有丝分裂雌核发育牙鲆的微卫星鉴定

通过静水压抑制卵裂方法获得多个牙鲆(Paralichthys olivaceus)有丝分裂雌核发育家系,在仔鱼阶段经历大批死亡后,将各个家系残存的个体混合饲养,24个月后获得1批存活个体。利用11对微卫星分子标记,对173尾有丝分裂雌核发育牙鲆进行分析,结果表明,其中111尾在11位点全部纯合,62尾在部分位点杂合,平均杂合子比例为0.2338。11个位点的等位基因数为4～8,平均等位基因数为5.0336,有效等位基因数为2.0421～5.1268,平均有效等位基因数为3.2815。采用NJ法对111尾纯合牙鲆的亲缘关系进行聚类分析,可分为4群。微卫星标记鉴定结果表明,通过静水压抑制卵裂法可以获得完全纯合的牙鲆,但有部分杂合个体出现。分析其原因,可能是由于某些卵子发育不同步,静水压抑制其第二极体排出而非全部抑制卵裂,导致减数分裂雌核发育所致。     

牙鲆有丝分裂雌核发育二倍体的制备

本研究采用紫外线灭活的真鲷(Pagrus major)精子激活牙鲆(Paralichthys olivaceus)卵子, 经过静水压机处理诱导有丝分裂雌核发育二倍体。优选施压起始时间、持续时间和压力大小3个方面参数, 获得最佳参数组合为: 起始时间60 min、持续时间6 min、施加压力650 kg/cm²。在此条件下的受精率最高为67.80%, 孵化率54.23%, 与其他处理组间达显著性差异(P<0.05)。用流式细胞仪检测未经静水压处理的胚胎, 其DNA含量约为普通二倍体的1/2, 即单倍体; 检测有丝分裂雌核发育胚胎, 其DNA含量与普通二倍体大体一致。结果表明, 应用该方法可成功诱导获得牙鲆有丝分裂雌核发育二倍体。

     

有丝分裂雌核发育牙鲆不育的组织学观察及微卫星标记筛选

在有丝分裂雌核发育牙鲆(Paralichthys olivaceus)中出现数量较多的不育个体,利用组织切片观察比较不育牙鲆的组织学特点,利用分离群体分组分析法筛选不育相关的微卫星标记。结果表明:不育牙鲆的性腺指数为3.77%~4.17%,显著小于可育牙鲆(P0.05)。不育牙鲆的卵巢微血管较少,卵巢膜呈现白色,卵巢较硬,没有游离卵粒;切片结果显示,其卵巢处于Ⅲ期。通过对209个微卫星标记的筛选,共找到11个在可育和不育群体间有差异的标记;利用同一家系可育和不育的个体进行验证后发现,位于15号连锁群的4个标记与牙鲆的育性紧密相关。     

真鲷精子诱导牙鲆减数分裂雌核发育

采用真鲷精子激活牙鲆卵子,经(0±0.5)℃冷休克处理,诱导了牙鲆减数分裂雌核发育。灭活真鲷精子,紫外线照射剂量3.4mJ/cm2时孵化率最低;随着照射剂量的增加,孵化率恢复,照射剂量73mJ/cm2时,孵化率最高,呈现典型的Hertwig效应。用流式细胞仪检测倍性,未经冷休克处理的胚胎全部为单倍体,经冷休克处理的均为二倍体,表明精子灭活有效。冷休克实验结果表明,冷休克起始时间2～5min均有效,以3min为最好;冷休克持续时间30～90min均有效,以45min为最好。综合两项因素,授精3min后,休克时间持续45min组的授精率和孵化率均为最高,与其他处理组差异显著(P<0.05)。RAPD分析结果显示,异源精子的遗传信息未在雌核发育二倍体的电泳图中出现,表明其遗传信息没有传递给子代。     

牙鲆连续四代减数分裂雌核发育家系的遗传特征分析

为了研究纯合度和遗传相似度在牙鲆(Paralichthys olivaceus)连续四代减数分裂雌核发育家系中的变化规律,本研究利用分布在不同连锁群上的24个高重组率微卫星标记对牙鲆连续减数分裂雌核发育二代(G2)、三代(G3)、四代(G4)家系及普通家系对照组进行了遗传分析。结果显示,24个微卫星位点在对照组、G2、G3、G4家系中,分别检测到96、42、32和32个等位基因,平均等位基因数分别为4.00、1.98、1.33和1.33;期望杂合度分别为0.6416、0.3472、0.1694和0.1492;纯合度分别为0.3503、0.6528、0.8306和0.8508;遗传相似系数分别为0.5822、0.9238、0.9890和0.9988。24个位点中已有17个纯合,但尚有7个保持杂合状态。同时,将上述结果和已发表的减数分裂雌核发育一代(G1)家系的数据进行分析,结果表明,诱导连续减数分裂雌核发育不仅能提高个体的纯合度,同时也可提高子代个体间的遗传相似度;纯合度和遗传相似度在G1、G2和G3家系中能够得到逐步提高,代际之间差异显著(P<0.05);但在G4家系中趋于稳定,与G3家系差异不显著。G4家系的遗传相似性(0.9988)已高于连续20代全同胞交配所获得的理论值(0.9860),连续诱导减数分裂雌核发育是快速建立鱼类近交系的良好方法。     

