ILTV gB基因与鸡IL-18基因共表达DNA疫苗的免疫原性

本试验构建了能分别或同时表达ILTV gB和IL-18基因的重组质粒pIRES-gB、pIRES-IL18、pIRES-gB/IL18。将重组质粒通过腿部肌肉多点注射免疫21日龄雏鸡,35日龄加强免疫1次,二免后2周用ILTV HN1株进行攻毒。pIRES-gB/IL18和pIRES-gB+pIRES-IL18免疫雏鸡后均能促进外周血T淋巴细胞亚群数量和血清中特异性抗体水平的增加,能明显增强ILTV DNA疫苗对强毒的攻击保护,但pIRES-gB/IL18免疫组要优于pIRES-gB+pIRES-IL18混合免疫组及其他对照组,差异显著或极显著。结果表明,鸡IL-18能明显增强ILTV DNA疫苗的免疫原性。     

共表达C_(48-1)H基因和鸡IL-18基因重组DNA疫苗的免疫保护性

DNA疫苗虽然有其独特的优点,但是它诱导机体产生的抗体水平还不足以抵抗致死剂量病原体的攻击,如何增强DNA疫苗的免疫保护率成为人们研究的热点.     

PCV2ORF2基因与猪IL-18基因共表达DNA疫苗的免疫原性

为研制新型的PCV2基因疫苗,本研究将PCV2ORF2和猪IL-18基因插入真核表达质粒pIRES中,构建共表达capsid (Cap)蛋白和猪IL-18的质粒pIRES-OFR2/IL18和表达Cap蛋白的质粒pIRES-OFR2.将质粒pIRES-OFR2/IL18和pIRES-OFR2通过腿部肌肉多点注射8周龄昆明小鼠,间隔3周再免疫1次.加强免疫3周后用PCV2 Wuzhi株进行攻毒.pIRES-OFR2/IL18免疫昆明小鼠后能促进外周血T淋巴细胞增殖和血清中特异性抗体水平的增加,能明显增强PCV2 DNA疫苗对强毒的攻击保护,pIRES-ORF2/IL18免疫组要优于pIRES-ORF2免疫组及其它对照组,差异显著.表明猪IL-18基因与PCV2ORF2共表达可增强猪体对DNA疫苗的免疫应答,提高对PCV2强毒的抵抗力.     

PRRSV GP5蛋白及猪IL-18基因共表达核酸疫苗免疫原性试验

本试验通过分子克隆技术分别构建了单独表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5基因以及PRRSVGP5基因和猪IL-18基因共表达的重组核酸疫苗质粒（pEGFP—GP5和pEGFP—ILl8-GP5）,并进行仔猪免疫原性研究,对构建的PRRSV核酸疫苗所诱导的体液免疫和细胞免疫水平进行检测,进一步研究了PRRSV核酸疫苗免疫效果以及猪IL-18基因对PRRSV核酸疫苗免疫调节作用的影响。同时,调查了商业上应用不同类型的PRRSV疫苗诱导的免疫效果,并与核酸疫苗免疫效果进行比较。结果表明,IL-18作为免疫佐剂在疫苗免疫猪后诱导的病毒特异性细胞免疫反应方面具有很好的调节作用,共表达IL18-GP5蛋白能够明显的改善DNA疫苗的免疫效力,增强抗PRRSV的免疫保护。因此,DNA疫苗做为一种新一代疫苗可用于对抗高致病性PRRSV感染。     

携带IBV DNA疫苗重组减毒沙门氏菌的构建及免疫原性研究

为研究携带IBV DNA疫苗重组减毒沙门氏菌免疫原性,本研究将携带有禽传染性支气管炎病毒(IBV)S1、M、N基因的pVAX1-S1、pVAX1-M和pVAX1-N重组质粒转入减毒沙门氏菌X4550株,构建IBV S1、M、N基因DNA质粒重组减毒沙门氏菌X4550疫苗株(X4550/pVAX1-S1,X4550/pVAX1-M,X4550/pVAX1-N),用间接免疫荧光法(IFA)检测重组质粒体外表达,SPF鸡经口服免疫,测定体内组织分布及稳定性、特异性IgG、IgA、CD4+和CD8+T细胞含量并进行攻毒实验。结果表明,重组质粒可在体外细胞中表达目的蛋白;重组减毒沙门氏菌X4550疫苗株可在肠、脾、肝、心、肾、肺6个组织中分布并稳定存在;特异性IgG,IgA、CD4+和CD8+T细胞显著升高(p0.01),用104EID50IBV M41株攻毒,保护率达到73%(11/15)。本研究为研制IBV基因减毒沙门氏菌疫苗提供了依据。     

