中国明对虾血浆蛋白质组学研究中高丰度蛋白的超速离心去除技术

应用超速离心技术对中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)血浆样品进行处理,比较去除和未去除高丰度蛋白血浆的双向凝胶电泳(2-DE)图谱。结果表明:对虾血浆高丰度蛋白经去除后,血浆样品中的低丰度蛋白得到较好的分离和浓缩。未处理样品的2-DE图谱分离的蛋白质170个,而去除高丰度蛋白后血浆2-DE图谱上分辨率增高,分离出蛋白质点520个,一些低丰度蛋白质被有效分离出来。研究证实,超速离心技术可有效去除对虾血浆高丰度蛋白(血蓝蛋白),提高低丰度蛋白的检出敏感性,为对虾等甲壳动物的血浆蛋白质组学研究提供了基础保障。     

中国明对虾肌肉组织蛋白质双向电泳技术体系的建立

为了探索并建立中国明对虾的肌肉蛋白双向电泳体系,实验将中国明对虾的肌肉组织溶解处理后,通过固相pH梯度胶条等电聚焦、SDS-PAGE垂直电泳对蛋白质进行分离,对不同的裂解液配方、IPG胶条的pH范围及其长度、等电聚焦程序、上样量等进行了优化,并分别利用银染和考染方法进行染色,应用PDQuest软件对图谱进行了初步分析.结果显示,中国明对虾肌肉蛋白的等电点主要位于4～7之间,裂解液中添加硫脲、CHAPS、DTT等,可以增加对虾肌肉蛋白的提取率;采用17 cm,pH 4～7的中型IPG胶条,主动水化上样120μg,适当延长除盐时间和等电聚焦时间,搭建盐桥,采用浓度为12.5％的二向分离胶和硝酸银染色,能有效提高双向电泳(2-DE)图谱中蛋白点的分离度和分辨率;建立的中国明对虾肌肉蛋白双向电泳体系具有良好的重复性和稳定性.     

斑节对虾血淋巴低丰度蛋白双向电泳技术体系的优化

文章探索并优化了斑节对虾（Penaeus monodon）血淋巴双向电泳技术体系,对斑节对虾血淋巴总蛋白抽提方法进行优化,减小高丰度蛋白的影响;对双向电泳过程各步骤,如IPG胶条pH范围的选择、等电聚焦程序、上样量等进行了优化,得到高分辨率的2-DE图谱,用PDQuest软件进行了初步分析。结果表明,用PEG 6000能更快捷有效地去除血淋巴中的高丰度蛋白,增加低丰度蛋白的点数及浓度;在抽提蛋白过程中,利用预冷的80%丙酮洗涤,在一向电泳过程中设置100 V低压除盐,能更有效地去除蛋白中的盐分;采用18 cm、pH 3~10 NL 的中型胶条,能更好地显示低丰度蛋白点的分布;被动水化上样300 μg结合硝酸银染色方法,能有效提高双向电泳图谱中蛋白点的分离度和分辨率。该试验为斑节对虾及其他甲壳动物血淋巴蛋白质组学相关研究提供了稳定可重复的研究方法。     

溶藻弧菌全菌可溶性蛋白二维图谱的建立及部分蛋白分子的鉴定

本研究采用蛋白质组学技术,建立了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ZJ03培养至稳定期的蛋白质组双向电泳图谱,并对部分蛋白分子进行了肽质量指纹图谱分析鉴定。首先将溶藻弧菌接种于TSB培养基28℃培养24 h,利用裂解液裂解细菌,提取全菌可溶性蛋白,荧光染料标记,24 cm pH4 ～ 7的胶条进行等电聚焦,再用12.5%的胶进行SDS-PAGE。2-D胶经过分析,得到902±8个蛋白斑点,重复胶的匹配点数为866±28,匹配率为96%。从双向电泳图谱中选取68个高丰度蛋白质点进行肽质量指纹图谱鉴定,其中60个在NMPDR数据库中得到鉴定,另外8个在NCBI数据库中得到鉴定。鉴定的蛋白中发现Serine protein kinase、purine nucleoside phosphorylase 和Alkyl hydroperoxide reductase subunit C-like protein存在修饰现象,它们在胶上均有2种表现形式。对68个蛋白进行了细胞功能的分类,发现能量代谢蛋白最多,占43%;其次是转运和结合蛋白,占9%;第三是外膜蛋白,占8%。经CMR操纵子预测软件分析预测到2个操纵子,它们均参与了能量代谢过程。研究结果为溶藻弧菌在不同生长条件下的比较蛋白质组学以及该菌强毒株和无毒株的比较研究提供了基础资料。     

