雪菜BjSnRK2E基因的克隆及表达分析

环境胁迫是造成作物品质和产量损失的重要因子。Sn RK2家族基因编码植物体内一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是影响植物抗逆境胁迫能力的关键调控基因。采用电子克隆与RT-PCR相结合的技术,从雪菜(Brassica juncea Coss.Var.Multiceps Tsen et Lee)克隆了一个Sn RK2基因,命名为Bj Sn RK2E(Gen Bank登录号为MF423121)。序列分析显示,该基因全长1 218 bp,编码区为1 089 bp,编码362个氨基酸。Scan Prosite预测显示,Bj Sn RK2E蛋白包含一个ATP结合位点和一个丝氨酸/苏氨酸激酶结构域。多序列比对和进化树分析表明,Bj Sn RK2E蛋白与其他植物的Sn RK2蛋白分享较高的相似性,与拟南芥的At Sn RK2.6和马铃薯St Sn RK2.3蛋白亲缘关系最近,处在同一进化分枝。实时定量RT-PCR检测结果显示,Bj Sn RK2E基因在根部的表达量最高,其次是茎,叶片的表达量最低;Bj Sn RK2E基因积极参与高盐、干旱和ABA胁迫应答反应,推测该基因功能与植物抗逆境胁迫有关。     

小桐子SnRK2基因家族的全基因组鉴定及特征分析

蔗糖非发酵-1型相关蛋白激酶2(sucrose non-fermenting-1 related protein kinase 2,Sn RK2)属植物特有的一类Ser/Thr类蛋白激酶,参与植物体内多种信号转导途径及逆境胁迫的应答。基于小桐子基因组数据,利用生物信息学的方法鉴定到7个小桐子Sn RK2基因家族成员,并对其从系统进化、理化性质、基因结构及顺式作用元件等进行了分析。结果表明,小桐子Sn RK2基因在进化上较为保守,并聚类为3个亚家族。基因结构包含9~10个外显子,编码的蛋白序列都鉴定到典型的激酶结构域以及C末端酸性补丁区域。同时,在Sn RK2基因上游调控区域都鉴定到多个激素与逆境应答元件。表达分析显示,Sn RK2.1、Sn RK2.2在低温处理下上调表达显著,经过干旱处理,7个小桐子Sn RK2基因在叶中都上调表达,而Sn RK2.1、Sn RK2.2、Sn RK2.5上调表达量达到极显著水平(p0.01)。本研究为进一步的克隆小桐子Sn RK2基因以及研究其在信号转导与激素、逆境应答中的功能提供了参考。     

植物SnRK2基因家族研究进展

蔗糖非依赖1蛋白激酶2(SnRK2)激酶家族,是众多应答渗透压胁迫的蛋白激酶家族之一。本综述主要介绍了SnRK2蛋白激酶家族的研究进展,包括分子结构、活性调控、下游的靶标基因及其生理学功能等。总结了近年来Sn RK在联系植物中特有的代谢和胁迫应答、调控ABA和SOS信号转导途径及ABA依赖的植物生长等方面研究所取得的进展,试图为深入开展植物环境胁迫机制研究提供参考。     

玉米ZmCIPK20基因克隆及表达分析

CIPK蛋白激酶是植物非生物胁迫信号传导途径中的重要元件。为克隆玉米CIPK蛋白激酶基因ZmCIPK20全长c DNA序列,并分析其在盐胁迫下的表达模式,采用RT-PCR技术克隆基因,用生物信息学方法对获得的序列进行分析,采用荧光定量PCR方法研究ZmCIPK20在盐胁迫下的表达。本研究从玉米中克隆了一个编码CIPK蛋白激酶基因ZmCIPK20,该基因c DNA全长1 800 bp,5'-非编码区长203 bp,3'-非编码区长202 bp,编码区长1 395 bp,编码464个氨基酸,预测分子量为50.993 kD,等电点为8.55。推测的氨基酸序列中含有1个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域S_TKc和1个NAF结构域。进化树分析发现,ZmCIPK20和SbCIPK分为一个分支。荧光定量PCR检测表明,ZmCIPK20基因受盐胁迫诱导表达,在根中下调表达,在叶中上调表达,说明玉米ZmCIPK20基因可能参与玉米对盐胁迫的应答,为揭示该基因的生物学功能提供依据。     

