甘油、DMSO细胞冻存液冻存效果的比较实验研究

目的采用两种不同的细胞冻存液对Vero细胞的冻存效果进行研究。方法本实验主要研究甘油和二甲基亚砜这两种细胞冷冻保护剂,以及他们与血清、基础培养基的不同配比与细胞冻存效果之间的关系。结果发现不同的细胞冻存液在一定的所占比例内与细胞复苏后的成活率有一定的相关性,即在一定比例的冷冻剂保护下,细胞冻存的效果才会达到最佳。结论保护剂,无论是DMSO,还是甘油,其比例只有在10%-15%之间,细胞复苏后的成活率才达到最佳状态,即有利于细胞的冻存。且冷冻解冻后的细胞呈现正常的分裂增殖生长模式。     

杂交瘤细胞筒易冻存法

细胞杂交获得成功以后,往往由于细胞冻存方法不当或冻存液成分的差异而造成杂交瘤细胞的大量丢失。为此,我们利用本室现有的杂交瘤细胞株进行了几种冻存液及冻存方法的摸索、比较,选择出了一种简单快速的冻存方法,现报告如下。     

不同冻存液对奶牛乳腺上皮细胞冻存质量的影响

试验旨在探究奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)最佳的冻存液以改善乳腺上皮细胞的冻存质量。BMECs传至第5代后分别加入以下10种不同配方的冻存液。A组:85%DMEM+10%胎牛血清+5%DMSO;B组:80%DMEM+10%胎牛血清+10%DMSO;C组:75%DMEM+10%胎牛血清+15%DMSO;D组:70%DMEM+10%胎牛血清+20%DMSO;E组:85%DMEM+5%胎牛血清+10%DMSO;F组:75%DMEM+15%胎牛血清+10%DMSO;G组:70%DMEM+20%胎牛血清+10%DMSO;H组:80%DMEM+10%胎牛血清+10%甘油;I组:70%DMEM+10%胎牛血清+20%甘油;J组:60%DMEM+10%胎牛血清+30%甘油,冻存前统一调整细胞密度到1×106个/mL冻存。分别对复苏后的细胞进行台盼蓝染色计算存活率和PI/Hoechst33258双染计算凋亡率。结果表明,BMECs经不同冻存剂冻存复苏后,细胞活力、形态学及凋亡率表现有所不同,其中B组和G组的活力和24h贴壁率较其他组高,二者的凋亡率较低,二者之间差异无显著性(P>0.05);传代后B组细胞的生长状况最好。     

不同冻存液对奶牛乳腺上皮细胞冻存质量的影响

试验旨在探究奶牛乳腺上皮细胞（bovine mammary epithelial cells,BMECs）最佳的冻存液以改善乳腺上皮细胞的冻存质量。BMECs传至第5代后分别加入以下10种不同配方的冻存液。A组：85%DMEM＋10%胎牛血清＋5%DMSO;B组：80%DMEM＋10%胎牛血清＋10%DMSO;C组：75%DMEM＋10%胎牛血清＋15%DMSO;D组：70%DMEM＋10%胎牛血清＋20%DMSO;E组：85%DMEM＋5%胎牛血清＋10%DMSO;F组：75%DMEM＋15%胎牛血清＋10%DMSO;G组：70%DMEM＋20%胎牛血清＋10%DMSO;H组：80%DMEM＋10%胎牛血清＋10%甘油;I组：70%DMEM＋10%胎牛血清＋20%甘油;J组：60%DMEM＋10%胎牛血清＋30%甘油,冻存前统一调整细胞密度到1×106个/mL冻存。分别对复苏后的细胞进行台盼蓝染色计算存活率和PI/Hoechst33258双染计算凋亡率。结果表明,BMECs经不同冻存剂冻存复苏后,细胞活力、形态学及凋亡率表现有所不同,其中B组和G组的活力和24h贴壁率较其他组高,二者的凋亡率较低,二者之间差异无显著性（P〉0.05）;传代后B组细胞的生长状况最好。     

山羊小肠上皮细胞冻存与复苏的试验研究

在体外细胞培养工作中,为了保种和长期保存其生物活性,细胞的冷冻与复苏成了一个重要的环节.对于体外培养的细胞,必须能够以一种较高的效率实现冻存与复苏,才能达到组织工程种子细胞的要求.试验采用不同的冻存液、不同的冻存速率对体外分离培养的山羊IEC进行冻存与复苏,旨在提出最佳的冻存复苏方案.     

