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根据ET-Rhomboid基因开放阅读框,插入有利于表达的酶切位点设计引物,以虫体DNA为模板扩增并克隆了ET-Rhomboid基因,并将该基因与PET-28a(+)质粒载体连接,构建成了原核表达载体PET-ET-Rhomboid.将构建好的表达质粒转入大肠杆菌DE3,经IFTG诱导表达后,用SDS-PAGE检测表达产物,用蛋白印迹(Western blotting)检测其反应原性.结果表明:含重组质粒的工程菌有明显的表达产物为31 kD的融合蛋白,与推测的融合蛋白的分子量吻合,蛋白印迹检测具有反应原性. 相似文献
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[目的]研究肝素黄杆菌2-O-sulfatase基因的克隆与表达。[方法]以肝素黄肝菌为模板,通过PCR从肝素黄杆菌基因组DNA中扩增2-O-sulfatase的基因,测序正确后插入到表达质粒PET-28a(+)上构建表达载体,重组质粒转化E.coil BL21(DE3)进行蛋白质表达。[结果]成功地将PCR扩增得到的测序正确的2-O-sulfatase基因构建入PET-28a(+)载体上,重组质粒转入E.coil BL21(DE3)后,表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定得到目的蛋白。[结论]克隆并成功表达了黄杆菌2-O-sulfatase基因,为分析肝素多糖分子及其降解产物结构奠定了基础。 相似文献
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《西南农业学报》2016,(2)
为了分析绵羊肺炎支原体(MO)膜蛋白p56的反应原性,本研究以MO新疆流行株为模板,设计特异性引物对p56抗原集中区段进行PCR扩增,将扩增产物克隆测序,进一步亚克隆至表达载体pET-28a(+)中,构建pET-28a(+)-p56原核表达载体。将重组载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG对重组菌进行诱导,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。结果表明,SDS-PAGE分析证实表达的重组融合蛋白相对分子量为44 kDa;Western blot分析表明该重组蛋白可与MO阳性血清发生特异性免疫学反应,证实表达的重组p56融合蛋白具有良好的反应原性,为进一步研发MO检测用抗原奠定了前期基础。 相似文献
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根据GenBank中登录的牛型布鲁氏菌外膜蛋白bp26基因序列,设计了1对引物,采用PCR技术,牛流产病例分泌物为模板,扩增bp26的编码基因,得到1条753 bp的片段.将其连入Simple-T载体中进行酶切和测序鉴定.测序正确后,将该基因插入到pET-28a(+)载体中构建原核表达载体,将此重组质粒转化到Roset... 相似文献
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【目的】 诊断致犊牛腹泻冠状病毒。【方法】采集石河子、沙湾、奎屯等10个规模化奶牛场141份腹泻犊牛粪样,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)进行冠状病毒检测,PCR方法进行核酸复检。同时根据GenBank登录的牛冠状病毒 N基因序列,设计特异性引物,对Mebus分离株N基因进行扩增,克隆到PMD 19-T载体后,将测序正确的基因片段经EcoRI和HindIII双酶切后连接到PET-28a和PET-32a载体中,构建重组表达载体PET-28a-N和PET-32a-N,进行测序,亚克隆入BL21(DE3)表达载体,用IPTG进行诱导重组菌,SDS-PAGE和Western blot分析表达产物。【结果】所采集141份腹泻犊牛粪便中,用ELISA检测阳性率70.21%;再用RT-PCR检测出阳性率为61.7%同时,克隆了牛冠状病毒N基因,片段大小为1 400 bp,双酶切鉴定目的条带正确,测序结果与标准序列的进行比对同源性达到98.22%,通过SDS-PAGE分析证实表达的重组蛋白PET-28a-N-DE3相对分子质量为54KD;重组蛋白BCV-32a-N-DE3相对分子质量为70KD,Western blot分析表明该重组蛋白BCV-32a-N-DE3和BCV-28a-N-DE3和可以与牛冠状病毒阳性血清发生特异性反应。【结论】犊牛冠状病毒是导致石河子、沙湾、奎屯等10个规模化奶牛场和部分肉牛场犊牛腹泻的主要病原;ELISA方法和RT-PCR方法结合应用检测犊牛冠状病毒效果具有参考意义。获得的牛冠状病毒N蛋白具有很好的免疫反应性,为牛冠状病毒诊断试剂研发奠定基础。 相似文献
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幽门螺杆菌cagT蛋白的表达、纯化及免疫原性研究 总被引:1,自引:0,他引:1