牙鲆连续两代减数分裂雌核发育家系的遗传特征

对牙鲆(Paralichthys olivaceus)减数分裂雌核发育二倍体(Meio-G1)再次诱导减数分裂雌核发育,获得连续两代雌核发育二倍体家系(Meio-G2),以Meio-G1亲本与1尾普通牙鲆雄鱼人工授精获得的家系作为对照组(control)。利用15个微卫星标记对3个家系进行遗传特征分析。结果显示,15个微卫星位点在Meio-G1、Meio-G2和对照组3个家系中,分别扩增到30、28、50个等位基因,平均等位基因数为2.0、1.9、3.3,平均观测杂合度(Ho)分别为0.875 3、0.774 2、0.908 3,平均纯合度分别为0.124 7、0.221 5、0.091 7。3个家系个体间的平均遗传相似系数分别为0.891 7、0.923 8、0.520 2,亲代与子代之间的平均相似系数分别为0.916 6、0.930 4、0.560 3。高重组率的Poli9-8tuf、Poli18tuf、Poli107tuf 3个位点在Meio-G1和Meio-G2中观测杂合度均为1.0,低重组率的Poli33tuf、Poli24MHFS两个位点在Meio-G1和Meio-G2中均全部纯合,观测杂合度为0。结果表明,Meio-G2的纯合度、个体间平均相似系数以及亲子之间的平均相似度均略高于Meio-G1,显著高于对照组家系,证明连续两代诱导减数分裂雌核发育,能提高鱼类纯合度和遗传相似度,具有固定母本遗传性状的作用。     

雌核发育牙鲆与普通牙鲆的肌肉营养成分比较

测定了牙鲆Paralichthys olivaceus幼鱼肌肉的水分、粗蛋白、粗脂肪和粗灰分,分析了肌肉氨基酸和脂肪酸组成及含量,对普通牙鲆和雌核发育牙鲆肌肉的营养成分进行了比较。牙鲆肌肉中粗蛋白含量均较高,达到21.3%,鲜味氨基酸——谷氨酸在所有氨基酸中含量最高,占到总量的2.9%,且不饱和脂肪酸具有较高水平。测定结果表明,普通牙鲆雌、雄个体间肌肉营养组成和含量无显著性差异(P0.05),雌核发育牙鲆与普通牙鲆雌、雄间亦无显著差异(P0.05);雌核发育牙鲆与普通牙鲆肌肉相比,其营养组成无明显差别,同样具有营养丰富、组成均衡等优点,雌核发育对鱼类营养成分并无不良影响。     

异源精子诱导犬齿牙鲆雌核发育

用冷冻保存的花鲈精子作为异源精子,采用紫外线（UV）对精子进行照射使其遗传物质失活,然后与卵子进行“授精”,可以刺激犬齿牙鲆鱼卵进行雌核发育,在受精后一定时间采用冷休克处理“授精”卵,抑制第二极体排出成功获得了犬齿牙鲆雌核发育二倍体鱼苗。实验表明：犬齿牙鲆同源精子经80 mJ/cm² 的紫外线照射可以完全失活,冻存花鲈精子经紫外线照射后也同样具有诱导犬齿牙鲆雌核发育的能力。无论同源精子还是异源精子,最佳诱导条件为在18 ℃条件下,精子经80 mJ/cm²的紫外线照射,受精后4~5 min将受精卵放在3 ℃海水中进行冷休克处理,持续时间为45 min,同源精子和异源精子二倍体诱导分别为32.66%±7.03%和28.00%±6.48%。采用形态学、流式细胞仪DNA含量分析和微卫星标记技术对雌核发育鱼苗进行了分析,证明了雌核发育鱼苗为雌核发育二倍体。     