草鱼鳃组织蛋白双向电泳技术的建立及优化

为建立并优化草鱼鳃蛋白质组双向电泳的技术体系,实验将草鱼鳃经裂解处理后,通过固相p H梯度胶条进行一向等电聚焦和SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳进行蛋白分离,对不同的裂解液配方、蛋白纯化方法、IPG胶条的分离范围、上样量和染色方法等进行了探索和优化,并应用lmage Master 2D Platinum 7.0软件对电泳图谱进行了分析。结果表明:采用裂解液中添加DTT来取代Tris和TBP、选择分离范围为pH4-7的IPG胶条和150μg的主动水化上样,电泳结束后对凝胶进行硝酸银染色,获得了覆盖范围广、低背景、高分辨率、适合差异蛋白分析的双向电泳参考图谱。     

刺参肠组织蛋白质双向电泳体系的建立及优化

以刺参肠组织为材料,通过蛋白质提取方法、上样前处理方法、上样量以及聚焦条件的优化,建立了刺参肠组织蛋白质双向电泳技术体系.试验结果表明,采用TCA-丙酮沉淀法制备刺参肠组织蛋白质,能够得到高纯度的蛋白质提取液.刺参样品上样前不经过处理,等电聚焦电压1 000V,电流7mA,聚焦时间3h,平衡时间30min,最佳上样量25μg,pH 4～6.5、8.5cm的IPG胶条,银染能获得较好的双向电泳图谱.通过蛋白质双向电泳体系的优化,获得了刺参肠组织的蛋白质表达图谱,为进一步研究刺参差异表达蛋白的筛选及蛋白质组学研究提供技术保障     

大黄鱼肝脏蛋白质组双向电泳技术的建立及优化

通过对不同裂解液配方、等电聚焦程序和上样量等条件的对比试验,建立和优化了大黄鱼肝脏蛋白质组双向电泳的相关技术体系。试验结果表明,裂解液中添加Tris和TBP,聚焦时适当延长除盐时间,提高聚焦电压和功率,能显著提高双向电泳图谱的分辨率,而17 cm pH 5~8 IPG胶条的最佳上样量为2.0 mg。通过相关条件优化提高了大黄鱼肝脏蛋白双向电泳图谱的分辨率,为大黄鱼肝脏蛋白质组学的进一步研究奠定了基础。     

拥挤条件下中国明对虾肝胰脏蛋白质双向电泳条件优化与分析

以中国明对虾为试验对象,优化了拥挤应激条件下中国明对虾肝胰脏蛋白质双向电泳的条件,并分析了关联的差异蛋白质。试验结果表明,中国明对虾肝胰脏蛋白双向电泳优化条件为裂解液中添加三丁基膦,采用17 cm的固相p H值（p H 4～7）梯度干胶条,上样量为120μg ,等电聚焦时间为65000 V／h。蛋白图谱分析结果显示,得到的700多个蛋白点中差异蛋白点11个,其中8个差异蛋白点丰度显著上调（P ＜0．05）,3个差异蛋白点丰度显著下调（P ＜0．05）。研究表明,在拥挤应激条件下中国明对虾肝胰脏蛋白表达发生显著变化。     

