羊草Class Ⅱ几丁质酶基因的克隆及序列分析

[目的]克隆自然生长于黑龙江省盐碱地的羊草ClassⅡ几丁质酶基因并进行序列分析,为进一步研究几丁质酶基因的生物功能和应用奠定了基础。[方法]构建羊草叶片的cDNA文库,对其进行DNA序列测定和分析,并与GenBank中收录的植物几丁质酶基因序列及编码的氨基酸序列进行同源性比较。[结果]在羊草叶片eDNA文库中克隆出1条全长eDNA片段,片段长996bp,其中,可读框768bp,编码255个氨基酸。编码产物在结构上缺乏CBD和C-端延伸区,具有ClassⅡ几丁质酶的结构特征,其氨基酸序列与黑麦和小麦ClassⅡ几丁质酶具有很高的同源性;构建的pQE—LcChi2重组载体经诱导后表达出一个约27KD的蛋白,与推测的pQE-LcChi2基因编码产物大小一致。[结论]LcHi2基因在大肠杆菌中能够表达,是一个具有表达功能的基因。     

羊草ClassⅡ几丁质酶基因的克隆及序列分析

1材料与方法 1．1植物材料采摘自然生长于黑龙江省安达市（119°28’E,44°1’N）盐碱地的羊草叶片,-70℃冰箱保存。1．2总RNA的分离与eDNA文库的构建用液氮研磨叶片后,用TRIZOL Reagent（GIBCO BRL）提取总RNA,使用PolyATtract mRNA Isolation Systems（Promega）提取mRNA。然后采用Stratagene提供的cDNA合成体系合成cDNA,体外包装和扩增,构建羊草叶片的cDNA文库。     

二斑叶螨几丁质酶基因的原核表达及多克隆抗体制备

以制备的二斑叶螨c DNA为模板,克隆二斑叶螨几丁质酶Se Chi基因功能结构域催化区片段,大小为786 bp。将该序列片段克隆到表达载体p ET-32a(+)中,获得多克隆原核表达载体p ET-32a-Tu Chi。重组质粒经酶切测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.6 mmol·L-1IPTG诱导4 h后高效表达约45 ku可溶性重组蛋白;经His亲和层析洗脱和浓缩获得高纯度的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备Tu Chi多克隆抗体。制备的多克隆抗体经Western Blot证实能特异性地识别几丁质酶而不与非特异性蛋白结合。ELISA分析表明制备的抗体效价达1??80 000,效价较高,为进一步研究二斑叶螨几丁质酶相关功能奠定基础。     

玉木耳漆酶基因Aclac的克隆及原核表达

【目的】对玉木耳漆酶基因Aclac进行克隆及原核表达分析,为深入研究漆酶基因在玉木耳子实体发育中的生物学功能提供理论依据。【方法】克隆Aclac基因的cDNA和DNA全长序列,对其进行生物信息学分析,并将目的基因连接至pET-28a质粒上以构建原核表达载体pET28a-Aclac,将其转化大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。【结果】克隆获得的Aclac基因cDNA序列长度为1734 bp,编码577个氨基酸残基;Aclac基因DNA序列长度为2521 bp,含14个内含子。AcLAC蛋白理论分子量为64.75 kD,理论等电点为5.70,不稳定指数为34.01,无跨膜区域,存在1个信号肽,在4个铜离子结合区高度保守,且含有Cupredoxin超家族蛋白保守功能域。AcLAC蛋白与真菌的漆酶蛋白聚为一支,其中,AcLAC蛋白与木耳属真菌的漆酶蛋白亲缘关系最近。AcLAC融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）表达宿主中成功表达,分子量为67 kD。【结论】克隆获得的Aclac基因属于Cupredoxin超家族基因,可在原核表达系统中异源表达,推测其与其他真菌漆酶基因在生物学功能上具有一致性,丰富了真菌漆酶资源。     