鸡IL-18对禽多杀性巴氏杆菌DNA疫苗的免疫佐剂作用

为了探索鸡IL-18在禽多杀性巴氏杆菌H基因DNA疫苗中的免疫佐剂作用，分别用共表达鸡IL-18基因和禽多杀性巴氏杆菌C48-1H基因的DNA疫苗、鸡IL-18真核表达质粒pcDNA3／cIL-18与禽多杀性巴氏杆菌C48-1H基因的DNA疫苗混合物、禽多杀性巴氏杆菌C48-1H基因的DNA疫苗肌肉注射5周龄鸡，首免后每周采取外周血及外周抗凝血，应用ELISA和MTT法分别检测免疫鸡的体液免疫及细胞免疫水平。二免后第2周用10 LD50禽多杀性巴氏杆菌强毒菌株C48-1进行攻击。结果鸡IL-18能够明显增强禽多杀性巴氏杆菌H基因DNA疫苗的免疫原性，显著提高免疫鸡的体液免疫和细胞免疫水平，并且鸡IL-18与禽多杀性巴氏杆菌H基因共表达时的免疫佐剂作用最强，能强有力地抵抗强毒菌株C48-1的致死性攻击。结果表明，鸡IL-18可作为DNA疫苗的一种理想的免疫佐剂。     

鸡传染性喉气管炎病毒gB基因重组DNA疫苗的构建与鸡IL-18联合免疫试验

本研究构建了编码ILTV糖蛋白gB基因的重组DNA疫苗pgB,为测定该DNA疫苗与鸡IL-18联合免疫的试验效果,将pgB、pIL-18分别以单独和联合的方式免疫21日龄SPF雏鸡,免疫后每周抽取外周血及外周抗凝血,应用ELISA和流式细胞仪分别检测免疫鸡的体液免疫及细胞免疫水平。二免疫后第3周用100 ELD50ILTV强毒进行攻击。结果显示,pgB和pgB与pIL-18联合免疫组均能诱导鸡产生特异性的体液免疫及细胞免疫应答,其中以pgB与pIL-18联合免疫组的T淋巴细胞亚群CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+明显高于单独pgB免疫组(P0.01),87%抵抗ILTV强毒的致死性攻击。     

IBV肾型地方分离株弱毒疫苗与同类冻干疫苗的免疫效力试验比较

本试验对人工致弱IBV肾型地方分离株(SF株)与相应进口弱毒疫苗和国产弱毒疫苗进行了免疫效力比较试验。结果表明SF株免疫后产生抗体的时间和抗体效价高低与其他疫苗相当甚至略高,对攻毒鸡的保护率均为100%。剖检实验鸡,采集肾脏样本做肾脏组织切片,观察发现接种致弱的SF株疫苗后,引起的肾脏组织病理变化比选用的2种国产疫苗病理变化轻微,而与进口疫苗引起的病理变化程度相当,属可逆性病变。     

鸡IL-1β、IL-16基因真核表达质粒对IBV DNA疫苗的免疫增强效应研究

为研究鸡IL-1β、IL-16基因真核表达质粒对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)DNA疫苗免疫效果的影响,根据GenBank登录的鸡IL-1β和IL-16序列设计两对引物,采用RT-PCR方法从四川山地乌骨鸡外周血淋巴细胞RNA中克隆IL-1β和IL-16基因,与真核表达质粒pcDNA3.1(+)连接构建了pDNAIL-1β和pDNAIL-16。分别将两种重组质粒与IBVDNA联合免疫SPF雏鸡并进行攻毒试验。结果表明,pDNAIL-1β和pDNAIL-16均能促进血清中特异性抗体水平和外周血T淋巴细胞亚群数量的增加(p<0.05),增强IBV DNA疫苗对同型强毒的保护率15%～25%,pDNAIL-1β提升DNA疫苗的抗体水平的时间比pDNAIL-16多7d。试验表明,鸡IL-1β、IL-16基因真核表达质粒对IBV DNA疫苗的免疫具有增强作用。     

