枯草芽孢杆菌诱变育种研究进展

枯草芽孢杆菌由于可以合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多种有利于提高生物产品利用率的酶类,而在食品、饲料行业备受青睐。近年来,通过诱变提高产酶效率在工业微生物育种方面取得极大进展,然而在诱变过程中,各种诱变剂的作用原理、作用规律及不同诱变剂之间的相互作用,有色代谢产物积累,菌体活性及敏感度等对诱变成功率起决定性作用的因素却未被人们重视。对紫外诱变、化学诱变和复合诱变的作用原理、影响因素进行研究性总结,以期为工业枯草芽孢杆菌诱变提供依据。     

原生质体诱变选育高纤维素酶活性枯草芽孢杆菌的研究

采用紫外诱变、化学诱变(DES诱变)及复合诱变的方法对产纤维素酶枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B6的原生质体进行诱变,选育出10个高纤维酶活突变株.摇瓶发酵试验结果表明,所选突变株酶活都显著高于B6,其中,紫外诱变处理的突变株Z12,化学诱变得到的突变株H1以及复合诱变处理的突变株F12的产酶能力相对较强,且产酶能力稳定,酶活值分别为448.3,450.9,491.8 U/mL,分别为对照的176%,178%,194%.试验结果说明,对枯草芽孢杆菌的原生质进行诱变可以提高菌株产纤维素酶的能力,而原生质体的复合诱变可提高诱变效应.     

拮抗灰霉病菌的芽孢杆菌筛选、鉴定及其代谢产物抑菌效果研究

筛选获得对灰霉病菌具有抑制活性的芽孢杆菌菌株,明确其胞外抑菌物质的活性及稳定性,为灰霉病提供安全、高效、易行的生物防治方式,并为其后续生防制剂的研发提供科学依据。采集我国云南、黑龙江、新疆、河北等地蔬菜种植土壤样品129个,采用稀释涂平板法分离获得芽孢杆菌4 200株,采用平板对峙法获得191株具有灰葡萄孢菌拮抗性能的菌株,其中菌株KA4的抑菌能力最强,对灰霉病菌的抑菌率为65.34%。采用形态学、生理生化特征以及16S rDNA和gyrB基因序列分析相结合的鉴定方法进行了KA4菌株的鉴定,将其鉴定为解淀粉芽孢杆菌,命名为BA-KA4。BA-KA4的无菌发酵液具有较强的抑菌活性,稀释10,20,40倍的无菌发酵液对灰葡萄孢菌的抑菌率分别为78.83%,65.19%,45.38%。通过单因素法测定了不同处理温度、pH值和紫外照射时间对BA-KA4无菌发酵液抑菌活性的影响,该菌株的无菌发酵液具有良好的温度、pH和紫外线稳定性。综上,解淀粉芽孢杆菌BA-KA4能够抑制灰霉病菌生长、胞外抑菌物质活性稳定,可作为灰霉病生物防治的优良微生物资源,具有良好的开发前景。     

产类黄酮链霉菌的紫外线诱变选育

诱变选育高产类黄酮链霉菌菌株,采用不同强度的紫外线对出发菌株链霉菌HNS2-2单孢子悬液诱变处理。以出发菌株作为对照,分光光度法测定诱变菌株发酵产物黄酮类物质含量为评价指标,进行反复筛选。在20 W紫外灯、辐射距离30 cm、照射20 s条件下,获得高产菌株251,其黄酮类物质产量达41.87μg/mL,比出发菌株提高15.52%,且连续7次传代稳定性能稳定。通过紫外诱变选育的方法,能提高出发菌株黄酮类物质产量。     

β-甘露聚糖酶高产菌株的紫外线诱变选育

为给生产实践提供具有更高产酶量的优良菌株,本研究以实验室保藏的一株地衣芽孢杆菌HDYM-04为原始出发株,经自然筛选、紫外线诱变,选育出一株β-甘露聚糖酶高产菌株U2-12。结果表明：依据致死率所选用的最佳诱变剂量为照射距离50 cm,照射时间为10 s,此时,菌株的总突变率为76.11%,正突变率为54.60%,负突变率为20.92%,地衣芽孢杆菌U2-12的产β-甘露聚糖酶能力是原始未紫外线诱变的出发株的242.19%,其遗传性状稳定。本研究可以为后续试验及生产实践提供优势产酶菌株,并为研究紫外线对β-甘露聚糖酶产酶基因的影响提供先决条件。     

