贵州省优质水稻‘大粒香’香味基因分子标记的开发

‘大粒香’香味形成是由Badh2基因第7个外显子的8 bp缺失和3 bp突变引起。为了建立了‘大粒香’香味基因的快速准确的检测方法,本研究根据‘大粒香’和‘日本晴’Badh2基因序列的差异,设计了7条引物组合成11对功能标记检测引物,通过对引物组合扩增的产物进行电泳检测,筛选出最佳的引物组合。试验结果表明,开发设计的引物能够准确的检测出香味基因,PCR反应的最佳退火温度为60℃,其中BADH2-F1+BADH2-R+badh2-R2引物组合能准确区分非香基因纯合体、香味基因纯合体以及杂合体三种基因型。基于该功能引物引物组合BADH2-F1+BADH2-R+badh2-R2可以快速开展香味基因的MAS育种。本研究结果将有助于利用Badh2基因位点的分子标记培育香型优质水稻品种,为改良贵州省水稻品种的香味品质提供了技术支撑。     

48份水稻骨干材料香味及Badh2变异类型的鉴定

为促进香稻育种,明确水稻重要种质资源中香味基因的存在情况,本研究将传统香味鉴定方法(KOH浸泡法)与分子标记技术相结合,对48份水稻骨干材料的香味及香味基因Badh2变异类型进行鉴定。结果表明,在48份供试材料中,利用KOH浸泡法检测到具有香味的材料有44份;利用香味基因Badh2的7种等位基因变异类型功能标记检测到含有香味的材料有43份,其中,有41份为纯合香型,2份为杂合型,等位基因Badh2-E2的变异类型有37份,等位基因Badh2-E7的变异类型有6份,未检测到等位基因Badh2-E4-5、Badh2-E12、Badh2-E13、Badh2-UTR和Badh2-Pro的变异类型。通过比较KOH浸泡法与分子标记技术,发现仅有1份材料检测结果不同,明水香稻(X23)用KOH浸泡法检测出具有香味,但本研究所用的Badh2的7种等位基因变异类型功能标记却未检测出含有香味,说明该材料可能属于Badh2其他已报道的或新的等位基因变异类型,也可能是含有新的香味基因。     

基于功能性分子标记鉴定香味杂交粳稻亲本

香稻是由于水稻种水稻甜菜碱醛脱氢酶(BADH2)基因的功能缺失突变引起的。根据香味等位基因badh2的功能性突变位点设计的功能性分子标记,为快速鉴定具有香味的水稻种质资源提供了可能。本研究利用香味等位基因badh2-E2和badh2-E7的功能性分子标记InDel-E2和InDel-E7鉴定了33个杂交粳稻不育系和35个杂交粳稻恢复系材料的基因型,获得了12个含有badh2-E2等位基因不育系和4个含有badh2-E7等位基因恢复系材料。在此基础上,分别选择了3个不育系和3个恢复系,配制了5个全香型的杂交粳稻,为香味杂交粳稻的推广应用提供了理论依据。     

广西香稻Badh2基因两种功能标记的开发

水稻的香味是一种重要的食味品质性状,是水稻第8号染色体Badh2基因突变导致其功能缺失,引起芳香活性物质2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)的积累从而产生香味。Badh2基因至少存在18个等位突变位点,利用等位突变位点辅助培育香稻被证明是一个有效手段。传统Sanger测序法和SSR分子标记PCR电泳分析进行位点检测效率较低。为了开发效率更高的检测方法,本研究利用了实时荧光PCR检测技术对广西地方常见的水稻突变荧光分子标记。对40份广西地方香稻的Badh2基因进行直接测序,发现这些香稻的Badh2基因主要存在两种突变,第4、5外显子806 bp缺失(badh2-E4-5.1)和第7外显子8 bp缺失(badh2-E7)。针对这两种突变类型设计实时荧光PCR检测方法,并对已测序的40份香稻进行验证,实时荧光PCR检测的准确性达到93.75%。进一步对50份地方品种进行香味基因型分型鉴定,其中24份香稻为badh2-E4-5,22份香稻为badh2-E7。本研究针对广西地方香稻品种的主要两种突变类型,设计开发了这两种等位基因的荧光分子标记,适用于香稻基因型的鉴定筛选,对香稻育种具有重要的现实意义。     