为了解析cagT蛋白的结构,进而了解cagT基因在幽门螺杆菌致病中的作用,应用PCR技术从幽门螺杆菌26695菌株基因组中扩增cagT基因,T/A法克隆,连接至pET-28a(+)栽体,转化宿主细胞E.coli BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达,亲和层析法纯化目的蛋白,免疫家兔制备抗体并鉴定其抗原性.成功克隆cagT基因,重组cagT基因片段的测序结果与GenBank上公布的序列相同.重组cagT蛋白以可溶和包涵体两种形式表达,免疫家兔所得的抗体滴度为1:32.结果构建了高效表达cagT蛋白的重组载体pET-28a(+)-cagT,表达的蛋白具有良好的免疫原性,为后续的结构和功能研究奠定了基础. 相似文献
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克隆了堆型艾美耳球虫(Eimeria acervulina)乳酸脱氢酶(LDH)基因(EaLDH),并在大肠杆菌中成功表达出重组蛋白.根据GenBank中收录的EaLDH核苷酸序列设计特异性引物,以其第一代裂殖体总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增获得EaLDH基因.将EaLDH基因片段与原核表达载体pET28a(+)连接,构建重组表达质粒pET28a(+)-LDH,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达.结果表明,扩增出的EaLDH基因含993 bP的开放阅读框,与GenBank中收录的EaLDH基因序列相似性为98%.诱导后,重组蛋白能够在大肠杆菌中高效表达,融合蛋白相对分子质量约为4.1×104. 相似文献
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从ConA活化的昆明小鼠脾细胞中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增得到小鼠的IL-10基因.编码序列经测序验证后,将其克隆入表达载体pET-28a,构建IL-10基因的重组原核表达载体,在大肠杆菌(DE3)中诱导表达目的蛋白.SDS-PAGE结果表明,该表达产物的分子量与预期值相符,Western blot结果说明小鼠IL-10基因得到了表达. 相似文献
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[目的]为猪异种器官移植的免疫识别机理的研究奠定基础。[方法]采用RT-PCR方法扩增五指山猪DQA基因cDNA,然后进行测序和序列分析。[结果]海南五指山猪SLA-DQA基因序列长度为768个核苷酸,其中1~765为完全阅读框编码255个氨基酸残基。五指山猪SLA-DQA基因cDNA序列及其推导的氨基酸序列与我国小型猪同源性最高,与人相应基因的同源性明显高于与小鼠的同源性。[结论]将五指山猪作为适合于进行异种器官移植的中国猪种,对免疫遗传学特性系列研究具有重要意义。 相似文献
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通过RT - PCR方法和基因克隆技术对玉米黄早4HINT 1基因进行了分子克隆和序列分析.结果表明,黄早4 HINT 1 cDNA全长为729 bp,氨基酸序列与动物HINT 1有较高的相似度,并且包含HITN1蛋白家族保守的活性位点区域.同时,为进一步研究玉米HINT1基因的理化性质及生物功能,利用PET - 28... 相似文献
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【目的】克隆茶树(Camellia sinensis) 的一个类黄酮O-甲基转移酶基因,并对其进行生物信息学分析,构建该基因的原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白,为进一步研究其酶学特性和调控茶树中甲基化类黄酮物质的代谢机理奠定基础。【方法】采用同源克隆法,以从茶树叶片中提取的总RNA为模板,结合RT-PCR与RACE克隆技术获得该基因cDNA全长,测序正确后将该基因片段连接到原核表达载体pET-28a中,转化大肠杆菌BL21并诱导表达。【结果】该基因cDNA全长为1 246 bp,其开放阅读框为1 077 bp,编码358个氨基酸,推测的蛋白分子量为40.2 kD,理论等电点为5.62;其核苷酸编码序列与葡萄和毛果杨的类黄酮O-甲基转移酶基因相似性分别为80%和81%;经IPTG诱导和SDS-PAGE检测,所构建的原核表达载体表达的融合蛋白与预期蛋白相符合。【结论】利用RT-PCR与RACE克隆技术从茶树叶片中克隆得到了一个类黄酮O-甲基转移酶基因,成功构建了原核表达载体,并使其在大肠杆菌中得到了高效表达。 相似文献
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[目的]克隆小鼠白细胞介素-5(mIL-5)cDNA构建真核表达质粒,并转染293细胞检测其是否表达。[方法]以小鼠脾脏细胞总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增小鼠IL-5基因cDNA,酶切后插入pRc-CMV/Fc真核表达质粒中,构建重组真核表达质粒mIL-5/Fc-pRc-CMV,转染293细胞,RT-PCR与ELISA法检测目的基因表达。[结果]Fc-pRc-CMV中插入DNA序列与mIL-5 cDNA一致,重组质粒转染293细胞后,ELISA可检测出质粒能在293真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白。[结论]该研究成功克隆了小鼠IL-5基因cDNA,并构建其真核表达质粒。 相似文献