类芽孢杆菌YS-1化学成分及其抑菌活性研究

为研究类芽孢杆菌YS-1发酵液抑制柑橘采后两种主要病原菌-意大利青霉(Penicillum italicum)和指状青霉(Penicillium digitatum)的活性成分,本研究对YS-1发酵液抑菌成分进行了靶向分离研究。YS-1发酵液离心去除菌体后,采用正丁醇萃取得到粗提物,硅胶和Sephadex LH-20凝胶柱层析对粗提物进行分离;赣南脐橙活体损伤接种验证分离得到的化合物及其糖苷的抑菌活性。从粗提物中分离得到一个单体化合物,通过质谱,核磁共振H谱(~1H-NMR)、C谱(~(13)C-NMR)和二维核磁共振谱(2D-NMR)等方法鉴定其结构为胞嘧啶。抑菌结果表明胞嘧啶及胞嘧啶核苷均有一定的抑菌效果,但是胞嘧啶抑菌效果较好,表明胞嘧啶为类芽孢杆菌YS-1的一个主要抑菌活性成分,为生防菌类芽孢杆菌YS-1控制柑橘采后病害的开发和利用提供了基础。     

多粘类芽孢杆菌生物特性及其机理研究进展

多粘类芽孢杆菌具有多种可利用的生物特性,本研究归纳了近年来前人有关其在基因、代谢活性物质和机理方面的研究成果。多粘类芽孢杆菌不仅在多肽蛋白、酶、功能性多糖及其他代谢活性物质上研究深入,而且在植物促生、潜在生物医药应用等领域的机理研究也有所突破。然而,在其微生态、代谢活性物质结构和功能关系以及深入的分子机理研究仍显不足。通过对多粘类芽孢杆菌的基因水平、代谢产物和作用机制的研究进展进行了综述,并对其在今后的研究进行展望。     

芽孢杆菌GSBM05对葡萄白腐病菌的抑菌活性及其鉴定

旨在从土壤中分离筛选出对葡萄白腐病菌有强烈抑制作用的芽孢杆菌,检测其抑菌活性并进行鉴定。采用稀释平板法从土壤中分离芽孢杆菌,利用对峙培养和菌丝生长速率等方法对抑菌活性较好的芽孢杆菌GSBM05进行初步研究。结果表明,在土壤样品中共分离出40株芽孢杆菌,经初筛、复筛后得到1株具有强烈抑制效果的芽孢杆菌GSBM05。该菌株稀释20倍的无菌发酵液对孢子萌发和菌丝生长抑制率均在90%以上,发酵液不同组分对葡萄离体果实、叶片的防治效果均可达80%以上。该菌株对葡萄白腐病菌等11种植物病原菌具有良好的拮抗作用。通过形态观察、生理生化鉴定以及16S r DNA序列分析,确定该菌株为甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)。实验结果表明,甲基营养型芽孢杆菌GSBM05具有良好的抑菌活性,抑菌谱较广,可为葡萄白腐病生物防治提供新资源。     

欧盟宣布延长24种临期农药活性物质有效期

<正>近日,欧盟发布公告Commission Implementing Regulation 2018/524,该公告决定将2018年4月30日到期的24种农药活性物质的有效期延长至2019年4月30日,同时对欧盟批准的农药活性物质清单(EU)No.540/2011进行了相应的修订。该决定已于2018年4月1日正式生效。有效期延长的24种活性物质分别为:枯草芽孢杆菌、炔草酯、二氯吡啶     