菜豆几丁质酶、烟草葡聚糖酶基因的分离克隆及双价表达载体的构建

几丁质酶基因(Chitinase,Chi)和葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase,Glu)具有协同抗真菌作用,根据GenBank号M13968,X53600分别设计引物,经RT-PCR扩增,克隆菜豆Chi基因和烟草Glu基因,将两个目的基因分别连上CaMV35S启动子和终止子Nos,然后串联在一起共同组建于一个表达载体pBI121中,重组表达质粒经过限制性酶切分析鉴定,结果表明含有双价抗真菌基因的植物重组表达载体已构建成功。为非洲菊、香石竹等花卉抗真菌基因工程育种奠定了基础。     

羊草CDPK1基因的克隆及序列分析

羊草是一种优质的天然牧草,对于盐碱胁迫有着很强的耐受性。本研究通过羊草(Leymus chinensis)EST(Expressed Sequence Tags, ESTs)序列和RACE(Rapid-amplification of cDNA Ends, RACE)技术,获得了LcCDPK1基因序列,通过生物信息学分析,得到LcCDPK1的全长基因,含1 599 bp的开放读码框(Open Reading Frame, ORF),编码含有532个氨基酸的不稳定弱酸性亲水蛋白质,同时对得到的LcCDPK1基因进行了进化分析。本研究有助于了解LcCDPK基因家族的功能,为进一步应用LcCDPK基因进行植物的耐盐碱性遗传改良奠定了基础。     

菊花几丁质酶基因ChCHI的克隆及表达分析

根据GenBank发布的几丁质酶基因的保守序列设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,克隆到菊花1个几丁质酶基因ChCHI(GenBank登录号为KX881373)。ChCHI基因cDNA全长为1 385 bp,包含960 bp开放阅读框,编码319个氨基酸。ChCHI属于亲水性蛋白,相对分子质量约为35.5 k D,等电点为6.38,为稳定蛋白,二级结构预测表明该蛋白以α螺旋和无规则卷曲为主。蛋白序列比对和进化树分析表明,ChCHI基因编码的蛋白属于糖苷水解酶19家族几丁质酶,与薇甘菊(ACO25187.1)几丁质酶蛋白的亲缘关系最近,序列一致性为87%。qRT-PCR分析结果显示,SA处理可以明显提高贡菊叶片中ChCHI的表达量。菊花ChCHI在对抗环境胁迫的分子调控中起重要作用。     

朱砂叶螨几丁质酶TecCht1基因的原核表达与纯化

【目的】朱砂叶螨是世界范围广泛分布的重要经济害螨,害螨防治十分困难。而几丁质酶是昆虫体内几丁质代谢中分解几丁质的关键酶,在更替新旧表皮和降解围食膜中起着重要的作用,几丁质酶是潜在的螨害生物防治靶标。本研究对朱砂叶螨几丁质酶TecCht1进行原核表达和纯化。【方法】克隆朱砂叶螨TecCht1基因的催化结构域,连接到pColdⅡ载体上,构建pColdⅡ/TecCht1重组表达载体,在大肠杆菌中进行高效表达,采用镍柱纯化目的蛋白,并进行Western Blot检测。【结果】TecCht1在pColdⅡ载体上成功高水平表达,确定最佳诱导表达时间为24h。对TecCht1进行大量表达和纯化,经Western Blot验证,获得纯度较高的目的蛋白。【结论】实现TecCht1体外高效原核表达,获得大量的TecCht1重组蛋白。     