雪菜BjSnRK2C基因的克隆及生物信息学分析

SnRK2家族基因编码植物体内一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是ABA通路中影响植物抗逆能力的关键调控基因。基于SnRK2成员c DNA的保守区序列信息,利用RT-PCR与SON-PCR相结合的方法从雪菜中克隆了一个SnRK2全长c DNA序列,命名为BjSnRK2C。测序结果显示,该c DNA序列全长1 380 bp,包含一个137 bp的3'-非翻译区,一个214 bp的5'-非翻译区,一个1 029 bp的完整开放阅读框,编码342个氨基酸,在Gen Bank数据库的登录号为MF983711。BjSnRK2C蛋白激酶理论分子量为38. 2 ku,理论等电点为5. 61,属于亲水性蛋白,存在2个显著跨膜结构域,含有30处磷酸化位点,没有信号肽,最可能定位的位置是在细胞质上。BjSnRK2C蛋白激酶的二级结构具有130个α-螺旋、126个无规则卷曲、59个延伸链和27个β-转角。BjSnRK2C蛋白包含1个丝氨酸/苏氨酸酶活性结构域和1个ATP结合位点,同拟南芥AtSnRK2. 8蛋白激酶亲缘关系最近,处在同一进化分枝。雪菜BjSnRK2C蛋白激酶的三级结构与拟南芥AtSnRK2. 8蛋白激酶极为相似,推测它们具有类似的功能。BjSnRK2C蛋白激酶的C末端仅含有结构域Ⅰ,缺少结构域Ⅱ,暗示雪菜BjSnRK2C基因在参与非生物胁迫过程中很可能也是不依赖ABA调控通路的。研究结果可为今后深入研究BjSnRK2C功能奠定理论基础。     

谷子丙酮酸磷酸双激酶基因(SiPPDK1)对非生物逆境的响应

通过序列比对在谷子基因组中鉴定出一个PPDK基因,命名为Si PPDK1。为揭示该基因对逆境胁迫的响应,本研究通过对Si PPDK1的基因结构、蛋白特征、功能、启动子区域顺势元件、亚细胞定位、进化特征等进行了系统的分析和预测。荧光实时定量PCR检测了该基因在苗期不同逆境、关键生育期干旱以及不同光照条件下的表达。结果表明该基因位于谷子9号染色体,含有17个内含子,有2个可变剪切。功能域分析和多序列比对发现Si PPDK1蛋白具有非常保守的序列结构,并且与其它植物PPDK蛋白非常相似。q RT-PCR表达谱分析表明Si PPDK1基因在苗期被PEG、ABA、Na Cl和低温胁迫强烈诱导。进一步研究表明Si PPDK1基因在拔节、抽穗和灌浆期干旱和不同光照强度条件下均参与了对干旱和光照的胁迫响应,推测该基因参与了谷子对非生物逆境的应答,尤其在抽穗期干旱和光照胁迫应答中起重要作用。     

谷子CBL基因鉴定及其在干旱、高盐胁迫下的表达分析

CBL/CIPK信号网络系统在植物对逆境应答过程中起重要作用。本文利用生物信息学方法从谷子基因组中鉴定出7个候选CBL基因,命名为SiCBL1~SiCBL7。分析表明谷子CBL基因在蛋白质序列和结构上非常保守,所有预测SiCBL基因都含有7~8个内含子,而且其外显子序列同源性很高并且大部分外显子含有相同的碱基数目。预测SiCBL基因均含有4个EF-Hand功能域而且相邻EF-Hand功能域之间的氨基酸数目非常保守。进化和聚类分析结果表明, CBL基因在陆生植物早期的进化过程中就已经存在,所有CBL基因被分为4个亚组。7个候选SiCBL基因中, 4个基因(SiCBL1、SiCBL2、SiCBL3和SiCBL5)受干旱胁迫诱导表达,3个(SiCBL1、SiCBL3和SiCBL7)受高盐胁迫诱导表达。SiCBL3基因在干旱胁迫下被强烈诱导可能意味着其在干旱应答中起重要作用。本文报道的谷子CBL基因丰富和完善了植物CBL成员, 为进一步研究CBL/CIPK网络系统在抗逆作物谷子逆境响应中的功能、机制奠定了基础。     