一种高产L-赖氨酸枯草芽孢杆菌的构建研究

为了选育一种非抗性、高产出、遗传稳定性好、低生产成本的L-赖氨酸生产菌株,以辣椒花药和枯草芽孢杆菌为试验材料,以穿梭表达载体pHT43和基因敲除载体pK18mobsacB为媒介,将辣椒花药中的高赖氨酸基因CFLR转化到枯草芽孢杆菌中。经过2次细胞内同源交换和培养基筛选,最终获得不带质粒抗性标记的高产L-赖氨酸枯草芽孢杆菌株CMCC(B)63501/pK18mobsacB-ΔALA::CFLR,该菌株连续传代20次后仍具有明显高于野生型的CFLR基因拷贝数,经HPLC验证,重组菌株L-赖氨酸含量比野生菌株提高了64.89%。结果表明,本研究所构建的非抗性高产L-赖氨酸枯草芽孢杆菌株产量高、遗传稳定性好、低纯化成本,具有良好的应用潜力。     

短短芽孢杆菌JK-2(Brevibacillus brevis)胞外物质抗香蕉枯萎病菌的稳定性

研究温度、光照、紫外辐射、蛋白酶K、pH对生防菌短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)JK-2胞外物质抗香蕉枯萎病菌稳定性的影响,为香蕉枯萎病生防菌剂的研制提供理论依据。在30℃,170r/min的条件下,恒温振荡培养36h采样制备生防菌短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)JK-2胞外物质,以香蕉枯萎病菌为指示菌,对胞外物质的抑菌特性进行研究。结果表明:该胞外物质具有一定的热稳定性,60~80℃温育1h保持88.5%以上活性,在100℃放置1h后无抑菌活性;在酸性pH3.0~5.0和碱性pH9.0~11.0条件下,抑菌活性保持在77.2%以上,对光照、蛋白酶K、紫外照射均不敏感。其抑菌作用的最适温度为30℃,最适pH为7.0。     

香蕉炭疽病生物防治研究进展

香蕉炭疽病是香蕉采后一种重要病害,生物防治香蕉炭疽病成为研究的热点。此文介绍了香蕉炭疽病的主要症状及概述了两种不同方式对香蕉炭疽病进行生物防治。其一,利用生防菌（如枯草芽孢杆菌,假单胞杆菌,链霉菌等）对香蕉炭疽病进行生物防治,生防菌主要是对香蕉炭疽菌菌丝的生长,孢子萌发,附着孢的形成有影响。其二,从植物中提取活性物质对香蕉炭疽病进行生物防治,其中艾蒿、大茴香、丁香、花椒、桂圆等植物的活性物质对香蕉炭疽病有明显的抑制作用。最后,提出生物防治香蕉炭疽病存在的问题及展望。     

芽孢杆菌生物防治植物病害研究现状

应用芽孢杆菌防治植物病害非常广泛。此文主要综合评述了芽孢杆菌防治植物病害现状和遗传改良研究进展,阐述了芽孢杆菌防治植物病害的主要作用机制,主要包括拮抗作用、竞争作用、诱导植物产生系统获得抗性和促进植物生长等4个方面。最后说明了利用芽孢杆菌防治植物病害存在的问题及展望。     

拮抗细菌GF-312的复合诱变选育

为了提高已筛选出的拮抗菌株的抑菌活性,以荧光假单胞菌(Pseadomonas fluorescens)GF-312为出发菌株,采用紫外线和微波方法对其进行复合诱变,通过对致死率、正突变率和抑菌活性的测定,确定紫外线和微波诱变的最适时间,结合对诱变菌株的传代稳定性测定,获得高效菌株GF-16,其发酵液的抑菌圈直径达到30.4 mm,抗菌活性比紫外诱变之前（自然选育之后）的菌株GF-51提高了18.8%。     

臭豆腐菌种鉴定 发酵及气味成分分析

从臭豆腐的发酵浸泡液中分离菌种,获得了2种主要细菌。分离纯化、鉴定后,初步确定细菌为乳杆菌属短乳杆菌和芽孢杆菌属环状芽孢杆菌。这2种菌是臭豆腐发酵过程中的主要菌种,为更好地开发利用,重点对乳杆菌和芽孢杆菌进行种类鉴定、发酵液pH值、培养温度、培养时间等研究,得出最适培养条件为pH值6．8、培养温度40℃、培养时间6d。     