小鼠肾细胞冻存过程中甘油浓度的优化

目的:探讨在冻存小鼠肾细胞过程中,通过优化冷冻保护剂中甘油浓度的加入量,以达到小鼠肾细胞的最佳冻存效果。方法:将小鼠肾细胞制备成单细胞悬液,然后加入不同浓度的冷冻保护剂甘油,冻存细胞,比较细胞冻存效果,计算细胞成活率。四个组的甘油加入量分别为5%、10%、15%、20%。结果:在小鼠肾细胞冻存过程中,当冷冻保护剂中甘油的浓度达到10%时,冻存效果最佳,细胞成活率达到89.57%。     

不同冻存保护剂对绵羊前体脂肪细胞冻存效果的影响

<正>【目的】探讨绵羊前体脂肪细胞冷冻保存的最佳冻存保护剂种类和浓度。【方法】在含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液中分别添加不同浓度的DMSO、EG、PG、G和PVP作为冻存液,对原代培养的绵羊前体脂肪细胞进行冷冻保存后,检测复苏细胞存活率、细胞增殖能力、细胞中脂肪沉积量,测量GPDH活性,并用实时荧光定量PCR检测PPARγ和LPL mRNA的表达水平,最后对复苏细胞进行染色体核型分析。【结果】各种冻存保护液中,10%DMSO和5%DMSO+5%PVP     

不同冻存液对奶牛乳腺上皮细胞冻存质量的影响

试验旨在探究奶牛乳腺上皮细胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)最佳的冻存液以改善乳腺上皮细胞的冻存质量.BMECs传至第5代后分别加入以下10种不同配方的冻存液.A组:85％ DMEM+10％胎牛血清+5％ DMSO;B组:80％ DMEM+ 10％胎牛血清+10％ DMSO;C组:75％ DMEM+10％胎牛血清+15％ DMSO;D组:70％ DMEM+10％胎牛血清+20％ DMSO;E组:85％ DMEM+5％胎牛血清+10％ DMSO;F组:75％ DMEM+15％胎牛血清+10％ DMSO;G组:70％DMEM+20％胎牛血清+10％DMSO;H组:80％DMEM+10％胎牛血清+10％甘油;I组:70％ DMEM+10％胎牛血清+20％甘油;J组:60％ DMEM+10％胎牛血清+30％甘油,冻存前统一调整细胞密度到1×106个/mL冻存.分别对复苏后的细胞进行台盼蓝染色计算存活率和PI/Hoechst 33258双染计算凋亡率.结果表明,BMECs经不同冻存剂冻存复苏后,细胞活力、形态学及凋亡率表现有所不同,其中B组和G组的活力和24h贴壁率较其他组高,二者的凋亡率较低,二者之间差异无显著性(P＞0.05);传代后B组细胞的生长状况最好.     

黑白花奶牛乳腺上皮细胞冻存方法的研究

试验研究了北方地区黑白花奶牛乳腺上皮细胞的最佳冻存方法。采用内蒙古地区健康黑白花奶牛的新鲜乳腺组织,将组织进行Ⅱ型胶原酶消化后原代培养,培养的细胞经5代纯化后将密度调整为1×106个/mL。采用6种处理方法进行冻存,各设3个重复。液氮冻存1个月后,分别将6种不同方法冻存的细胞复苏后测定细胞活性,包括冻存死亡率、贴壁细胞占活细胞的比率、凋亡率等,同时进行形态学观察。结果显示,处理1组与2、3、5组间冻存死亡率存在极显著差异（P〈0.01）,处理1、4、6组间冻存死亡率无显著差异（P〉0.05）,处理2、6组间冻存死亡率存在极显著差异（P〈0.01）;处理4组的贴壁率高于处理2、5、6组,存在极显著差异（P〈0.01）。形态学观察结果发现,处理1、4组细胞较其他组生长状态良好。因此,处理4可作为黑白花奶牛乳腺上皮细胞的最佳冻存方法。     

