嗜水气单胞菌弹性蛋白酶基因的克隆表达

为了研究嗜水气单胞菌重组弹性蛋白酶的酶学性质,试验根据GenBank中的嗜水气单胞菌弹性蛋白酶基因ahyB设计1对含酶切位点的特异引物,以嗜水气单胞菌J-1(AhJ-1)株为模板,经PCR扩增得到不含信号肽的成熟弹性蛋白酶基因片段(787 bp),并与pMD18-T载体连接、测序,再用DNAStar软件分析。结果表明:该基因片段与豚鼠气单胞菌胞外蛋白酶同源性高达95%,与嗜水气单胞菌AG2株弹性蛋白酶ahyB基因同源性为92%,与铜绿假单胞菌LasB基因同源性为82%;将PCR产物连入表达载体pET-32a,转化至大肠杆菌BL21菌株中进行诱导表达,出现50 ku的融合表达蛋白,该表达产物纯化复性后表现出酶的活性。     

框镜鲤维氏气单胞菌溶血素基因片段的克隆与序列分析

本试验对维氏气单胞菌的溶血素基因片段进行PCR扩增、测序后分析,结果表明,维氏气单胞菌的溶血素基因片段序列与气单胞菌属的不同菌种的溶血素基因具有很高的同源性;其编码蛋白的二级结构预测:α螺旋与β转角占有很高的比例,可能有4区域形成B细胞表位.     

嗜水气单胞菌Ⅲ型分泌系统AopN蛋白原核表达及鉴定

根据GenBank上登陆的嗜水气单胞菌AH-1株Ⅲ型分泌系统aopN基因序列,设计1对特异性引物,以J-1株的基因组为模板,PCR扩增得到aopN基因,连入pET-32a(+),转化至大肠杆菌表达,同时PCR检测aopN基因在66株嗜水气单胞菌中的分布情况。aopN基因测序分析发现,片段长度为874 bp,与嗜水气单胞菌AH-1、SSU、AH-3的同源性分别为97%、81%、82%,与杀鲑气单胞菌杀鲑亚种A449的同源性为81%,与温和气单胞菌的同源性为82%。PCR检测结果表明,57株能检测到aopN基因的目的片段。SDS-PAGE分析表明重组蛋白分子量为54.5ku,用兔抗J-1株的全菌抗血清进行Western blot分析表明,该蛋白具有较好的免疫反应性。由于多数菌株都含有aopN基因,提示AopN可能是嗜水气单胞菌的共同保护性抗原。     

3株维氏气单胞菌耐药性及毒力基因的比较

为探究不同地区的维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）耐药性及毒力基因是否存在区别,本研究从生长形态、生化试验、药敏试验、人工感染试验、16S rDNA基因测序同源性分析及毒力基因等方面比较了草鱼源菌株GZCY2019、杂交鲟源菌株GZXY2018及斑点叉尾鮰源菌株GZBD2017的差异。结果显示,3株不同源维氏气单胞菌在鲜血平板上均为圆形、表面湿润光滑、边缘整齐半透明的灰白色菌落,菌落周围均有β溶血环;革兰氏染色镜检均为两端钝圆短小阴性杆菌;药敏试验显示,3株菌对丁胺卡那、多西环素等药物均敏感,而对复方新诺明、头孢他啶、多黏菌素B等药物均中度敏感,对其他药物则表现出不同程度的敏感性或者耐药性;人工感染试验显示,菌株GZCY2019与GZBD2017对小鼠累计死亡率为100%,菌株GZXY2018的累计死亡率为80%;16S rDNA同源性分析显示,菌株GZCY2019与菌株GZBD2017同源性为99.9%,二者与菌株GZXY2018同源性均为97.1%;毒力基因检测结果显示,3株菌均携带热不稳定性肠毒素（Alt）、溶血素（hlyA）与鞭毛（Fla）等毒力基因,而对细胞毒性肠毒素（Act）及其热稳定性肠毒素（Ast）毒力基因的携带则表现不同。本研究通过不同源维氏气单胞菌的对比发现,3株菌在生长形态、染色镜检结果、生化结果上基本相似,但耐药性和毒力基因的携带存在较大差异。     