纳豆中γ-PGA的分离纯化和鉴定

采用野生和诱变的纳豆枯草芽孢杆菌菌株,经固体发酵生产γ-PGA,比较了得率和纯度的差异。通过乙醇沉淀、离心和真空冷冻干燥方法对γ-PGA进行分离纯化,并采用薄层层析的方法鉴定,选择不同分配剂的配比和不同的载体,获得了最佳层析步骤。     

产胞外淀粉酶枯草芽孢杆菌的分离筛选及其紫外诱变育种

为提高枯草芽孢杆菌产生淀粉酶能力,从养虾池、混养池及污染河流的底质活性污泥中分离到12株枯草芽孢杆菌,通过淀粉降解试验筛选到产酶能力较高的菌株H4和H5,菌株淀粉酶活性分别为38.66,37.10 U/mL.以筛选到H4和H5为原始菌株,采用紫外诱变的方法对H4和H5进行连续诱变筛选产淀粉酶高的突变株.结果发现,第一次诱变后突变株的酶活分别为原始菌株的107%和111%;经过第二次诱变后,H4的突变株H4 Ⅱa,H5的突变株H5Ⅱa和H5Ⅱb的产酶能力有很大程度的提高,分别为原始菌株的147%,136%和135%,酶活达56.95,50.47和50.02 U/mL,说明紫外连续诱变有利于突变株产酶能力的提高.     

枯草芽孢杆菌ON-6菌株抑制荔枝炭疽菌活性物质的初步研究

为了探索枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）对广西重要的药食两用水果--荔枝采后病害的防治效果及其机制,本文在进行采集、分离、筛选和鉴定的基础上,对枯草芽孢杆菌ON-6菌株发酵液提取拮抗物质方法、拮抗物质的理化性质等方面进行了研究。对ON-6菌株发酵液采用浓盐酸沉淀法及硫酸铵沉淀法,得到的提取液均有抑菌活性,表明ON-6菌株能产生能蛋白类和脂肽类抗生物质。对该菌株的蛋白粗提液进行30~60℃处理30 min,其活性保持不变,121℃处理20 min,活性丧失不足原有的40%;作用活性pH值在5.0~8.0范围内;对胰蛋白酶不敏感,对蛋白酶K和胃蛋白酶部分敏感;对紫外线不敏感。     

不同溶剂提取菌草竹荪抑菌活性物质的初步研究

以菌草竹荪7种不同溶剂的提取物为供试药剂,采用琼脂平板打孔法测定其对啤酒酵母 (Sac-charomyces cerevisiae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的抑制作用,以期探索提取菌草竹荪抑菌活性物质的最佳溶剂。结果表明,菌草竹荪2种不同溶剂的提取物对枯草芽孢杆菌都有较强的抑制作用,其中甲醇提取物的抑菌活性相对较强,抑菌圈直径可达38.56 mm,乙酸乙酯提取物次之,抑菌直径为31.66 mm。鉴于不同溶剂提取物的提取效率和抑菌效果的高低,乙酸乙酯为提取菌草竹荪抑菌活性物质的最佳溶剂。     

枯草芽孢杆菌RSS-1菌株产生抗菌物质条件的优化

为明确枯草芽孢杆菌RSS-1菌株产生抗菌物质的最佳条件,提高其抗菌活性物质的产量,以发酵液抑制油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)活性为指标,在摇瓶条件下采用单因素和正交实验对该菌株的最适发酵培养基成分及发酵条件进行了优化。结果表明,菌株RSS-1产生抗菌物质的最佳培养基组分比例为2.0%的玉米淀粉,1.5%的蛋白胨,0.05%的MgSO_4;最佳发酵条件为培养基初始pH 6.0,培养温度为28℃,培养时间为5天,100 mL三角瓶装液量25 mL,接种量为0.1%,转速为180 r/min。优化后的枯草芽孢杆菌RSS-1菌株的无菌培养滤液对油菜菌核病菌的抑菌活性显著增强。