玉米ZmMAPKKK21基因的克隆和生物信息学分析

丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）在植物应对生物和非生物胁迫过程中发挥着重要作用。在前期研究中我们挖掘到ZmMAPKKK21这一潜在的重要抗旱基因,本研究从玉米抗旱自交系J24中克隆获得ZmMAPKKK21基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明,玉米ZmMAPKKK21基因开放阅读框长1419 bp,编码472个氨基酸,是不具有信号肽的亲水性蛋白,且其启动子序列含有多个与逆境胁迫和激素有关的顺式作用元件;玉米中的MAPKKK21蛋白预测定位在细胞核上,蛋白互作预测结果显示,ZmMAPKKK21蛋白与参与植物逆境胁迫相关的MAPKK3蛋白和ZIM家族蛋白发生互作,其结构与高粱（Sorghum bicolor L.）和谷子（Setaria italica L.）等高抗旱禾本科作物相比,不但在STKc＿MAPKKK结构域上高度保守,且具有更加相似的二级结构和三级结构;qRT-PCR分析发现,ZmMAPKKK21基因在玉米根系中表达水平较高,干旱胁迫后该基因在根和叶中表达上调,进一步验证了ZmMAPKKK21基因的表达与干旱胁迫响...     

柠条锦鸡儿CkCDPK基因的克隆、表达分析及载体构建

钙依赖蛋白激酶作为一个关键的信号传导器,通过调控和参与植物体内的代谢途径等方式在植物抵御逆境胁迫过程中发挥着重要作用。为了探索柠条锦鸡儿相关基因的功能,本研究利用同源克隆的方法,从柠条锦鸡儿中克隆了1个CDPK类基因的CDS,命名为CkCDPK。通过测序和生物信息学分析,结果显示,该基因包含1 710 bp的开放阅读框,编码570个氨基酸,分子质量为64.03 ku,蛋白质等电点(PI)为9.12。结构分析显示,CkCDPK含有N端可变区、蛋白激酶区、4个EF手型结构和类似钙调素等结构域。利用实时荧光定量PCR检测了CkCDPK基因在不同逆境胁迫下的表达量,结果显示,NaCl胁迫和干旱胁迫下该基因的表达量呈现出单峰趋势,其中,盐胁迫6 h、干旱胁迫4 h表达量最高,外源ABA诱导下该基因的表达量基本呈逐渐上升趋势。表明该基因可能参与了柠条锦鸡儿的抗逆性调控。构建植物超表达载体pCAMBIA3301-CkCDPK,可为进一步研究CkCDPK基因在柠条锦鸡儿抗逆性调控中的作用奠定基础。     

苹果SnRK2基因家族的鉴定和生物信息学分析

SnRK2（蔗糖非发酵1型相关蛋白激酶2）是植物特有的一类Ser/Thr 类蛋白激酶,参与植物体内多种信号途径的转导,在植物逆境生理过程中扮演了重要的角色。本文利用隐马可夫模型搜索和系统建树的方法,在苹果基因组中鉴定出了16个SnRK2基因家族成员,然后从系统发生、理化性质、二级结构、motif、C末端序列和EST等方面对其进行了预测和分析,并分析了苹果与拟南芥、水稻、玉米等的SnRK2基因家族之间的关系。结果表明,苹果中鉴定的基因与拟南芥、水稻、玉米所有的SnRK2蛋白一起分成了3个亚族。系统发生、motif和C末端序列分析表明,苹果SnRK2蛋白激酶家族具有较高的保守性。本研究为苹果SnRK2基因家族生物学功能的研究奠定了生物信息基础。     