锯角豆芫菁法尼基焦磷酸合酶的cDNA克隆、序列分析及原核表达

【目的】法尼基焦磷酸合酶（farnesyl pyrophosphate synthase,FPPS）是单萜和倍半萜生物合成途径分支点的关键酶,获得芫菁法尼基焦磷酸合酶基因（FPPS）是探究其与斑蝥素生物合成途径关系的基础。论文旨在克隆锯角豆芫菁（Epicauta gorhami Marseul）FPPS,预测该基因及其编码蛋白的结构、性质与功能,并实现其编码蛋白的原核表达。【方法】首先根据已知昆虫FPPS编码蛋白的保守区序列,利用CODEHOP软件设计简并引物,利用RT-PCR获得锯角豆芫菁的cDNA模板,巢式PCR扩增锯角豆芫菁FPPS保守区;随后根据所得的保守区片段设计特异性引物,运用RACE技术分别克隆锯角豆芫菁FPPS 3′和5′端序列;然后根据预测的FPPS开放阅读框（ORF）设计ORF区特异性引物,巢式PCR扩增编码区序列;最后用DNAMAN拼接获得锯角豆芫菁的全长cDNA序列。运用DNAMAN、MEGA 5.05、ProtParam及TargetP 1.1 Server等多种生物信息学软件对该基因全长cDNA序列、Fps系统进化关系及其基本理化性质、FPPS蛋白的亚细胞定位等进行分析;将锯角豆芫菁FPPS与pET28a（+）连接,构建原核表达载体pET28a（+）-EgFPPS并将其转入大肠杆菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中,IPTG诱导融合蛋白的原核表达。分别收集不同诱导时间段的菌液,SDS-PAGE检测融合蛋白的表达情况。将高效表达时段收集的菌液超声波破碎后,分离上清及沉淀并进行煮沸处理,SDS-PAGE检测融合蛋白的可溶性;Western Blot印迹杂交验证目的蛋白的表达。【结果】获得锯角豆芫菁法尼基焦磷酸合酶基因FPPS全长cDNA序列,命名为EgFPPS （GenBank登录号KC840040）,序列分析结果表明,该基因全长1 857 bp,其中5′非编码区146 bp,3′非编码区436 bp,开放阅读框1 275 bp,共编码424个氨基酸,其编码的蛋白分子质量约为49.2 kD,理论等电点pI为8.89,预测分子式为C2192H3457N605O632S25,不稳定系数为38.62,总平均亲水系数为-0.429,为疏水的稳定蛋白。序列分析发现,锯角豆芫菁与其他6种昆虫FPPS在氨基酸水平上具有72.56%的同源性,且其近N端具有R**S四肽基序,此外还包含7个异戊烯基转移酶保守区和两个典型的DD**D的天冬氨酸富含区。系统发育树显示锯角豆芫菁与鞘翅目拟步甲科昆虫赤拟谷盗进化关系最近。EgFPPS的亚细胞定位进行预测发现其N端具有一段明显的线粒体靶向肽。原核表达结果表明,该蛋白在终浓度为1 mmol•L-1的IPTG诱导4 h即能实现融合蛋白的高效表达;融合蛋白的可溶性检测表明该蛋白主要以包涵体的形式存在;Western Blot印迹检测也证实大肠杆菌DE3中表达了一个分子量约为49 kD的蛋白质,与预测分子量大小基本一致。【结论】成功从芫菁科昆虫克隆得到FPPS,并成功实现了其编码蛋白的原核表达,为后期探索其在芫菁科昆虫体内斑蝥素生物合成途径中的功能提供理论基础。     

烟草Ⅰ型几丁质酶的生物信息学分析

旨在对烟草Ⅰ型几丁质酶进行生物信息学分析,了解其生物学特征,为下一步研究烟草Ⅰ型几丁质酶在烟草抗病过程中的作用奠定基础。采用生物信息学的方法,对已在 NCBI上登陆的烟草、拟南芥、水稻、菜豆的Ⅰ型几丁质酶（chitinase,ChiⅠ）氨基酸序列特征和进化关系进行了预测和分析。结果表明,这4种植物Ⅰ型几丁质酶的分子量大小在28~37 kDa之间,均具有信号肽,结构域高度保守,均具有几丁质结合区（ Cht BD1）和催化功能区（Glyco_hydro_19）;烟草中的3种Ⅰ型几丁质酶序列相似性较高,可以聚为一类;烟草与拟南芥和菜豆中的一种 ChiⅠ遗传距离较近,而与水稻中 ChiⅠ的遗传距离较远。通过分析发现,烟草Ⅰ型几丁质酶有着与其他植物中该酶相同的特性,为进一步研究烟草抗病蛋白提供理论依据。     