牙鲆雌核发育研究进展

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是一种重要的海水经济鱼类,其雌性生长速度显著快于雄性。因此,生产全雌牙鲆对提高养殖产量和经济效益具有重要意义。雌核发育是一种特殊的有性生殖方式,在这种生殖方式中,灭活的精子进入卵子,激活胚胎发育,但精核不与卵核融合形成合子,所以雌核发育的个体只具有母本的遗传信息。目前,牙鲆已成为雌核发育技术应用于产业的代表性鱼类。本文对牙鲆人工诱导雌核发育的研究进展进行综述,介绍牙鲆减数分裂雌核发育和有丝分裂雌核发育的诱导方法,以及雌核发育技术在性别控制、克隆制备等育种研究中的应用。最后,作者提出"雌核发育育种体系"构想,并对其在鱼类育种和遗传研究中的应用前景进行展望。     

异源精子诱导犬齿牙鲆的雌核发育

用冷冻保存的花鲈精子作为异源精子,采用紫外线(UV)对精子进行照射使其遗传物质失活,然后与卵子进行"授精",可以刺激犬齿牙鲆鱼卵进行雌核发育,在受精后一定时间采用冷休克处理"授精"卵,抑制第二极体排出成功获得了犬齿牙鲆雌核发育二倍体鱼苗.实验表明:犬齿牙鲆同源精子经80 mJ/cm2的紫外线照射可以完全失活,冻存花鲈精子经紫外线照射后也同样具有诱导犬齿牙鲆雌核发育的能力.无论同源精子还是异源精子,最佳诱导条件为在18℃条件下,精子经80 mJ/cm2的紫外线照射,受精后4～5 min将受精卵放在3℃海水中进行冷休克处理,持续时间为45 min,同源精子和异源精子二倍体诱导分别为32.66%±7.03%和28.00%±6.48%.采用形态学、流式细胞仪DNA含量分析和微卫星标记技术对雌核发育鱼苗进行了分析,证明了雌核发育鱼苗为雌核发育二倍体.     

Fast development of genetically uniform strains by gynogenesis in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus)

The Japanese flounder is a major species in both aquaculture and research. Inbred strains of Japanese flounder were developed efficiently in our laboratory by meiotic and mitotic gynogenetic reproduction techniques. To determine the induction efficiency of gynogenesis and the rate at which full homozygosity is produced, six meiotic gynogenetic females (G1–G6) that had experienced meiotic gynogenesis once and three common females (C1–C3) were selected for production of mitotic gynogenesis in our experiments. Of the nine adult females, all six gynogenetic fish successfully produced viable offspring. However, only one of the three common fish did. Using microsatellite markers, we estimated the homozygosity of gynogenetic fish induced by mitotic gynogenesis. We found that the homozygosity of seven lines (C1, G1–G6) increased quickly, individually from 43%, 72%, 69%, 71%, 78%, 69% and 58% to 100%, 100%, 100%, 90%, 100%, 100% and 90% offspring complete homozygosity. Under mitotic gynogenesis, individuals with higher homozygosity had a higher induction rate. The G4 line showed the highest induction rate, achieving 44.59% convert hatching rate and 29.28% convert normality rate. We conclude that meiotic gynogenesis may be a feasible method to produce DH genetic material in Japanese flounder.     

牙鲆亲本对子代贡献率的实验研究

利用18对高度多态性微卫星标记, 对13尾牙鲆(Paralichthys olivaceus)亲鱼的188尾后代进行亲子鉴定, 计算其非亲排除率、鉴定准确率以及亲本对子代的贡献率。使用4个微卫星标记进行亲子鉴定, 排除率≥0.999 9, 准确率为92.02%; 用6个标记的排除率≥0.999 999, 准确率为96.81%; 用8个标记的排除率≥0.999 999 999, 准确率为97.87%; 用10个标记的准确率为99.47%; 用12～18个标记的准确率为100%。亲子鉴定准确率随非亲排除率和微卫星标记数目的增多而升高。检验所有子代全部是实验亲本的后代, 即13个亲本对子代均有贡献, 但不同亲本的贡献率不同, 最高为47.34%, 最低为0.53%。实验表明, 基于多标记的非亲排除率检测方法可以用于牙鲆亲子鉴定, 其鉴定准确率可以达到100%; 不同亲本对子代贡献率不同, 差异很大, 产生差异的原因有待进一步研究。

     