用免疫蛋白质组学方法筛选哈氏弧菌免疫反应蛋白

用免疫蛋白质组学的研究方法鉴定了哈氏弧菌的免疫反应蛋白。将哈氏弧菌接种于TSB培养基28℃培养18h,利用裂解液裂解细菌,提取全菌可溶性蛋白,一向电泳采用7cmpH4～7的胶条进行等电聚焦,二向用12.5%的SDS-PAGE胶分离蛋白质,考马斯亮蓝染色,获得双向电泳图谱,再结合免疫转印技术检测免疫反应的蛋白质,利用ImageMaster 2D Platinum进行配对分析得到15个非特异性的免疫反应性蛋白点,30个特异性的免疫反应性蛋白点。经过鉴定得到13种非特异性的免疫反应性蛋白质,这其中有2对蛋白在胶上的位置不同,但鉴定为同一种蛋白;同时得到28种特异性的免疫反应性蛋白质,有一个蛋白点没有在数据库中查找到相对应的蛋白质,还有1对蛋白在胶上的位置不同,但鉴定为同一种蛋白。将特异性免疫反应蛋白鉴定结果与非特异性比较发现有1对蛋白鉴定为同一种蛋白;另外,No.17和No.19是F0F1 ATP synthase的两个亚基。特异性免疫反应蛋白鉴定结果中有6个蛋白质是已知的其他细菌的具有免疫反应的蛋白,分别为OmpN,OmpW,OmpU,alanine dehydrogenase,Elongation factor...     

鲫皮肤蛋白质组双向电泳与部分蛋白点的质谱鉴定

为了建立鱼类皮肤蛋白质组双向电泳图谱及质谱鉴定,以鲫为实验动物,采用蛋白双向电泳(2-DE)结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF-MS)技术,进行鲫皮肤的蛋白质组学研究。结果表明,当上样量为800μg,采用18 cm、p H3~10 IPG胶条,等电聚焦80 000 Vh,2-DE图谱检测为214个皮肤蛋白点,匹配率达88%;对其中31个蛋白点进行MS/MS鉴定为22种蛋白,包括肌球蛋白、肌动蛋白、角蛋白、锌指蛋白585B、效应蛋白Rab15、卷曲螺旋结构域蛋白168、NCK1相关蛋白,肌酸激酶、烯醇化酶、丙酮酸脱氢酶、腺苷酸激酶同工酶等;进行蛋白功能聚类(GO)分析发现12种生物学过程,主要参与代谢、细胞、有机体、免疫应答、生物调节和信号等过程。本研究首次初步揭示鲫皮肤蛋白质组及分子机制,以期为鱼类病害的预防和治疗提供科学参考。     

中国对虾血淋巴凝集素的血凝活性与促噬活性

1999年8月，运用血凝活性测定法分别检测中国对虾血淋巴弹簧集素，血淋巴液、血细胞、肌肉、肠、肝胰腺和甲壳的血凝活力，并运用吖啶橙血细胞吞噬测定法检测血细胞的吞噬活力，同时测定了经注射中国对虾副粘病毒提纯液后血淋巴凝集素血凝活力及血淋巴液抗菌活力、酚氧化酶活力、溶菌活力，结果表明，血淋巴凝集素主要分布在血淋巴液和血细胞中；该凝集素对人（A、B、O型），鸡和兔红细胞及其醛化红细胞的凝集具有一定专一性；对血细胞吞噬异物具有促进功能；注射副粘病毒提纯液后，血淋巴凝集素凝集活力变化和血淋巴液抗菌活力，酚氧化酶活力、溶菌活力变化相一致。     

环境因子和生物自身因子对中国明对虾渗透浓度和离子浓度的影响

本文检验了环境因子和生物自身因子对中国明对虾渗透浓度和离子浓度的影响。研究结果表明:①盐度变化对中国明对虾血淋巴渗透浓度有极显著影响;对血淋巴中钠、氯离子浓度有显著影响,而对钾离子浓度影响不显著。②在同一生长期,性别、体长、体重等自身因子对中国明对虾血淋巴渗透浓度和钠、钾、氯离子浓度均无显著影响。③水温对中国明对虾血淋巴离子调节能力有显著影响,但对血淋巴中钠、氯离子浓度的影响还受到盐度的制约。     

恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星在拟穴青蟹体内的药代动力学

采用高效液相色谱法,研究盐度33条件下恩诺沙星口灌和肌肉注射给药(剂量10 mg/kg)后,恩诺沙星及其代谢物环丙沙星在拟穴青蟹体内的药代动力学和组织分布。血淋巴和组织中药代动力学参数采用基于统计矩原理的非房室模型进行计算。恩诺沙星口灌和肌肉注射拟穴青蟹给药后,血药达峰快,分别为0.5 h和1 min,达峰浓度分别为12.90和31.86 μg/mL,曲线下面积(AUC)分别为216.1和816.8 μg/(mL·h)。恩诺沙星在拟穴青蟹组织中分布较广,口灌给药下肌肉和肝胰腺AUC分别为445.9和817.6 μg/(g·h),肌肉注射给药下的AUC分别为554.7和2 573.7 μg/(g·h)。与其它水产动物相比,恩诺沙星在拟穴青蟹体内消除速度为中等水平,口灌和肌肉注射恩诺沙星后血药消除半衰期(t_1/2z)分别为26.45和57.02 h,总体清除率(CL_z)分别为0.054和0.012 L/(h·kg)。恩诺沙星在拟穴青蟹体内代谢生成环丙沙星的量较少,口灌给药下血淋巴、肌肉和肝胰腺的AUC_CIP/AUC_ENR分别为6.66%、3.66%和4.78%,肌肉注射给药下,其相应值分别为4.16%、7.24%和1.48%,在拟穴青蟹体内起药效作用仍是以恩诺沙星为主。以C_max/MIC、AUC_0-24/MIC评价恩诺沙星在青蟹体内的药效作用,建议给拟穴青蟹以10 mg/kg剂量每隔24小时投喂一次恩诺沙星,对弧菌引起的细菌性疾病具有较好的防治效果。     

氨氮胁迫对中国明对虾血淋巴氨氮、尿素氮含量和抗氧化能力的影响

将600尾体重为(5.0±1.2)g的健康中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)随机分为5组,每组6个重复,每个重复20尾虾,分别暴露于不同氨氮质量浓度(0 mg/L、2 mg/L、4 mg/L、6 mg/L和8 mg/L)海水中,于胁迫后6 h、24 h、48 h、72 h和96 h测定血淋巴氨氮、尿素氮含量、总抗氧化能力(T-AOC)、抗超氧阴离子活力和血淋巴细胞过氧化氢酶(CAT)基因、过氧化物还原酶(Prx)基因和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)基因的相对表达量,以0 mg/L氨氮组作为对照。结果显示,随着氨氮胁迫时间的延长,中国明对虾血淋巴氨氮含量逐渐积累,以8 mg/L组对虾血淋巴氨氮含量最高,是对照组的5.85倍。氨氮胁迫6 h,胁迫组中国明对虾血淋巴尿素氮含量显著高于对照组(P0.05),其中6 mg/L组对虾血淋巴尿素氮含量最高,是对照组的2.22倍。氨氮胁迫下中国明对虾血淋巴T-AOC、Prx mRNA相对表达量随着取样时间推移先升高后降低,而血淋巴抗超氧阴离子活力、CAT和caspase mRNA相对表达量随时间增加呈现先上升后下降再上升的变化过程。氨氮胁迫下中国明对虾血淋巴抗氧化能力被显著诱导,这可能破坏机体的氧化-抗氧化系统的平衡,从而导致caspase mRNA相对表达量的上调。     

Dopamine modulates the physiological response of the tiger shrimp Penaeus monodon

Levels of glucose, lactate, pO₂, pCO₂, HCO₃⁻, TCO₂, Na⁺, K⁺, Cl⁻, protein, and oxyhemocyanin in the hemolymph and its osmolality and pH were measured when tiger shrimp, Penaeus monodon (13.5 ± 1.5 g body weight), were individually injected with saline or dopamine at 10^− 8, 10^− 7, or 10^− 6 mol shrimp^− 1. Results showed that hemolymph glucose, lactate, pCO₂, HCO₃⁻, and TCO₂ values increased from 2 to 4 h; hemolymph osmolality, Na⁺, and total protein had increased at 2 h; and hemolymph K⁺ decreased from 2 to 8 h after the dopamine injection. All physiological parameters returned to the control values 4–16 h after receiving dopamine. The dopamine injection also significantly decreased the oxyhemocyanin/protein ratio of P. monodon which occurred at 2 h, resulting from an elevation of hemolymph protein and a slight decrease of oxyhemocyanin. These results suggest that stress-inducing dopamine caused a transient period of modulation of energy metabolism, osmoregulation, respiration, and the acid–base balance in P. monodon in adapting to this environmental stress.     