苦瓜几丁质酶基因的克隆、表达及酶学特性分析

采用一步法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),以苦瓜幼叶为材料克隆几丁质酶基因的cDNA序列,序列分析表明其包含了基因完整的编码序列,编码由333个氨基酸组成的几丁质酶,对所克隆的基因进行了原核表达和纯化.纯化的几丁质酶具有分解几丁质的生物活性.当底物质量浓度在100～400 mg·L-1时,几丁质酶分解底物的能力随底物浓度增加而增大;大于400 mg·L-1时,几丁质酶分解底物的能力反而降低;当底物质量浓度固定时,几丁质酶分解底物的量随反应时间延长而增多.苦瓜几丁质酶基因的克隆和表达将为研究其结构和生物学功能奠定基础.     

花生NBS-LRR类抗病基因的克隆及原核表达

根据已知抗病基因的NBS保守区域设计引物,利用PCR技术从花生基因组DNA中克隆得到一个NBS-LRR类抗病基因,序列长539 bp,命名为PnAG3。蛋白质序列同源性分析表明多个植物抗病相关蛋白与之有一定的同源性,其中同源性最高的是花生C8_V_253抗性蛋白序列（97%）。将PnAG3基因编码区构建原核表达载体,表达产物分布于包涵体中,大小为47.26 KDa,1 mmol/L IPTG诱导4 h可获得最大表达量。为花生抗黄曲霉品种选育奠定了基础。     

羊草 CDPK 基因全长 cDNA 的克隆及原核表达

【目的】通过对羊草 Leymus chinensis CDPK 基因进行克隆及原核表达,为进一步研究CDPK基因的功能,探讨羊草适应生境分子机制提供理论基础.【方法】用RT-PCR结合RACE技术克隆了羊草钙依赖蛋白激酶（CDPK）基因,命名为Lc-CDPK;构建了羊草CDPK基因的原核表达载体,转化到大肠埃希菌Escherichia coli BL21(DE3),异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,经SDS-PAGE分析CDPK蛋白的表达情况.【结果和结论】羊草CDPK基因全长cDNA序列为1 704 bp,包括1个1 647 bp的开放阅读框,编码548个氨基酸,从第81~339个氨基酸构成了具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化活性的S-TKc结构域,有4个保守的EF手型结构域;编码区核苷酸序列与其他禾本科作物比对后发现,与小麦CDPK基因的相似性最高,相似度为96%;IPTG诱导表达出相对分子质量为61 350的融合蛋白,表达产物大小与预计理论值相符.诱导7 h蛋白表达量最高,表达量占菌体总蛋白的49.1%.     

少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶基因的克隆及生物信息学分析

为研究捕食线虫性真菌几丁质酶的功能,在国内首次对少孢节丛孢菌XJ-A1几丁质酶AO-801和AO-483基因进行扩增、克隆及测序,并对其编码蛋白信号肽、疏水性与亲水性、高级结构、功能域进行预测和分析。结果显示,2个不同蛋白均具有典型的几丁质酶催化区保守序列SXGGW和DGXDXDWE,属于糖苷水解酶18家族几丁质酶,无信号肽序列,表明这2个蛋白为非分泌型蛋白,二级结构以无规则卷曲、α-螺旋和β-折叠为蛋白的主要结构元件,三级结构中有(α/β)8的圆桶形结构。系统发育分析表明,几丁质酶AO-801和AO-483与昆虫病原真菌几丁质酶的亲缘关系更为接近,说明它们所产生的几丁质酶在侵染宿主的过程中发挥着类似的功能,并且不同来源真菌几丁质酶根据分子质量的差异形成3个不同的进化分枝。     