‘泰国小香占’香味基因的鉴定和功能分子标记的开发

香稻育种已成为当前杂交水稻育种的一个重要方向,选择和利用株型好、米质优、抗性强等综合性状优良且具有香味的水稻亲本,尤其是香型水稻恢复系亲本的利用,对进一步促进杂交水稻香稻的选育具有重要意义。‘泰国小香占’是目前国内水稻香稻育种中应用较广且综合性状优良的恢复系亲本,其米质优、抗性强、香味浓。为了探究‘泰国小香占’香味产生的原因,本研究鉴定了‘泰国小香占’的香味基因及其突变类型,发现其香味来源于编码甜菜碱脱氢酶基因Badh2的功能缺失突变,且通过对该基因完整基因组序列扩增和测序分析发现其等位突变类型为badh2-E7类型,即在第7外显子处存在8 bp缺失和3个单核苷酸位点多态性突变(SNPs)。通过气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)测定其籽粒中香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)的含量为0.108 mg/kg,明显高于非香味品种‘日本晴’和‘9311’的含量(0.01 mg/kg)。实验还证明了特异性分子标记FMbadh2-E7、InDel-E7以及自主开发设计的特异性功能标记FMbadh2-E7A和FMbadh2-E7B均可高效、准确鉴别出非香纯合(Badh2/Badh2)、非香杂合(Badh2/badh2)和香味纯合(badh2/badh2) 3种基因型。同时本研究还进一步通过对‘泰国小香占’和非香味水稻品种杂交F2代单株进行了基因型和遗传规律分析,发现其基因型Badh2/Badh2:Badh2/badh2:badh2/badh2的比例为1∶2∶1,符合孟德尔细胞核单基因控制分离比。本研究通过对‘泰国小香占’香味基因的鉴定、遗传特性分析以及特异性功能分子标记的开发和验证,为进一步通过分子标记辅助选择育种技术,应用‘泰国小香占’香味基因培育优质、高产且抗性强的杂交水稻香稻提供了重要的理论基础。     

两种筛选水稻badh2-E2类型香味基因分子标记的建立

本研究根据香味基因(badh2-E2)与非香基因(Badh2)在第2外显子7个脱氧核苷酸序列缺失差异,建立了一个新的STS分子标记和检测方法;并根据badh2-E2与Badh2+310 bp位点脱氧核苷酸的差异性,建立一个新的CAPS(EheⅠ)分子标记和检测方法。结果显示:建立的STS分子标记与前人的报道相比扩增的条带更小,只有100 bp左右,能够更加清晰地鉴别出香与非香基因型之间的差异;而建立的CAPS(EheⅠ)分子标记,纯合非香稻可获得长度为292 bp和375 bp两条带,纯合香稻可获得长度为667 bp一条带,杂合F1植株可获得长度为292 bp、375 bp和667 bp3条带,对于不同基因型检测结果的判断效果更明显。采用本研究建立的方法能够提高水稻badh2-E2类型香味基因选择效率。     