人工选育中国对虾两个群体WSSV感染相关免疫与生化因子的变化

通过分析中国对虾人工选育两个群体WSSV感染相关免疫与生化因子的变化，研究选育的两个中国对虾群体对WSSV的敏感性和抵抗力。结果表明，两个群体感染WSSV后，总细胞数（THC）在24h达到最大，随后呈下降趋势；两个群体血淋巴蛋白在感染初期和中期变化不同，但在后期均呈下降趋势；相比而言2＇对虾群体比6＇对虾群体血蛋白含量和THC下降幅度稍慢；2＇对虾群体和6＇对虾群体感染24h后酸性磷酸酶（ACP）稍有下降，随后保持较高的活性，而碱性磷酸酶（AKP）的变化除2＇对虾群体在感染48h有显著增大外，6＇对虾群体变化不明显；过氧化氢酶（CAT）、活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）与WSSV感染有密切的联系，两个群体抗氧化酶活性随WSSV增殖的变化略有不同；细胞内酚氧化酶（proPO）原变化趋势也表现出差异，斑点杂交结果显示6＇对虾群体比2＇对虾群体阳性反应较早，揭示不同群体间对WSSV感染的敏感性存在一些差异。     

马氏珠母贝基质金属蛋白酶基因MMP-17的克隆及表达分析

基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)是一种能够降解细胞外基质的蛋白水解酶。MMP-17是一种膜型基质金属蛋白酶,通过糖基磷脂酰肌醇连接于细胞表面,参与调控有机体的内环境稳定、宿主防御等多种生理过程。为研究MMP-17在马氏珠母贝免疫反应中的作用,实验运用RACE技术,克隆得到马氏珠母贝MMP-17(Pinctada martensii MMP,Pm-MMP-17)基因cDNA 全长序列,并对其序列特征及功能进行初步分析。结果显示,Pm-MMP-17基因cDNA全长2 794 bp,开放阅读框(ORF)为1 923 bp,编码640个氨基酸,5'UTR长156 bp,3'UTR长715 bp,分子量约为73.11 ku,等电点为8.98;多序列比对和系统进化树分析表明,Pm-MMP-17与其他物种的MMP具有较高的保守性,与长牡蛎的MMP-17相似性高达82%;功能结构域分析表明,Pm-MMP-17有5个高度保守的结构区域:N-末端的信号肽、前导区、催化区、铰链区和C-末端的类血红素结合蛋白区;荧光定量数据分析表明,Pm-MMP-17基因在马氏珠母贝的闭壳肌、珍珠囊、足、外套膜、血淋巴、肝胰腺、性腺、鳃等8个组织中均有表达,在血液中的表达量最高,闭壳肌和鳃次之;脂多糖(LPS)刺激后,Pm-MMP-17基因表达水平上调,12 h后达到最大值,之后又逐渐下调并恢复到正常水平。研究表明,Pm-MMP-17基因可能在马氏珠母贝的免疫反应中起着重要作用。     

中国对虾肝胰腺_卵巢及血淋巴中的_省略_雌二醇含量的生殖周期变化

首次证实了孕酮和雌二醇这两种类固醇激素在中国对虾体内的存在.在性腺未发育阶段,肝胰腺、卵巢和血液中两种激素的含量均很低氐,难以检测到.而在卵黄发生前期(核仁周边期),三种组织中孕酮和雌二醇含量迅速上升,卵巢的雌二醇含量达到高峰(450.1±86.7).进入初级卵黄发生阶段,三种组织中,两种激素均具较高含量,卵巢和肝胰腺的孕酮含量(分别为1975 1±175.2和902.6±130.5pg/g)以及血淋巴中的雌二醇含量(451.3±73.7)达到高峰.到了次级卵黄发生阶段,孕酮和雌二醇的含量迅速下降,肝胰腺等组织中儿乎检测不到.对虾性腺指数(GSl)的增长既显著且有规律性,每一期增长幅度都达到或超过l00%.肝胰腺指数(HSI)从性腺未发育期(3.4±04)到卵黄发生前期(4.9±0 7)以及从卵黄发生前期到初级卵H黄发生期(6.3±1.0)有显著的增长,而从初级卵黄发生期到次级卵黄发生期HSI增长不显著(6.7±1.2).肝胰腺指数的增长与两种类固醇激素含量的变化具相似的趋势.上述结果显示,孕酮和雌二醇可能具有刺激和凋控中国对虾性腺发育的作用,肝胰腺可能是卵黄蛋白原的合成场所.     