黑白花奶牛乳腺上皮细胞冻存方法的研究

试验研究了北方地区黑白花奶牛乳腺上皮细胞的最佳冻存方法。采用内蒙古地区健康黑白花奶牛的新鲜乳腺组织,将组织进行Ⅱ型胶原酶消化后原代培养,培养的细胞经5代纯化后将密度调整为1×106个/mL。采用6种处理方法进行冻存,各设3个重复。液氮冻存1个月后,分别将6种不同方法冻存的细胞复苏后测定细胞活性,包括冻存死亡率、贴壁细胞占活细胞的比率、凋亡率等,同时进行形态学观察。结果显示,处理1组与2、3、5组间冻存死亡率存在极显著差异(P<0.01),处理1、4、6组间冻存死亡率无显著差异(P>0.05),处理2、6组间冻存死亡率存在极显著差异(P<0.01);处理4组的贴壁率高于处理2、5、6组,存在极显著差异(P<0.01)。形态学观察结果发现,处理1、4组细胞较其他组生长状态良好。因此,处理4可作为黑白花奶牛乳腺上皮细胞的最佳冻存方法。     

黑白花奶牛乳腺上皮细胞冻存方法的研究

本试验研究了北方地区黑白花奶牛乳腺上皮细胞的最佳冻存方法。采用内蒙古地区健康黑白花奶牛的新鲜乳腺组织,将组织进行Ⅱ型胶原酶消化后原代培养,培养的细胞经5代纯化后将密度调整为1×106个/mL。采用6种处理方法进行冻存,各设3个重复。液氮冻存1个月后,分别将6种不同方法冻存的细胞复苏后测定细胞活性,包括冻存死亡率、贴壁细胞占活细胞的比率、凋亡率等,同时进行形态学观察。结果显示,处理1组与2、3、5组间冻存死亡率存在极显著差异(P0.01),处理1、4、6组间冻存死亡率无显著差异(P0.05),处理2、6组间冻存死亡率存在极显著差异(P0.01);处理4组的贴比率高于处理2、5、6组,存在极显著差异(P0.01)。形态学观察结果发现,处理1、4组细胞较其它组生长状态良好。因此,处理4可作为黑白花奶牛乳腺上皮细胞的最佳冻存方法。     

细胞快速,简易冻存法

将ＰＫ－１５和ＳＴ细胞通过普通冰箱冷藏室（４℃）１５分钟；普通冰箱冷冻室（－４℃）５分钟，低落曙冰箱（－２０℃）２０分钟；气态液氮３０分钟后沉入液氮中，经一段时间后复苏，冻存细胞状态良好。全部冻存过程在７０分钟内完成，比常规冻存方法节省时间，简便易行。     

黑白花奶牛乳腺上皮细胞冻存方法的研究

试验研究了北方地区黑白花奶牛乳腺上皮细胞的最佳冻存方法.采用内蒙古地区健康黑白花奶牛的新鲜乳腺组织,将组织进行Ⅱ型胶原酶消化后原代培养,培养的细胞经5代纯化后将密度调整为l×106个/mL.采用6种处理方法进行冻存,各设3个重复.液氮冻存1个月后,分别将6种不同方法冻存的细胞复苏后测定细胞活性,包括冻存死亡率、贴壁细胞占活细胞的比率、凋亡率等,同时进行形态学观察.结果显示,处理1组与2、3、5组间冻存死亡率存在极显著差异(P＜0.01),处理1、4、6组间冻存死亡率无显著差异(P＞0.05),处理2、6组间冻存死亡率存在极显著差异(P＜0.01)；处理4组的贴壁率高于处理2、5、6组,存在极显著差异(P＜0.01).形态学观察结果发现,处理1、4组细胞较其他组生长状态良好.因此,处理4可作为黑白花奶牛乳腺上皮细胞的最佳冻存方法.     

猪成纤维细胞冻存方法的研究

试验以猪的成纤维细胞为研究对象，认为在-70℃情况下冻存至少7d不会影响其存活率(可达80％以上)，且生长形态正常。同时利用血清饥饿法使成纤维细胞周期同步化，在-70℃冻存2d、4d和7d，细胞存涪率可达92．3％、87．2％和83．6％，甚至在该务件下冻存15d，细胞也能恢复正常的生长。     

细胞冻存保护剂二甲基亚砜的细胞毒作用

二甲基亚砜(DMSO)是目前最好的细胞冻存保护剂,但也是一种对细胞毒性很大的化学试剂。本研究结果表明,培养液中DMSO浓度为10％时,细胞生长抑制率近100％;1‰浓度时抑制率为35％;即使是0.04‰的浓度,DMSO对细胞的生长也有不利的影响。我们认为,培养液中残存的DMSO是冻存细胞复苏后出现细胞毒现象的主要原因。因此我们提出,冻存细胞时操作过程要迅速;细胞融化后务必洗涤,尽量去除DMSO,是减少其对细胞毒性作用、保证细胞尽快恢复生长增殖的关键步骤。     