利用CRISPR/Cas9技术编辑Badh2基因改良粳稻香味

CRISPR/Cas9基因编辑技术已经成为水稻育种新型手段,香稻育种一直是水稻育种行业的研究热点,水稻香味主要由8号染色体上的甜菜碱脱氢酶基因Badh2控制。为了改良原有品种的香味性状,促进香稻育种的发展,以非香型粳稻品种东农425为试验材料,构建了2个CRISPR/Cas9敲除载体对Badh2基因进行定点编辑,第1个载体(p YLCRISPR/Cas9-B1-gRNA)的2个靶点分别位于第2和第3外显子上,第2个载体(p YLCRISPR/Cas9-B2-gRNA)的2个靶点均在第2外显子上。采用农杆菌介导法对东农425进行遗传转化,成功获得了T0纯合植株,并对其衍生出的T1植株进行T-DNA元件检测,共获得8个突变类型不同且不含有转基因成分的纯合突变株系。同时采用咀嚼法和氢氧化钾浸泡法对这8个纯合突变株系的水稻籽粒进行香味检测,结果表明,8个Badh2株系均具有不同程度的香味,总体上载体p YLCRISPR/Cas9-B1-gRNA编辑的3个株系的香味更为浓郁。对这8个纯合突变株系的主要农艺性状进行考察,发现突变株系的穗数、穗粒数、结实率及千粒质量与野生型相比均没有明显差异。综上,本研究对东农425的Badh2基因成功地进行了编辑,并获得了香味显著提高且无转基因成分的纯合突变体材料,为加快香型粳稻品种的培育提供了技术支持。     

不同香味等位基因粳稻的分子和香味特性研究

利用水稻甜菜碱醛脱氢酶Badh2基因的两个外显子缺失标记引物从60份优质常规粳稻中筛选到11份香稻材料,对其分子基础和香味特性进行分析。追踪香稻系谱,发现外显子7缺失的材料其香味可能与籼稻种质有关。进一步利用第8染色体上37对SSR引物分析11份材料遗传基础,结果有20对呈现多态且检测到64个等位基因变异,平均等位基因数目为3.2个。聚类分析发现苏香粳1号和苏香粳2号归为一类且与其他材料遗传距离较远;对两品种感官评价发现幼苗植株和米饭香味特性均表现突出。利用半定量RT-PCR检测幼苗植株香味基因的表达量,发现不同品种幼苗地上部表达各异,且根部有香味基因不同程度的表达。研究结果为了解粳稻品种的香味特性和香稻育种提供了一定依据。     

基于PCR/LDR技术的水稻香味等位基因Badh2-E2功能性分子标记

水稻中水稻甜菜碱醛脱氢酶(BADH2)功能缺失导致其酶促反应的底物2-乙酰-1-吡咯啉(2AP)的累积,使得稻米产生香味。水稻香味等位基因badh2-E2在中国的香稻育种中有较广泛的应用。本研究根据badh2-E2香味等位基因在第二外显子处7 bp缺失,设计了一个基于PCR/LDR技术的功能性分子标记。利用PCR/LDR标记对‘申繁24’、‘申恢26’,及其杂交F_1代的基因型进行鉴定,可以准确地鉴定出badh2-E2位点的基因型。用PCR/LDR标记对杂交F_2代群体的基因型进行鉴定,发现badh2-E2阳性纯合型、杂合型和badh2-E2阴性纯合型这3种基因型符合1∶2∶1分离比。本研究结果为标记辅助育种提供了一种新的标记类型,具有一定的应用价值。     

等位基因特异扩增在水稻香味遗传改良中的应用价值

常规育种方法培育香型水稻除了育种年限长,且在后代材料选择过程中,香味基因往往容易丢失。而通过回交转育手段将香味性状导入优良的非香型水稻品种中,则要寻找出一种高效的分子检测手段加以辅助鉴定。本研究以稻花香2号、金禾香稻、南韩长粒香、黑香米,以及8个非香稻品种(品系)为试验材料,利用等位基因特异扩增方法对水稻香味基因进行鉴定。结果表明,南韩长粒香、黑香米及非香稻获得长度为585bp和355bp的两条带,而稻花香2号、金禾香稻仅获得长度为577bp的一条带,供试材料的分子检测结果与香味基因型不完全一致,这在一定程度上限制了等位基因特异扩增法在水稻香味遗传改良中的应用。     