小地老虎几丁质脱乙酰基酶基因的克隆与原核表达

几丁质脱乙酰基酶(Chitin deacetylase,CDA)可以将几丁质修饰为壳聚糖,在昆虫几丁质代谢中具有重要作用。研究以小地老虎(Agrotis ipsilonHufngel)5龄幼虫虫体为材料提取总RNA,利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到小地老虎几丁质脱乙酰基酶基因的cDNA序列。该序列含有2 048个碱基,包括一个1 626个碱基的开放读码框,编码541个氨基酸,分子质量约为61.7 ku,多肽的等电点为5.03。推导得到的氨基酸序列与其他昆虫,尤其是鳞翅目昆虫的几丁质脱乙酰基酶高度同源。所获小地老虎CDA基因的cDNA序列已登录GenBank并获得登录号,登录号为JQ012932。将CDA基因连接到PET21b载体上转入到BL21中诱导表达,SDS-PAGE电泳得到目的蛋白条带。     

普通小麦中国春Chi基因的克隆、染色体定位及原核表达

利用ChiF/ChiR引物组合在普通小麦品种中国春中扩增几丁质酶基因,并对其序列进行分析,然后利用中国春缺四体材料对不同的几丁质酶基因进行染色体定位,并对定位成功的亚基进行原核表达以及诱导纯化,最后通过进化树分析小麦几丁质酶与其他物种几丁质酶之间的进化关系。结果表明,从中国春中分离出的30个几丁质酶基因可以划分为出6类,分别命名为Chi-1、Chi-2、Chi-3、Chi-4、Chi-5和Chi-6,登录号分别为KJ507385、KJ507386、KJ507387、KJ507388、KJ507389和KJ507390,它们都属于ClassⅠ几丁质酶。Chi-1、Chi-2、Chi-3、Chi-4和Chi-6分别定位在小麦的3A、2B、5B、1A和3D染色体,Chi-5定位失败。Chi-1、Chi-2、Chi-3、Chi-4和Chi-6的原核表达和纯化体系成功建立,最后发现小麦ClassⅠ型几丁质酶与水稻和大麦的ClassⅠ型几丁质酶进化关系更近,而与拟南芥的关系最远。总体来看,通过对小麦几丁质酶的克隆、序列分析、染色体定位、原核表达体系的建立以及进化分析,可知,小麦几丁质酶包括很多种不同的亚型,而且它们分布在不同的染色体上,同时它们与水稻和大麦的进化关系最近。     

苏云金芽孢杆菌kurstaki亚种几丁质内切酶基因的生物信息学分析

以苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种（Bacillus thuringiensis subsp kurstaki）基因组DNA为模板,利用1对特异性引物通过Touchdown PCR方法扩增了长为2576bp的几丁质酶kchi基因序列（GenBank登录号：AY189740）。生物信息学分析发现：该序列包含1个完整的开放阅读框,编码688个氨基酸,推测是分子量约为75820。等电点pI=5．89的几丁质酶前体。序列和结构比较分析结果表明：Kchi属于几丁质内切酶,包括几丁质酶催化区、粘蛋白Ⅲ型同源区和几丁质结合区3个结构域,在N端还有1个分泌信号肽。除与胁巴基斯坦亚种几丁质酶同源性较低（相似性为61．3％）外,与Bt其他亚种的同源性都较高（≥92．0％）。     