拟南芥NSP家族基因序列分析及响应干旱胁迫表达分析

芥子油苷是十字花科植物中的一种重要的次生代谢产物,它被酶水解的降解过程与植物响应逆境胁迫有关。NSP蛋白是一类能与黑芥子酶结合从而改变芥子油苷降解途径最终生成腈类物质的特异蛋白,其与ESP家族蛋白在功能上存在冗余。本研究以拟南芥NSP家族基因为对象,对家族成员基因序列、蛋白质序列、启动子序列进行生物信息学分析,并使用实时荧光定量PCR技术检测了该家族基因在干旱胁迫下的表达量。结果表明:该家族成员基因分布于3条染色体上,外显子数目2～4个;AtNSP5蛋白亚细胞定位于细胞核,其他成员定位于细胞质;结构域预测显示,该家族蛋白均含有4个Kelch结构域,除AtNSP5外,其他四个成员还含有1～2个Jacalin结构域;启动子序列中均含有CAAT-box、TATA-box核心元件及数量不一的逆境响应元件;干旱胁迫表达量分析显示,该家族中AtNSP5基因受干旱胁迫诱导表达,其他成员响应干旱胁迫不显著。本研究为进一步研究NSP蛋白在植物响应干旱胁迫中的分子机制提供依据,并为植物抗旱基因工程提供潜在候选基因。     

水稻OsGPRP家族基因克隆及其对非生物胁迫的响应

富含脯氨酸和甘氨酸的蛋白基因GPRPs广泛分布于高等植物中,在植物的生长发育和逆境适应中具有重要的作用。为了克隆水稻中的OsGPRP基因,利用生物信息学分析,结合RT-PCR和测序等方法,共获得了3个水稻OsGPRP的cDNA序列,分别编码197,180,170个氨基酸,其蛋白序列均含有3个典型的植物GPRP蛋白保守结构域:N端的XYPP重复、中部富含A的疏水区和C端的HGK重复。为了初步探讨这些OsGPRP基因的功能,利用在线工具Plant CARE database分析,结果发现有3个水稻OsGPRP基因的启动子中包含有许多与植物生长发育、激素和逆境胁迫响应相关的顺式作用元件。为了进一步探究OsGPRP基因在水稻适应非生物逆境胁迫过程中的生物学功能,利用实时荧光定量PCR分析了3个OsGPRP基因在水稻幼苗适应干旱和低温胁迫过程中的响应情况。结果显示,这些OsGPRP基因对干旱和低温胁迫均有不同程度的响应;在干旱胁迫下,这些OsGPRP基因在水稻幼苗不同组织中的表达量均表现出上升的趋势,表达模式较为相似;而在低温胁迫下,其表达模式却存在一些明显的不同,其中,OsGPRP1和OsGPRP3的表达量上升,而OsGPRP2的表达量却下降。结果表明,3个OsGPRP基因在水稻适应非生物逆境中具有重要的作用。     

玉米SAMS家族基因鉴定及其在逆境胁迫下的表达分析

S-腺苷甲硫氨酸合成酶是植物代谢中的一个关键酶,它催化ATP与甲硫氨酸合成S-腺苷甲硫氨酸。利用生物信息学方法系统分析了玉米基因组中的4个S-腺苷甲硫氨酸合成酶(ZmSAMS)成员的参数特征,结果表明4个ZmSAMS成员参数非常接近。不同物种SAMS序列比对及进化分析显示植物SAMS基因在进化过程中具有非常保守的序列和结构。启动子顺势元件预测和蛋白功能分析显示ZmSAMS基因成员可能参与逆境应答、调控转录调控、信号转导、免疫应答等生理生化过程。随后的Real-time PCR验证了ZmSAMS家族基因成员参与了干旱、高温、低温、盐和ABA等逆境胁迫应答。因此推测玉米ZmSAMS基因可能在玉米的逆境胁迫应答中起一定作用。本研究为进一步阐明玉米ZmSAMS家族基因在逆境应答中的功能、机制提供了有益线索。     