水稻Wx复等位基因基于PCR的功能标记开发与利用

直链淀粉含量是影响稻米食味品质的重要因素,主要由蜡质基因(Wx)调控,Wx基因座存在Wxa、Wxb、Wxin、Wxmw等多个复等位基因,通过分子标记辅助选择(marker-assisted selection,MAS)培育中低直链淀粉含量的水稻品种是提高稻米适口性的重要途径。Wx复等位基因的功能由单碱基核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)决定,其检测依赖于测序或酶切,存在耗时多、费用昂贵等缺点。为提高选择效率,本文利用Wx复等位基因的SNP差异和四引物扩增受阻突变(tetra-primer ARMS-PCR)原理,进行PCR功能标记的开发。引物设计过程中,针对扩增效率低和非匹配的延伸2个技术难题,提出了调整错配位点的解决方案,成功开发了基于PCR技术的两对功能性标记Waxygt-ARMS2和Waxyac-ARMS2,可以准确区分上述复等位基因型,且具有操作简单、耗费较低的特点。利用新开发标记对辽宁省育成的部分水稻品种进行Wx基因型检测的结果表明,40份辽宁育成品种均携带Wxb基因,遗传基础单一。上述结果为利用Wx基因位点的分子标记培育中低直链淀粉含量的水稻品种,改良辽宁省水稻品种的食味品质提供了技术支撑。     

不同来源水稻种质资源香味基因badh2位点的鉴定

发掘和利用香稻基因资源是开展优质香稻品质改良的首要条件。本研究利用水稻香味功能基因分子标记,结合传统的味觉和嗅觉鉴定法,分析了不同来源不同类型的323份水稻种质的香味性状。研究结果表明:利用分子标记技术和谷粒咀嚼品尝是快速、准确鉴定水稻香味性状的优选策略;香味基因badh2位点频率在印度尼西亚和泰国的籼稻中达到68.2%以上,在美国、俄罗斯和意大利的粳稻中较低,在云南、缅甸、老挝和尼泊尔的普通野生稻中没发现;在发现的具香味性状的86份种质中,极大部分种质的香味性状受badh2等位基因控制,但有6份的香味性状可能不受badh2等位基因控制。这些香稻基因资源将是下一步开展稻米香味遗传分析以及香米品种改良的重要基础。     

水稻种质资源香味基因Badh2的分子鉴定及香稻筛选

稻米香味性状是稻米品质的重要评价指标,香稻的培育是提高稻米附加值进而提高农民种粮积极性的有效手段,而香稻育种面临遗传背景来源单一的瓶颈大大制约了香稻的育种进程。发掘和利用香稻种质资源,扩大香稻遗传多样性是解决这一问题的主要途径。本研究利用已知水稻香味基因Badh2的分子标记,分析了来自世界各地的817份水稻种质资源及25份野生稻祖先的Badh2基因型。通过品尝法对具有突变型Badh2的稻米进行了香味性状鉴定,研究结果表明,83份水稻种质资源材料具有突变型Badh2基因,其中包括籼稻52份、粳稻30份、中间型1份;而普通野生稻和尼瓦拉野生稻均为野生型Badh2,表明香味性状是在栽培稻驯化过程中由香味基因Badh2自然突变产生。通过人工咀嚼法对83份具有突变型Badh2的稻米进行了香味性状鉴定,结果表明有28份稻米具有明显的香味,其中籼稻为20份,粳稻7份,中间型1份,并且籼稻香味浓郁程度普遍高于粳稻,推测Badh2受遗传背景影响而导致2-乙酰-1-吡咯啉在籽粒中积累量不同。本研究鉴定的香稻种质资源将为开展稻米香味性状遗传改良提供重要材料支撑。     

基于四引物扩增受阻突变体系PCR快速鉴定水稻 S5基因的籼粳属性

四引物扩增受阻突变体系PCR是一种快速简便检测SNP的方法。基于该技术原理,结合籼型S5i与粳型S5j基因存在的单核苷酸差异设计特异性引物,并用8个籼稻,8个粳稻及4个籼粳杂交后代F1进行PCR扩增检测验证。依据产物的电泳谱带类型,能准确区分出SSi纯合基因型、SSj纯合基因型及杂合基因型3种类型,其扩增带型与基因型完全吻合。这表明所设计引物能很好地对S5基因的籼粳属性进行区分,可广泛应用于水稻种质资源相应目的基因的鉴定,为籼粳杂种优势利用的亲本有效选择和籼粳分化研究提供重要参考。     