IBDV VP2/4/3与ChIL-18融合基因真核表达质粒和基因共表达质粒的免疫原性比较

为比较已构建的鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)重组质粒的免疫原性、进一步研究ChIL-18的分子免疫佐剂作用,本研究将2周龄SPF鸡随机分为6组,以200μg/羽剂量首免:A组免疫重组真核表达重组质粒pCI-VP2/4/3-ChIL-18,B组免疫pCI-ChIL-18-VP2/4/3,C组免疫pCI-co-VP2/4/3-ChIL-18,D组免疫pCI-VP2/4/3,E组免疫pCI-ChIL-18和pCI-VP2/4/3,F组为空白对照,2周后以相同剂量二免,通过观察外周血淋巴细胞增殖效果,测定血清IBDV中和抗体水平、血清ELISA抗体水平和攻毒保护试验等,比较各试验组IBDV DNA疫苗的免疫原性。试验发现:重组质粒pCI-co-VP2/4/3-ChIL-18的保护效果最好,保护率达93.3%;pCI-VP2/4/3-ChIL-18免疫效果次之,保护率达80.0%;pCI-ChIL-18-VP2/4/3与pCI-ChIL-18和pCI-VP2/4/3的免疫效果无显著差异,保护率均为73.3%;但均优于单独使用重组质粒pCI-VP2/4/3组,保护率为60.0%。本实验为进一步研究ChIL-18的分子免疫佐剂作用及研制高效、价廉的IBDV DNA疫苗提供了实验依据。     

白细胞介素-12对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用

犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒重要的结构蛋白和抗原蛋白。利用VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应。为进一步提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平,本研究在小鼠体内尝试了利用白细胞介素12（IL-12）基因表达载体提高VP2DNA疫苗的免疫应答水平。首先采用RT-PCR方法从小鼠脾淋巴细胞中分别扩增IL-12大亚基（P40）和小亚基（P35）cDNA基因;然后在真核表达载体pcDNA3.1A上通过引入内部核糖体进入位点（IRES）序列,分别将P40基因和P35基因插入到IRES序列的上下游,构建成IL-12（P40和P35双亚基）基因表达载体,pcDNA-P40-IRES-P35。将上述表达载体与本室构建的VP2表达载体通过磷酸钙方法转染HEK 293T细胞进行瞬时表达,以确定构建的表达载体能否介导相应基因在真核细胞中进行分泌表达。然后用VP2载体单免疫和VP2载体和IL-12载体共免疫方法对小鼠进行免疫（用pcDNA3.1A作为对照）。免疫后在特定时间通过ELISA方法检测小鼠血清抗VP2蛋白的抗体水平,并通过淋巴细胞增殖实验检测免疫后35d小鼠脾脏淋巴细胞增殖反应。结果表明,扩增的小鼠IL-12P40和P35亚基基因与GenBank的参考序列基本一致。Western-blot检测结果表明,重组IL-12和VP2均能够在HEK293T细胞中进行分泌性表达。ELISA检测结果表明利用IL-2载体与VP2载体共免疫小鼠,其血清中抗VP2的抗体水平明显高于VP2载体单免疫组（P〈0.01）,抗体水平在第35天高达1：5120。淋巴细胞增殖试验结果表明,免疫小鼠的淋巴细胞刺激指数均明显高于对照组（P〈0.01）,VP2载体与IL2载体共免疫组的刺激指数明显高于VP2载体单免疫组（P〈0.05）。由此可见,在小鼠体内,IL-12基因表达载体可明显提高CPV VP2基因疫苗的免疫应答水平。     

禽传染性支气管炎DNA疫苗在鸡体内的分布和安全性

采用本实验室构建的3种禽传染性支气管炎病毒基因的真核表达质粒pIBVS1、pIBVM、pIBVN,按各50 mg/L配制成质量浓度为150 mg/L的DNA疫苗,经腿部肌肉分点注射免疫1周龄SPF雏鸡。分别在免疫后24 h,73、0及60d,采集试验鸡的血液、心、肝、脾、肺、肾、胸腺、性腺（卵巢/睾丸）及注射部位肌肉进行组织总DNA抽提,以组织总DNA为模板进行PCR扩增。另外,在对照组DNA模板中加入不同拷贝数的质粒,确定PCR反应的灵敏性。以纯化后的组织总DNA为模板,PCR法检测质粒DNA整合到鸡细胞染色体基因组上的可能性,评价疫苗的安全性。结果表明,该疫苗在24 h内迅速分布于全身,并能在血液及所有检测的组织器官内持续分布60 d;纯化后的组织基因组DNA经PCR扩增均呈阴性,未发现整合现象,证实该DNA疫苗的安全性好。     