细胞冻存保护剂二甲基亚砜的细胞毒作用

二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）是目前最好的细胞冻存保护剂，但也是一种以细胞毒性很大的化学试验剂。本研究结果表明，培养液中ＤＭＳＯ浓度为１０％时，细胞生长抑制率近１００％；１‰浓度时抑制率为３５％，即使是０．０４‰的浓度，ＤＭＳＯ对细胞的生长也有不利的影响。我们认为，培养液中残存的ＤＭＳＯ是冻存细胞复苏后出现的细胞毒现象的主要原因。因此我们提出，冻存细胞时操作过程要迅速；细胞融化务必洗涤，尽量去除ＤＭＳＯ，     

BHK21细胞冻存密度与复苏后活力的关系分析

对BHK21细胞不同的冻存密度与细胞复苏后活力的关系进行了统计分析.首先取处于对数生长期的细胞,以4种不同的密度进行冻存.这4种密度分布在0.5×107～4.0×107个/mL之间.冻存2周后,每种密度各复苏3支,计算其活力,分析密度与活力之间是否存在相关性.如此,平行做2次.结果发现,不同的细胞冻存密度与细胞复苏后的活力之间有相关性.     

荷斯坦奶牛乳腺组织冻存及乳腺上皮细胞原代培养技术改进

为了改进奶牛乳腺上皮细胞原代培养技术和探究乳腺组织冻存方法,选用24月龄无泌乳史荷斯坦奶牛,采用组织块种植法,通过侧置和倒置两种方式,分别从新鲜和冻存(8个月)的乳腺组织中分离培养奶牛乳腺上皮细胞。结果表明,侧置处理能使乳腺细胞爬出时间缩短1~2d,并改善组织块贴壁速度和效果;回收于前次培养后的乳腺组织块再分离培养,贴壁第2天即有乳腺上皮细胞爬出;一步冷冻(-80℃)液氮保存较大奶牛乳腺组织块,冻存液A(FBS∶DMSO∶DMEM/F12=7∶2∶1)冻存的组织块存活率为50%,冻存液B(FBS∶DMEM/F12∶DMSO∶HEPES/丙酮酸钠贮存液=10∶7∶2∶1)冻存的组织块存活率为56%。可见,作者建立的侧置处理法和组织块回收法可以用于奶牛乳腺上皮细胞的分离培养,可以缩短组织块种植法实验周期,冻存液中加入缓冲液HEPES/丙酮酸钠后有利于组织块生物活性保持。     

卡氏住白细胞虫子孢子冻存方法及感染力试验

用匀浆和离心的方法从阳性荒川库蠓体内分离出卡氏住白细胞虫子孢子，以直接冻存和间接冻存2种方法分别对该子孢子进行保存；再分别以3种剂量将不同方法冻存的子孢子和新鲜的子孢子分别给32日龄的健康鸡接种。结果表明，经间接冻存的子孢子和新鲜的子孢子对鸡均具有感染力，而直接冻存的子孢子无感染力。     

冻存液添加蜂王浆主蛋白对精子品质的影响

目的 精液冷冻保存作为人工授精不可或缺的一个技术环节,对优质畜禽种群的繁衍和保存有着至关重要的意义。目前,因精液冻存时冻存液成分、冷冻方法和外部氧化应激等因素影响,导致冻存精液品质不一。蜂王浆（RJ）已被证明能提高动物精液品质,蜂王浆主蛋白（MRJPs）作为RJ主要生物活性成分物质,具有多种生物活性和抗氧化能力。方法 为提高冻存精子品质,本研究开展了在公牛精液冻存液中添加不同浓度（0 g/25 mL、0.01 g/25 mL、0.02 g/25 mL、0.03 g/25 mL、0.04 g/25 mL）的MRJPs冻干粉,对冻存48 h后解冻精子的总活力、前进性活力、畸形率等相关参数进行了观察评估。结果 添加MRJPs呈浓度依赖性方式显著降低精子总活力、快速前进性活力、缓慢前进性活力和直行性活力（P<0.05）,而且精子畸形率和精子原地移动活力与对照组相比无显著差异（P> 0.05）。结论 精液冻存液中添加MRJPs会抑制冻存精子活力,因此,对MRJPs能以何种方式提高精液品质的研究还需要进一步开展。