香稻种质资源筛选及香味基因遗传研究

本试验采用KOH浸泡法和香味功能标记对144份水稻品种进行香稻种质资源的筛选,同时以2个杂交组合平粳11/黑香稻、吉林日落/黑香稻的F:群体为试验材料,对黑香稻香味基因进行遗传分析。结果表明,用KOH浸泡法筛选时,有20个水稻品种产生香味;用香味基因功能标记GRFM04筛选时,仅有17个含有香味基因。黑香稻,SY-香-7、清香糯用KOH法筛选产生香味,但用功能标记GRFM04检测为不含有香味基因。黑香稻的香味受1对隐性基因控制,在纯合基因型中水稻叶片的香味与米粒的香味呈高度一致性,但在杂合的基因型中,叶片无香的单株,其米粒有无香与有香的分离。     

甘肃高山细毛羊和湖羊HIF-2α基因遗传特性与高原低氧适应性分析

为探讨HIF-2α基因核苷酸序列变异与绵羊高原适应的相关性,以540只(甘肃高山细毛羊200只,湖羊340只)绵羊为研究对象,采用PCR-SSCP技术分析HIF-2α基因第11外显子和内含子部分区段在甘肃高山细毛羊和湖羊中单核苷酸多态性(SNPs)。结果显示:HIF-2α基因扩增片段在2个绵羊品种中共检测到4种等位基因(A、B、C和D)和10种基因型(AA、BB、CC、DD、AB、AC、BC、AD、BD和CD),存在6个SNPs位点,其中外显子11检测到5个SNPs位点(G/A、G/C、C/T、T/C、G/A、),内含子11检测到1个SNPs位点(G/A),甘肃高山细毛羊未检测到DD基因型。2个绵羊品种的优势基因型均为AB,基因型频率分别为34.50%和16.47%。HIF-2α基因在2个绵羊品种中具有丰富的多态性,且等位基因频率在品种间存在极显著差异(P0.01)。推测在高海拔低氧适应过程中,HIF-2α基因的基因型可能受到了选择,随着长期的高海拔低氧环境的选择,有利于低氧适应的基因型在高海拔绵羊品种中受到选择并富集,携带基因型AA、BB和AB的绵羊可能更加适应高海拔低氧环境,而携带基因型CD、BD和DD的绵羊对高海拔低氧环境适应的能力可能较差。     

水稻垩白基因Chalk5功能标记的开发与应用

水稻垩白是衡量水稻外观品质优劣的重要指标之一,降低稻米的垩白是培育优质水稻品种的前提。Chalk5是一个能显著降低稻米垩白从而提高稻米外观品质的主效基因。为提高垩白基因Chalk5在育种中的选择效率,在前人克隆的基础上,根据其启动子区域存在的2个功能突变位点,分别设计等位基因特异PCR(ARMS-PCR)引物,最终筛选出2对Chalk5基因的功能标记Chalk12、NChalk12和Chalk22、NChalk22,通过PCR产物测序的方法对这2对标记的检查结果进行了验证,说明Chalk12、NChalk12和Chalk22、NChalk22可以准确鉴定出Chalk5的不同基因型。利用该标记对不同来源的43份籼稻资源、江苏2007-2013年审定的65份粳稻品种和太湖流域179份粳稻地方资源进行了Chalk5基因型检测,筛选到携带chalk5低垩白率等位基因的籼稻资源20份,太湖流域粳稻地方资源仅8份,其余259份粳型资源中均不携带chalk5低垩白率等位基因,这也说明chalk5主要分布在籼型水稻资源中,在粳型资源中分布很少。     