Hemagglutinating activity and electrophoretic pattern of hemolymph serum proteins of Penaeus monodon and Macrobrachium rosenbergii to white spot syndrome virus injections

The giant fresh water prawn Macrobrachium rosenbergii is known to be highly tolerant to white spot syndrome virus (WSSV) infections when compared to the widely cultured marine tiger shrimp Penaeus monodon. At present, the exact mechanism of tolerance by M. rosenbergii to WSSV is not known. In this study, we attempt to study the effect of WSSV injections on the hemagglutination activity of the hemolymph serum of both P. monodon and M. rosenbergii and look for changes if any, on their hemolymph serum protein electrophoretic patterns. Our results show that M. rosenbergii had significantly (p < 0.05) higher hemagglutinating activity against mouse erythrocytes when compared to P. monodon. As the infection progressed to 48 h there was a further increase (p < 0.05) in the hemagglutination activity in M. rosenbergii, while it decreased in P. monodon. 12% SDS-PAGE analysis of the hemolymph serum of M. rosenbergii infected with WSSV did not show any new protein bands, whereas few bands with decreased intensity was observed in moribund P. monodon where the hemagglutinating activity was also observed to be decreased. The results indicate that hemolymph hemagglutinin levels are modulated in crustaceans as a response to viral infections.     

Evaluation of hemato-immunological parameters during the reproductive cycle of the scallop Nodipecten nodosus in association with a carotenoid-enriched diet

The cultivation of scallops Nodipecten nodosus is a promising activity emerging in Brazil. The purpose of this study was to characterize the immune system of N. nodosus and evaluate the modulation of some hemato-immunological parameters during the reproductive cycle, in association with an astaxanthin-enriched diet. It was hypothesized that a supplementation on astaxanthin could enhance scallop immune system and minimize stress of reproduction. Scallops were separated in different groups: juveniles (J), adults (A), sexually mature (M), and recently spawned (S) animals. The last two groups were fed standard (M and S) or astaxanthin-enriched (Ma and Sa) diets. Scallop hemolymph contained two hemocyte populations: hyaline (HH) and granular hemocytes (GH). Antimicrobial peptides, similar to mussel defensins and mytilins, were found by immunodetection within the GH granules, even though the scallop hemolymph did not exhibit significant antimicrobial activity against different bacteria, including marine vibrios. Scallop hemocytes were able to phagocytose zymosan and produce reactive oxygen intermediates (ROI–NBT reduction). The number of circulating hemocytes (Neubauer chamber) varied from 12 to 26.10⁶ cells mL^− 1, and the GH was always the predominant cell type (67–99%). The plasma of N. nodosus contained lectins, specific to galactose and sialoconjugates, and their agglutinating activity was partially calcium-dependent. A phenoloxidase (PO) activity (146–446 U min^− 1 mg^− 1) was observed in the scallop hemolymph. However, this activity was not induced by trypsin or components of microorganism surface, and was strongly enhanced by alkaline pH (≥ 8.5). The total protein concentration of the plasma varied from 240 to 660 μg mL^− 1. In general terms, all examined hemato-immunological parameters (hemograms, superoxide anion production, PO activity, lectin titers and total protein concentration) had a similar profile during all the scallop reproductive cycle. Their levels increased significantly from juveniles to adults (except PO activity), and declined markedly (immune depletion) in the sexually mature scallops. After spawning, the animals had a tendency to recover the standard levels of their immune parameters. Apparently, the astaxanthin-enriched diet had no effect on the tested immune parameters except for a slight influence on the scallop immune-oxidative reactions (ROI production). The results obtained in this study suggested the occurrence of a general immune depletion in the sexually mature scallops, confirming that the reproductive stage is a critical period in scallop life.