牙鲆5个养殖群体的遗传多样性分析

利用16对微卫星分子标记对牙鲆（Paralichthys olivaceus）的5个养殖群体进行遗传多样性分析。结果表明,等位基因数为2-9个,平均等位基因数为6．0625;有效等位基因数1．2596-5．5161,平均有效等位基因数3．692;各位点的杂合度观测值（Ho）0．2200-0．8000;杂合度期望值（He）0．2061-0．8187。各群体之间无偏倚杂合度期望值从小到大依次为丹东、北戴河、威海、青岛、荣成。Kruskal-Wallis检验结果（H=0．672,df=4,P=0．955）则说明,5个群体遗传多样性差异不显著。群体间基因分化系数（Gs,）为0．0991,各群体之间存在中度遗传分化。采用UPGMA法对5个群体进行聚类,可分3类：丹东和北戴河各为一类,威海、荣成、青岛为一类,其中威海与荣成群体的分化最小。结合Hardy-Weinberg平衡,拟合度检验和遗传偏离指数（动的分析结果表明,各群体的遗传平衡状况存在很大差别。遗传变异的分析结果说明5群体遗传多样性比较丰富。     

ENU诱变草鱼及其雌核发育后代的微卫星遗传分析

为了获得雌核发育ENU诱变草鱼(Cetpharyngodon idellus)群体的相关遗传参数,实验采用Partec Cy Flow倍性分析仪测定ENU诱变草鱼群体(Q群体)和雌核发育ENU诱变草鱼群体(E群体)相对DNA含量分别为24.02和23.80,二者的DNA含量接近,均为二倍体。选取28个微卫星标记对Q群体和E群体多样性进行了检测。结果表明,E群体和Q群体的平均等位基因分别为3.7143、5.1786,平均有效等位基因分别为2.1857、4.0028,平均期望纯合度分别为0.5122、0.2814,平均期望杂合度分别为0.4878、0.7186,多态信息含量(PIC)平均值分别为0.4282、0.6606。从个体在微卫星位点的纯合率分析,在E群体中,每个个体的纯合度均小于1.00,说明没有完全纯合的个体。从每个微卫星位点在群体的纯合率分析,除了微卫星位点5476,HLJC118和HLJC81外,其他位点的纯合度以不同的速率得到明显的提高。综上所述,经过减数雌核发育方法,ENU诱变草鱼群体的各微卫星位点的纯合度以不同的速率得到提升,遗传多样性明显降低,此方法可以获得纯合度较高的雌核发育ENU诱变草鱼个体,为ENU诱变草鱼良种选育提供了重要的遗传数据资料。     

基于M-C作图鉴定牙鲆不同二倍体的遗传特征

为了分析连锁群上不同位置的微卫星标记对鉴定牙鲆二倍体遗传特征的作用,实验以牙鲆选育基础群体为亲本,选择性腺发育良好的个体制备普通二倍体(ND),减数分裂雌核发育二倍体(MGD-1)、连续两代减数分裂雌核发育二倍体(MGD-2),并利用MGD-1发育达性成熟的雌鱼与同时诱导的性反转伪雄鱼交配制备近交二倍体(MGD1H)。从牙鲆遗传连锁图谱选择均匀分布于24个连锁群的72个微卫星标记,用4个MGD-1家系估计微卫星标记与着丝粒之间的相对距离。在假设无交叉干涉的情况下,17个标记位于着丝粒区域,19个标记位于连锁群中部,36个标记位于远着丝粒区域。分别选择上述区域的微卫星标记鉴定牙鲆4种二倍体的遗传特征。结果显示,4种二倍体的等位基因数(A)和多态信息含量(PIC)在不同区域变化范围较小,ND的A和PIC均为最高,MGD1H则表现为最低。随着标记与着丝粒之间距离的增加,4种二倍体的观测杂合度逐渐升高,纯合度逐渐降低。纯合个体比例在着丝粒区域最高,为8.8%～29.1%;在远着丝粒区域最低,为2.4%～23.2%。其中,MGD-1和MGD-2的变化幅度显著高于其余二倍体。结果表明,选择连锁群上不同位置的微卫星标记对鉴定牙鲆不同二倍体的遗传特征具有显著影响。     

石鲽、牙鲆精子冷冻保存研究及其在人工杂交中的应用

对石鲽(Kareius bicoloratus )和牙鲆(Paralichthys olivaceus)精子冷冻保存技术进行了研究,筛选到一个优良的稀释液MPRS,用MPRS冷冻保存石鲽、牙鲆精子,冻后成活率在70%以上。在石鲽冻精和牙鲆卵的杂交实验中,杂交组受精率是 28 4%±4 55(n=3),孵化率是 42 7%±7 35(n=3),胚胎发育正常;5 000尾杂交鱼苗有102尾成功度过变态期。在牙鲆冻精和大菱鲆卵的杂交实验中,杂交组的受精率只有2 7%,部分受精卵虽能孵化出膜,但仔鱼全为畸形。这两个杂交实验,特别是石鲽冻精和牙鲆卵的杂交实验,证实了冷冻保存的精子完全可以应用在杂交育种工作中。