嗜水气单胞菌溶血素A表达、免疫原性及活性检测

根据已发表的嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila,Ah）溶血素A基因序列设计一对特异性引物,以TPS30菌株基因组为模板,通过PCR扩增溶血素A基因,经T-A克隆、序列测定和分析,结果表明,该基因包含1482 bp碱基,编码494个氨基酸。将溶血素A定向克隆至表达载体pET32a（＋）中,构建重组表达质粒pET-THA,在IPTG诱导下成功获得重组表达蛋白His-GroEL,大小为68 kDa。对该质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达特性分析表明,最佳的诱导表达条件为：在0.1 mmol/L的IPTG浓度下,21℃诱导表达3 h。表达的溶血素A蛋白纯化后免疫小鼠,经Western blot检测,表明该蛋白具有免疫原性。对纯化的溶血素A蛋白复性后,进行溶血实验,结果表明该蛋白具有溶血活性。通过本实验的研究,为进一步研究嗜水气单胞菌溶血素的生物学功能奠定了基础。     

维氏气单胞菌TH0426株ompW基因的克隆、生物信息学分析及其原核表达

为研究维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)ompW基因的生物信息学特性及相关功能,试验克隆了维氏气单胞菌ompW基因片段,通过生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、疏水性、信号肽、跨膜区、二级及三级结构,并对其进行原核表达及反应原性检测。结果显示,ompW基因全长594 bp,编码197个氨基酸,TH0426株ompW基因与A.veronii B5B6株属于同一分支;该蛋白属于外膜蛋白,在19～29位氨基酸之间有一个典型的疏水区域,不存在跨膜区、信号肽,二级结构以β折叠与无规则卷曲为主。Western blot结果显示OmpW重组蛋白能与鼠抗维氏气单胞菌(A.veronii)TH0426株血清发生特异性结合。综上,OmpW重组蛋白具有一定的免疫原性,为进一步研究A.veronii疫苗奠定基础。     

温和气单胞菌毒力基因的检测及其对鲫鱼致病性试验

为探究温和气单胞菌菌株A.S1的致病性,采用PCR方法扩增溶血素基因(hly)、细胞兴奋性肠毒素基因(alt)、黏附素基因(aha1)和气溶素基因(aerA)4种毒力基因,并运用动物回归试验探究菌株A.S1对鲫鱼的致病性。结果表明,菌株A.S1可扩增出hly、aha1和alt 3种毒力基因,未扩增出aerA基因。动物回归试验显示,试验组鲫鱼在腹腔注射温和气单胞菌0.3mL(浓度为1.5×108 CFU/mL)后,5d内死亡率达100%。表明毒力基因型为hly+、aha1+、alt+和aerA-的菌株A.S1为高毒力菌株,且菌株的毒力基因型与致病性呈正相关。     

嗜水气单胞菌Ⅲ型分泌系统ascV全长基因的克隆及其在不同菌株中的分布

根据已发表的嗜水气单胞菌Ⅲ型分泌系统（TTSS）的ascV基因保守区核苷酸序列设计合成1对引物,以国内疫苗菌株J-1的基因组为模板,通过PCR扩增得到331bp保守基因片段,将目的片段进行测序。在此基础上,分4段克隆J-1株的Ⅱscv基因并进一步拼接,全长为2166bp,同时PCR检测ascV基因在66株嗜水气单胞菌中的分布情况。测序分析发现,扩增出的J-1株ascV全长基因与嗜水气单胞菌AH-1、SSU、AH-3的同源性分别为97％、86％、86％,与杀鲑气单胞菌杀鲑亚种A449的同源性为86％,与温和气单胞菌的同源性为87％。PCR检测表明,64株能扩增出n5fV基因的目的片段,包括2株无毒菌株,而在2株有毒菌株中却未能检测到,说明TTSS在嗜水气单胞菌致病机制上的作用值得进一步探讨。     