芒果转录因子NAC的克隆与表达模式分析

NAC转录因子在植物生长发育、信号传导和逆境胁迫应答方面起重要的作用。本研究根据芒果c DNA-SCo T差异显示中发现的c DNA片段设计特异引物,通过改良RACE技术得到了芒果NAC基因的全长c DNA序列。序列分析显示,该c DNA全长为1 167 bp,开放阅读框长度为1 002 bp,编码334个氨基酸,推测其分子量为37.41 k D,等电点为8.76,属于NAM基因家族,命名为Mi NAC。利用实时荧光定量技术对Mi NAC基因在芒果4℃低温胁迫、盐胁迫和PEG-6000胁迫后0、24 h、48 h和72 h时叶片和茎中表达模式进行分析,实验结果显示,这三种逆境处理均诱导芒果Mi NAC基因的表达,其中Mi NAC基因对4℃低温胁迫响应程度最高,其次是PEG胁迫和盐胁迫。结果表明,该基因参与了芒果逆境胁迫的分子调控。     

芒果MiCO基因逆境胁迫下表达模式分析及转基因株系的获得

CONSTANS(CO)基因是调控植物开花光周期途径的关键基因,近来有研究发现其与植物的逆境胁迫也有关。目前CO参与植物逆境胁迫的作用尚不清楚。为了探究CO在芒果逆境胁迫中的功能,我们利用实时荧光定量技术对MiCO基因在芒果2℃低温胁迫、盐胁迫和PEG-6000模拟干旱胁迫后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h的表达模式进行分析。结果显示,这三种逆境处理均诱导芒果MiCO基因的表达,其中盐胁迫处理条件下MiCO基因的表达水平上调,2℃低温和PEG胁迫条件下MiCO基因的表达水平下调。说明该基因参与了芒果逆境胁迫的调控。为了验证MiCO基因在芒果逆境胁迫中的功能,本研究构建了MiCO超量表达载体,将MiCO基因转化到拟南芥中,获得阳性植株,经过三代筛选得到了纯合株系,为进一步验证MiCO基因在逆境胁迫中的作用提供实验材料。     

木薯MeSnRK2-1基因克隆及表达分析

蔗糖非发酵型蛋白激酶SnRKs在植物应对非生物胁迫的过程中具有非常重要的功能。本研究利用PCR技术从木薯栽培种KU50中克隆得到一个SnRK2家族基因,命名为MeSnRK2-1,对其进行了序列比对和进化树分析,并利用荧光定量技术对该基因在多种处理下的表达模式进行分析。结果表明,该基因的开放阅读框全长为1 062 bp,编码354个氨基酸,进化树分析显示MeSnRK2-1与橡胶树和麻疯树中的同源蛋白亲缘关系较近。此外,荧光定量结果表明MeSnRK2-1在转录水平受到高盐胁迫、H2O2和低温的诱导作用的同时也受到了ABA和甘露醇的抑制作用。这些结果表明MeSnRK2-1在多种非生物胁迫下的信号转导通路中可能具有重要的功能。本研究为后续深入探索MeSnRK2-1的功能以及木薯的逆境生理提供理论和物质基础。     

烟草SnRK2基因家族的克隆及表达分析

农作物生产过程中会面临多种非生物胁迫的影响,会极大地影响作物的产量以及品质。非生物胁迫形式多种多样,干旱胁迫是其中一种主要形式。烟草是重要的经济作物,主要在中国西南地区种植,但经常会遭受极端干旱胁迫。Sn RK2基因家族参与植物抗旱过程,能够受逆境胁迫诱导表达,这种表达是SnRK2基因家族功能的重要体现。为了进一步研究烟草SnRK2家族基因的功能,本研究克隆了烟草SnRK2基因家族GroupⅠ的基因,并检测了烟草SnRK2基因家族的组织表达特异性及诱导表达特异性。结果表明,烟草SnRK2基因中Ntab0922420基因的表达量最高,同时烟草SnRK2基因家族成员更容易在茎与叶中表达。烟草经过低温、盐、干旱胁迫以及ABA处理后,部分SnRK2基因成员表现出受胁迫诱导,其中ID为Ntab0894060的基因受干旱显著诱导。这些工作将为研究烟草SnRK2基因家族功能鉴定基础,并为培育抗逆烟草品种提供遗传资源。     