月季新型PKSⅢ基因的生物信息学分析及原核表达

【目的】对月季Ⅲ型聚酮合酶基因（RcPKSⅢ）进行生物信息学和原核表达分析,为进一步探究该基因的催化功能奠定基础。【方法】以‘月月粉’花瓣为研究材料,从其基因组中筛选月季PKS基因（RcPKSs）家族成员,并对其进行生物信息学分析;利用MEGA软件对RcPKSs与其他植物PKS氨基酸序列进行系统发育分析;利用DNAMAN软件对RcPKSs和紫花苜蓿查尔酮合酶2（CHS2）基因进行序列比对分析;对RcPKSs和紫花苜蓿CHS2活性位点上的氨基酸残基进行比较,分析其催化特征;利用SWISS-MODEL对RcPKSs进行同源建模,并与紫花苜蓿CHS2蛋白三维结构进行比较。利用实时荧光定量PCR方法,分析RcPKSs和间苯三酚甲基化酶编码基因在‘月月粉’花蕾期、半开期和盛开期的表达模式;克隆RcPKSs基因全长,构建其原核表达载体pET-32a-RcPKSs,进行诱导表达,并对重组蛋白进行纯化。【结果】从‘月月粉’基因组中共鉴定出6个RcPKSs,生物信息学分析表明,RcPKS1、RcPKS2和RcPKS3为CHS基因,RcPKS4、RcPKS5和RcPKS6为新型PKSⅢ基因。系统发育分析表明,RcPKS1、RcPKS2和RcPKS3编码CHS蛋白,RcPKS4、RcPKS5和RcPKS6编码新型的非CHS蛋白。序列比对分析表明,RcPKS1、RcPKS2和RcPKS3蛋白与紫花苜蓿CHS2相似度均为72.16%,RcPKS4、RcPKS5和RcPKS6与紫花苜蓿CHS2相似度分别为67.52%,33.85%和32.73%。活性位点上氨基酸残基比较发现,RcPKS1、RcPKS2和RcPKS3活性位点上氨基酸残基均保守,RcPKS4氨基酸残基在起始口袋和延伸口袋处发生替换,RcPKS5和RcPKS6氨基酸残基均在延伸口袋处发生替换。对RcPKSs蛋白质结构的分析结果显示,RcPKS4、RcPKS5和RcPKS6蛋白质采用了几乎相同的αβαβα三维整体折叠形式。实时荧光定量分析表明,RcPKS4、RcPKS5和RcPKS6表达量在‘月月粉’花朵盛开期最高,间苯三酚O-甲基转移酶基因（POMT）、苔黑酚O-甲基转移酶基因1（OOMT1）和OOMT2表达量在盛开期最低。聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）结果表明,重组蛋白诱导并且纯化成功。【结论】鉴定了‘月月粉’新型RcPKSⅢ基因,该基因可能参与花发育调控过程。克隆了RcPKSs基因,并诱导表达获得了RcPKSs重组蛋白。     

苏云金芽孢杆菌几丁质酶基因的克隆及诱导表达

从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)T04A001中提取基因组DNA,通过PCR的方法克隆了几丁质酶chiAC基因(GenBank登录号为EF427670).置换chiAC基因的启动子为T7启动子时,chiAC基因能在IPTG诱导下在大肠杆菌中大量表达,并产生大小约70 kDa的表达产物.     

板栗过氧化氢酶基因CmCAT的克隆与原核表达

【目的】旨在克隆板栗CmCAT基因全长cDNA序列,分析其编码蛋白相关信息并进行原核表达研究。【方法】采用RT-PCR技术从板栗品种"石丰"中克隆获得CmCAT基因,用生物信息学方法对获得的cDNA序列及推定的氨基酸序列进行分析。构建原核表达载体pET28a-CmCAT,经PCR和酶切鉴定后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。【结果】板栗CmCAT基因开放阅读框(ORF)为1 479 bp,共编码492个氨基酸,推测蛋白分子质量为56.883 kDa,理论等电点pI为5.83,GenBank登录号为KY312851。其核苷酸序列与核桃(Juglans regia)CAT基因序列相似性最高,为85%。遗传进化分析表明,板栗CmCAT与核桃的亲缘关系最近。SDS-PAGE电泳分析表明,在30℃条件下,0.2 mmol/L IPTG诱导6 h表达量最佳,诱导的目的蛋白分子量约为60 kDa,其主要以包涵体的形式存在。【结论】成功克隆了板栗CmCAT基因,并对其编码蛋白的理化性质进行了预测分析,在大肠杆菌中获得了大量的表达,为其进一步的生物学功能研究奠定了基础。