IL-18增强日本血吸虫DNA疫苗Sj23的免疫保护效果

将小鼠IL-18基因和日本血吸虫Sj23膜蛋白基因分别插入pVAX1载体,构建真核表达质粒pVAX/mIL-18和pVAX/Sj23,联合或单独免疫小鼠,以pVAX1空载体作对照,免疫2次,间隔2周,2次免疫后4周攻击日本血吸虫尾蚴.体液和细胞免疫检测结果表明,联合免疫组能诱导小鼠产生较强的抗日本血吸虫成虫可溶性抗原(SWAP)IgG,较高水平的IFN-γ和IL-2.攻虫试验表明,联合免疫小鼠成虫减虫率和肝脏减卵率分别达41.6%和49.4%,明显高于pVAX/Sj23单独免疫组(减虫率和肝脏减卵率分别为26.5%和41.4%).以上试验结果表明,IL-18能明显增强Sj23 DNA疫苗在小鼠体内的免疫应答,并且产生较强的保护作用.     

犬GM-CSF基因对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用

犬细小病毒编码的VP2蛋白是该病毒重要的结构蛋白和抗原蛋白.利用VP2基因制备的DNA疫苗能够刺激机体产生免疫应答反应.为进一步提高VP2 DNA疫苗的免疫活性,本实验利用犬粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因作为生物佐剂研究其对犬细小病毒VP2 DNA疫苗的免疫增强作用.首先通过RT-PCR方法从犬淋巴细胞中扩增GM-CSF基因,并将其插入到pcDNA3.1栽体上,分别构建该基因的两个分泌型真核表达载体,即非融合表达载体pcDNA-cGMCSF和与Myc His融合的表达栽体pcDNA-cGMCSF/MH.用pcDNA-cGMCSF/MH载体转染HEK293T细胞以确定GM-CSF基因能否在真核细胞中进行分泌表达.然后用本室构建的VP2基因表达栽体单免疫小鼠,用VP2表达载体与pcDNA-cGMCSF共免疫小鼠(pcDNA3.1空载体作为阴性对照).免疫后用ELISA方法检测不同时间小鼠血清的抗体水平.用MTT法检测小鼠免疫后35 d时淋巴细胞的增殖活性,同时用ELISA试剂盒检测小鼠淋巴细胞γ干扰素的表达水平.结果表明,本试验构建的表达载体能够介导重组GM-CSF在真核细胞中进行分泌表达.免疫实验表明,利用GM-CSF基因与VP2基因共免疫小鼠,抗体的水平明显高于VP2基因单免疫组(P＜0.01).共免疫组小鼠淋巴细胞的刺激指数和γ干扰素的表达水平均明显高于单免疫组(P＜0.05).由此可见,GM-CSF表达载体可明显提高CPV VP2 DNA疫苗的免疫应答水平.     

Co-expression of EtMic2 protein and chicken interleukin-18 for DNA vaccine against chicken coccidiosis

In the present study, a naked EtMIC2 DNA vaccine, a ChIL-18 expression vector and a EtMIC2 and ChIL-18 co-expression DNA vaccine were constructed and their protective efficacies against homologous challenge were compared and evaluated by examining the body weight gain, oocyst shedding, cecal lesion, ACI as well as specific anti-EtMic2 antibody level, the proliferation ability and percentages of CD4+ and CD8+ of splenocytes. The results showed the naked EtMIC2 DNA vaccine could increase the weight gain and decrease the oocyst shedding, but could not alleviate the cecal lesion of immunized chickens compared to unimmunized chickens. Chickens immunized with the co-expression vector pVAX1-MIC2-IL-18 exhibited much improved immune protection against challenge compared to chickens immunized with naked EtMIC2 DNA vaccine, or with naked EtMIC2 DNA vaccine and ChIL-18 expression vector applied separately. These results suggest that the co-expression of ChIL-18 with EtMic2 together could significantly improve the immune protection of the EtMic2 protein.