水稻苗期耐低温基因COLD1新功能标记的设计与验证

籼稻和粳稻在苗期耐低温基因COLD1的第4外显子存在1个功能性单碱基变异SNP2,粳型COLD1 ^Jap等位基因低温耐受性表现更强,具有重要的育种利用价值。通过籼粳杂交,可将粳型COLD1 ^Jap等位基因导入籼稻品种,提高其低温耐受力。为提高COLD1基因的选择效率,根据粳型COLD1 ^Jap与籼型COLD1 ^Ind基因存在的单核苷酸差异,结合扩增受阻突变体系PCR的技术原理设计功能标记。应用5个籼稻品种、5个粳稻品种、1个籼粳杂交F₁个体以及1个籼粳杂交F₂群体对功能标记进行检测验证。结果表明,所设计的功能标记可准确区分纯合粳型COLD1 ^Jap、纯合籼型COLD1 ^Ind和杂合基因型,其扩增带型与基因型完全一致,是一种鉴定COLD1基因的有效方法。该标记弥补了前人设计的衍生型酶切扩增多态性序列功能标记费用昂贵、操作复杂及费工费时等不足,可广泛应用于水稻COLD1基因的资源鉴定和分子标记辅助选择育种。     

利用CRISPR-Cas9技术编辑Badh2基因创制优质香型籼稻三系不育系

稻米香味是水稻的重要食味品质之一,其主要受第8染色体上编码甜菜碱脱氢酶基因Badh2控制,该基因突变可导致香味物质2-乙酰-1-吡咯啉(2-AP)的含量增加从而促进香味的产生。本研究以三明市农业科学研究院自主选育的优质籼型杂交稻保持系明太B为受体,利用CRISPR-Cas9技术对其Badh2基因进行编辑和敲除。获得2个T₀代转基因纯合突变体植株并对其衍生的48个T₁代单株进行鉴定和分析,获得1个不含转基因载体骨架且在第2外显子插入单个碱基T的纯合突变体株系明太B-badh2。利用半定量PCR和qRT-PCR技术以及气相色谱质谱联用仪(GC-MS)检测Badh2基因相对表达量和2-AP含量;同时采用农业行业标准(NY/T1433-2014)推荐的48对水稻SSR引物进行指纹图谱分析。结果表明,该株系Badh2基因RNA表达水平显著下调;籽粒中香味物质2-AP的含量显著增加;指纹图谱分析发现,仅1对引物Rm571在野生型和突变体之间鉴定到等位变异,两组材料遗传差异较小。此外,本研究还对野生型和突变体T₂代植株表型性状、稻米蒸...     

利用分子标记辅助选择聚合水稻Pi-ta、Pi-b和Wx-mq基因

近年来,优良食味粳稻品种南粳46、南粳5055和南粳9108在江苏等地大面积推广,促进了优质稻米产业的发展。但这些品种均不抗稻瘟病,且缺乏适合在淮北地区种植的中熟中粳型优良食味粳稻品种。本研究以同时携带稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi-b的江苏抗病、高产粳稻品种武粳15为母本,携带低直链淀粉含量基因Wx-mq的优良食味粳稻品种南粳5055为父本配置杂交组合进行聚合育种。利用Pi-ta和Pi-b基因的分子标记多重PCR体系以及Wx-mq基因的四引物扩增受阻突变体系PCR检测技术,分别在不同的分离世代对目标基因位点进行检测,结合田间多代选育、抗性鉴定和籽粒胚乳外观鉴定,成功地将Pi-ta、Pi-b和Wx-mq基因聚合于一体,选育出稻瘟病抗性好、食味品质优、产量高的水稻新品系"南粳0051",适合在江苏省淮北地区种植。本研究将三套自主研发的PCR检测体系成功应用于分子标记辅助选择,不仅为水稻多基因聚合育种提供了快捷、高效的选择方法,也为水稻抗病、优质育种创制了新的种质资源。