋白并检测其免疫原性,本试验将高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)HN07-1毒株ORF5和ORF6基因序列上GP5和M蛋白的编码核苷酸序列进行密码子偏爱性优化设计,构建了GP5/M融合Grifin、GST、MBP、NusA、Sumo、Thioredoxin、γ-crystallin、ArsC、PpiB、CeHSP17共10种不同可溶性标签的表达重组载体。分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导,SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测,筛选出高可溶性表达的GP5/M融合蛋白。重组蛋白通过Ni-NTA Agarose亲和纯化,免疫家兔,对获得的兔抗GP5/M血清进行间接ELISA和病毒中和试验。结果显示,成功构建10个GP5/M表达载体,10个标签中,MBP与GP5/M蛋白相融合的可溶性表达效果最好,并获得了高纯度的MBP-GP5/M重组蛋白质;通过免疫家兔,检测重组蛋白具有免疫原性并能刺激机体产生较高水平的中和抗体。结果表明,试验成功建立了稳定获得GP5/M重组蛋白质的方法,初步鉴定了重组蛋白的免疫效力,为PRRSV亚单位疫苗的后续研究及大量制备奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒与猪流感病毒二重RT-PCR 检测方法的建立

为建立可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）与猪流感病毒（SIV）二重RT-PCR 方法,研究根据GenBank 登录的相关病毒基因序列,选择保守区域设计引物,经过反应条件的优化,建立了可同时检测以上2 种病毒的RT-PCR 诊断方法,扩增的目的片段长度分别为364 bp（PRRSV）和981 bp（SIV）。通过实验证明该方法具有良好的特异性和较高的敏感性,对PRRSV 和SIV 的核酸检测最低浓度分别为 3.2×10-3 ng 和2.7×10-3 ng。应用该方法对32 、份临床样品进行检测发现PRRSV 阳性率为43.8%,SIV 阳性率为31.3%,二重感染率为9.4%。该方法的成功建立为快速高效地检测以上2 种病毒提供了有力手段。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒乌鲁木齐分离株GP5基因遗传变异分析

为对乌鲁木齐市猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的分子遗传变异情况进行研究与分析,应用RT-PCR方法对疑似感染PRRSV猪的组织脏器进行PRRSV GP5基因的扩增,将阳性样品PCR产物进行克隆和测序,并应用分子生物学软件对测序结果进行比对和遗传进化分析。结果显示,5株病毒分离株GP5基因全长均为603 bp,与JXA1株亲缘关系较近,同属于美洲株的同一基因亚群。本试验结果为掌握乌鲁木齐市PRRSV的分子遗传变异情况提供了依据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞受体研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)给世界养猪业造成了巨大损失。对PRRSV受体的深入研究有助于揭示病毒与宿主细胞的相互关系,明确病毒的入侵机制及其对宿主细胞的影响,帮助人们了解病毒的侵入过程、复制动力学及其一系列在胞内发生的事件;对于揭示病毒感染过程与免疫系统之间的相互作用,阐明细胞病理和组织病理是非常有价值的,也必然会对抗病毒药物和疫苗研发产生巨大的推动作用。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的原核表达及鉴定

为获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白,以一株PRRSV NADC30-like毒株的基因组RNA为模板,利用RT-PCR扩增出ORF5基因后,将该基因克隆至原核表达载体pCold-TF中,构建了重组质粒pCold-TF-GP5,转化Rosetta(DE3)后用IPTG诱导,经SDS-PAGE、Western blot鉴定,重组蛋白获得了可溶性表达,大小约为72 ku。将该蛋白过镍柱纯化后获得浓度为0.5 mg/mL的纯化蛋白,为下一步GP5蛋白单克隆抗体的制备奠定物质基础。     

多重PCR检测猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪流感病毒

应用Primer3.0和Omega2.0,根据猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪流感病毒(SIV)保守基因设计了3对多重PCR引物,建立PRRSV,SIV和PRV单项PCR检测方法,并在优化单项PCR反应条件(引物浓度、Mg2 浓度、退火温度等)基础上,初步建立了PRRSV-PRV-SIV多重PCR检测方法,并分别用多重PCR和单项PCR/RT-PCR检测10份临床病料,两者符合率为96.6%,表明该多重PCR检测方法有较高的敏感度,可以用于临床病料的检测。     

应用杆状病毒系统高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因

将猪繁殖与呼吸综合征病毒CH_la株囊膜糖蛋白 (GP5 )基因定向亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHisB中 ,与杆状病毒线性DNA(Bac_N_BlueTMDNA)共转染昆虫细胞sf9,经过三轮蚀斑纯化后 ,获得重组杆状病毒rBac_GP5。用该重组病毒感染sf9细胞后 ,应用间接免疫荧光试验、SDS_PAGE和Westernblot检测表明 ,GP5基因在杆状病毒系统中获得了高效表达 ,表达产物因糖基化程度差异 ,表观分子量有 2 2、2 5和 30kDa三种总计约占细胞蛋白总量的 2 6 .4%。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白单克隆抗体,首先构建猪PRRSV GP5基因的真核重组表达载体pCDNA-GP5,将其作为免疫原,对Balb/c小鼠进行免疫。取免疫4次后的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合。构建PRRSV GP5基因的原核重组表达载体pGEX-6P-GP5,将其转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3)并诱导表达。以表达的原核蛋白GP5作为单克隆抗体的筛选抗原,通过间接ELISA进行杂交瘤细胞株的检测和筛选。本研究成功构建了GP5基因的真核重组表达载体pCDNA-GP5,表达并纯化了GP5蛋白。经2~3次亚克隆后获得3株针对GP5蛋白的杂交瘤细胞株,IFA和Western blot对3株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体进行了鉴定。GP5蛋白单克隆抗体的成功研制,为进一步建立特异性PRRSV检测方法奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理的研究进展

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种以妊娠母猪严重繁殖障碍及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征的传染病。现已遍及世界各主要养猪国家和地区,成为危害养猪业最严重的传染病之一。作者就猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理方面的研究情况作一综述,为诊断技术、免疫机理研究、疫苗设计和疫病防制提供借鉴。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白在酿酒酵母中的定位研究

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)gp5基因在酿酒酵母中表达后蛋白的定位位置,以此揭示PRRSV在感染细胞中获取囊膜的位置信息,本研究首先将gp5基因克隆到酿酒酵母表达载体pUG35的gfp基因上游,构建重组质粒pUG-gp5-gfp,电击导入酿酒酵母CEN.PK2中,经尿嘧啶缺陷型营养筛选,获得重组酵母pUG-gp5-gfp/CEN.PK2,在甲硫氨酸营养缺陷培养基诱导表达后,荧光显微镜观察显示,gp5-gfp融合基因在酿酒酵母中获得表达,所表达的融合荧光蛋白主要聚积位置与内质网和质膜的定位模式一致,表明GP5蛋白信号肽在酵母中起到了导向作用,揭示了PRRSV在宿主细胞中获得囊膜的可能位置。该研究为其他病毒在宿主细胞中的组装位置研究提供新的思路。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5重组蛋白对外周血单个核细胞功能的影响

为了研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5重组蛋白(rGP5)对猪外周血单个核细胞(PBMC)功能的影响,本研究选取PRRSV-PC疫苗株中的ORF5基因片段,对其进行原核表达并纯化,结果显示rGP5以可溶性和包涵体两种形式表达,分子质量约为30 ku;将该纯化蛋白免疫大耳白兔,按常规方法制备抗血清并进行酶联免...