猪胸膜肺炎放线杆菌Apx Ⅳ A2．5kb基因片段的分子克隆及其表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型国内分离株72—1株基因组DNA为模板，用PCR方法扩增出ApxⅣA基因2．5kb特异片段，将其克隆于pMD 18-T中，经酶切鉴定筛选重组质粒后进行核苷酸序列测定，并与GenBank中登录的血清1型ApxⅣA(AⅪ302405)基因进行比较，结果显示核苷酸同源性为99．5％。将该片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的EfoRⅠ／SalⅠ位点，成功地构建了重组表达载体pGEX—apxⅣA，并转化大肠埃希氏菌BL2l，获得了表达。SDS-PAGE检测结果显示，表达的融合蛋白分子质量约为117ku，与预期片段大小相符；Western-blotting分析证实，该融合蛋白具有免疫学活性。     

一株多重耐药鳢源舒氏气单胞菌的分离、鉴定及其耐药性分析

本实验室2016年7月从广东省佛山市某杂交鳢(Channa maculata×Channa argus)养殖场分离到一株编号为WL-23的细菌,为对该菌株进行鉴定与分析,本研究首先对该菌进行生理生化和分子生物学鉴定;将该菌株进行人工回归感染试验对其进行致病性分析,并对其耐药性和耐药基因进行检测与分析。结果显示,WL-23株为舒氏气单胞菌(Aeromonas schubertii),该菌株人工感染杂交鳢的临床症状与自然发病鱼的症状一致,且对杂交鳢的LD_(50)为2.6×10~6cfu/mL。药敏试验结果显示WL-23株具有8重耐药特征,该菌对大环内酯类、四环素类、氨基糖苷类、β-内酰胺类、氯霉素类、林可酰胺类、磺胺类和利福平等药物耐药。耐药基因检测结果显示,该菌株携带大环内酯类mph(A),四环素类tet(A),氨基糖苷类aad(A)、aacC4和aphA1,氯霉素类Flor,喹诺酮类qnrS、磺胺类sul1、sul2和dfra1以及利福平aar-2/3等耐药基因。WL-23菌株的耐药基因与其耐药表型之间具有良好的相关性,表明以上11种耐药基因是WL-23株具有耐药性的关键原因。近年来鳢源舒氏气单胞菌对四环素类和氨基糖苷类的耐药性明显增强,这与该菌获得了大量的耐药基因有关。本研究为鳢源舒氏气单胞菌的流行病学和耐药性等研究奠定了基础,也为对其科学防控提供指导意见。     

鹅细小病毒河北流行株HBZF07 NS1基因的克隆与序列分析

鹅细小病毒HBZF07株经13日龄鹅胚增殖后收集尿囊液,提取病毒基因组总DNA,采用PCR方法,一次性扩增出与预期大小相符的特异性条带.将扩增产物提纯回收后克隆入pMD18-T载体,经转化、筛选及酶切鉴定后,对阳性克隆进行了序列测定和序列分析.测序后拼接的基因长1 892 bp,包含完整的NS1开放阅读框(1 884 bp),编码623个氨基酸.与GenBank中其它毒株的NS1基因核苷酸序列相比,同源性分别为DY(EF515837)98.4%,与B(GPU25749)为99.2%,与HG5/82(AY506546)为93.9%,与YG(AF416726)为93.9%,与SHM319(GPU34761)为97.0%.     

乙型脑炎病毒SXBJ07株E基因的克隆及原核表达

为构建乙型脑炎病毒(JEV)SXBJ07株E基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中进行高效表达;根据JEV SXBJ07株基因组全序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增E基因全长;将目的基因插入pGEM-T连接载体,筛选出阳性重组质粒;将该质粒克隆至原核表达载体pET32α中,再转化入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达后对其产物进行SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测。结果表明:扩增到了全长为1 500 bp的JEV SXBJ株E蛋白基因;重组质粒pET-32α-E构建成功;融合蛋白可以与乙脑阳性血清抗体特异性结合。说明在大肠杆菌中成功表达了JEV E蛋白。     

柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG2基因的克隆与表达

根据生物信息学预测的基因序列设计引物,应用RT-PCR方法从柔嫩艾美耳球虫第二代裂殖子总RNA扩增获得了鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原2(surface antigen 2,SAG2)基因序列,将其与pGEM-T easy载体连接后转化E.coliDH5α,筛选阳性克隆,以带有限制酶切位点的特异性引物用PCR方法扩增不含SAG2 N端信号肽序列的ORF序列后克隆至表达载体pET-32 a(+),构建了重组表达质粒pET-32 a(+)-SAG2,并将其转化至E.coliBL21(DE3)。经IPTG诱导,获得了SAG2重组抗原在大肠杆菌的高效表达,重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的35%,融合蛋白的分子量约为47 ku。菌体经超声处理后进行SDS-PAGE分析表明,表达蛋白以包涵体的形式存在。     

伪狂犬病病毒Bartha-K61株UL49基因的克隆和序列分析

根据已经发表的伪狂犬病病毒(PRV)国内Ea株UL49基因序列,设计并合成了1对引物,通过PCR方法扩增到了PRV Bartha-K61株UL49基因的编码区,并克隆到pMD18-T载体中.重组质粒pMD-UL49经XhoI酶切和PCR鉴定后,进行了序列测定和分析.结果表明,重组质粒pMD-UL49含有PRV Bartha-K61株UL49基因的编码区.同源性分析显示,PRV Bartha-K61株UL49基因序列与国外Kaplan株、国内Ea株相应基因的核苷酸同源性分别为98.9 %和94.1 %,推导的氨基酸序列同源性分别为96.7 %和87.2 %.     

猪链球菌2型江苏分离株溶血素基因检测及序列分析

根据猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2）溶血素基因（sly）设计和合成了一对可扩增其完整阅读框的引物，对HA9801等6株猪链球菌2型江苏分离株，1株德国分离株SS2-D及猪链球菌C群参考株ATCC35246的核酸进行PCR扩增，结果显示HA9801等6株江苏分离株及德国株SS2呈阳性．ATCC35246呈阴性。HA9801株PCR产物纯化后测序．序列分析表明该DNA片段与猪链球菌2型1933株的sly基因同源性为99％。     

猪链球菌2型江苏分离株溶血素基因的检测及序列分析

根据猪链球菌2型(strep tococcus su is type 2)溶血素基因(sly)设计和合成了一对可扩增其完整阅读框的引物,对HA 9801等6株猪链球菌2型江苏分离株、1株德国分离株SS2-D及猪链球菌C群参考株ATCC 35246的核酸进行PCR扩增,结果显示HA 9801等6株江苏分离株及德国株SS2呈阳性,ATCC 35246呈阴性。HA 9801株PCR产物纯化后测序,序列分析结果表明该DNA片段与猪链球菌2型1933株的sly基因同源性为99%。     

弓形虫GJS株pcDNA3-MIC3核酸疫苗的研究

根据GenBank中MIC3基因序列设计1对引物,采用PCR技术从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因片段,克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定.重组质粒pcDNA3-MIC3肌肉注射免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测血清特异抗体;经腹腔攻击感染弓形虫GJS株速殖子,观察小鼠的生存时间.结果成功构建了pcD-NA3-MIC3质粒;免疫组小鼠血清检测到特异性抗体;攻击感染后免疫组小鼠平均存活时间较对照组明显延长.表明该核酸疫苗具有较好的免疫原性,能诱导小鼠产生良好的免疫保护作用.     

犬瘟热病毒疫苗株附着蛋白基因的克隆及同源性比较

根据发表的犬瘟热病毒(CDV)参考株Ondetstepoort的序列设计1对引物,以犬瘟热病毒疫苗株感染Vero细胞总RNA为模板,利用RT-PCR扩增出附着蛋白基因843 bp片段,将这个片段连接到pMD18-T载体上,经过PCR鉴定、酶切鉴定得到1个阳性克隆,将阳性质粒进行序列测定,结果表明,该片段与Onderstepoort株核苷酸同源性为95.9%。从基因角度为犬瘟热的预防、诊断和治疗提供理论依据。