木薯MeCIPK1基因克隆及表达分析

CIPK蛋白是一类植物特有的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,已在多个物种中被证实参与逆境胁迫应答。本研究利用PCR技术从木薯栽培种KU50中克隆得到一个CIPK家族基因,命名为Me CIPK1,该基因的开放阅读框全长为1 137 bp,编码379个氨基酸。生物信息学分析表明Me CIPK1蛋白含有CIPK家族保守的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域和NAF结构域,与橡胶树和麻疯树中的氨基酸序列同源性最高。利用荧光定量PCR研究Me CIPK1在多种处理下的表达模式,结果表明Me CIPK1在转录水平受到ABA、高盐胁迫、干旱胁迫和低温的抑制作用,同时受到氧化胁迫的诱导作用,故此推测Me CIPK1在木薯应答多种非生物胁迫的过程中可能会发挥重要作用。本研究结果为后期深入分析木薯Me CIPK1基因的功能提供理论基础。     

黑果枸杞LrDREB1基因克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

DREB(Dehydrate responsive element binding factor)转录因子是植物非生物逆境适应中的关键调节因子,该类转录因子具有保守的AP2/EREBP结构域,在低温、高盐等非生物逆境胁迫下,可调控下游逆境应答基因的表达,对增强植物的抗逆能力有重要作用。黑果枸杞具有极强的耐干旱、盐碱能力,为研究黑果枸杞DREB类基因在低温、盐碱响应中的功能,本研究以强抗盐灌木黑果枸杞总RNA为模板,基于前期转录组测序拼接序列,利用RT-PCR方法克隆得到一条DREB基因。该基因含有一个1116 bp的开放阅读框,编码372个氨基酸。系统进化树分析显示,Lr DREB1基因属于DREB亚家族A2组成员,与拟南芥AtDREB2B、AtDREB2E具有较高的相似性。荧光定量PCR结果显示,Lr DREB1受盐胁迫、ABA胁迫和低温胁迫诱导表达,可能参与依赖ABA的信号转导途径,调节黑果枸杞抗盐响应。本研究通过对黑果枸杞LrDREB1基因的克隆、序列分析和表达分析,为研究Lr DREB1的功能及黑果枸杞抗盐机理提供了帮助。     

甘蔗ABA信号转导关键酶SoSnRK2.1基因的克隆与表达分析

蔗糖非酵解型蛋白激酶(SnRK)是植物体内ABA信号转导途径的关键调控酶, 在植物的抗逆境生长过程中发挥着重要的作用。本研究通过RT-PCR和RACE-PCR技术克隆出编码甘蔗SnRK2蛋白的基因SoSnRK2.1。该基因cDNA序列全长为1385 bp, 包含一个1002 bp的开放阅读框(ORF)。根据氨基酸序列预测SoSnRK2.1基因编码333个氨基酸残基, 与其他高等植物中相关蛋白的氨基酸具有高度的相似性, 尤其是与禾本科的玉米和水稻。构建该基因的原核表达载体pET-SoSnRK2.1, 在IPTG诱导下可得到38 kD 左右的蛋白, 与理论值一致。实时荧光定量PCR分析表明, SoSnRK2.1基因在ABA、干旱(PEG)+ABA、干旱(PEG)、NaCl、低温(4℃)和H₂O₂外源胁迫下均呈诱导表达的趋势。推测该基因参与调控干旱、高盐和低温等胁迫过程, 在甘蔗抗逆境胁迫中起重要作用。