水稻多逆境响应基因OsMsr13的克隆与功能分析

为了深入研究作物耐逆境胁迫的分子机制和发现新的水稻耐逆基因,采用Affymetrix基因芯片技术与水稻表达芯片(含51,279个转录本),分析了培矮64S不同生长发育时期、不同组织器官全基因组在低温、干旱、高温逆境胁迫下的表达水平变化,筛选出一批耐多逆境候选功能基因.OsMsr13是其中一个受低温、高温与干旱诱导,在各生长发育时期与组织器官均显著上调的基因.根据序列生物信息学分析,OsMsr13含有7个外显子和6个内含子,cDNA全长序列为1603bp,完整的ORF为1317bp,编码一个含438个氨基酸残基的蛋白质;在OsMsr13启动子区域发现多个与逆境应答相关的顺武作用元件;数据库查找和蛋白质多序列的比对表明Os Msr13的预测蛋白属于钙调素结合蛋白家族.为了进一步研究OsMsr13基因的功能,通过RT-PCR方法扩增到包含OsMsr13完整ORF的cDNA克隆,构建了含有OsMsr13重组基因的过量表达载体pCAM-JIT-OsMsr13,并经农杆菌介导法将重组基因导入到水稻中.转OsMsr13株系苗期的抗逆性试验表明OsMsr13过量表达能显著地提高水稻的耐寒性,但在抗旱和耐高温方面,转基因植株和野生型9311没有观察到多大差别.     

水稻多逆境响应新基因OsMsr9的表达与克隆

为发掘水稻新的耐逆基因,研究植物在应答逆境胁迫时的分子机制,我们采用Affymetrix水稻表达芯片分析了超级稻两优培九母本培矮64S全基因组在多种逆境胁迫下的表达水平,筛选出一批表达水平显著改变的基因。其中基因OsMsr9(Oryza sativa L.Multiple Stresses Responsive Gene9,GenBank登录号为EU276058)的表达量在高温、低温、干旱处理后在多个组织器官、发育时期均有显著提高。实时定量PCR分析其特定时空表达量的结果与基因芯片的结果基本吻合。通过RT-PCR法,得到包含OsMsr9完整ORF(open reading frame)的cDNA克隆。根据生物信息学分析,该ORF编码一个包含168个氨基酸残基的蛋白质,与玉米(Zea mays)中含F-box结构域的全长蛋白有大约58%的相似性,而F-box蛋白可能与植物抗逆性有关。基于上述实验及分析结果,OsMsr9可能是一新的水稻耐逆功能基因。     

水稻 OsbHLH109 基因的表达分析

【目的】bHLH 转录因子家族是真核生物中重要的转录因子家族,在植物生长发育、次生代谢和逆境应答中发挥重要作用。分析水稻（Oryza sativa L.）bHLH 转录因子基因 OsbHLH109（LOC_Os01g67480）对逆境胁迫和激素的响应模式,为进一步研究 OsbHLH109 在逆境胁迫和激素响应过程中的功能提供理论依据。【方法】对 OsbHLH109 进行生物信息学分析,同时利用定量 PCR（qRT-PCR）技术分析 OsbHLH109 在水稻品种中花 11 不同组织、不同激素和非生物胁迫处理下的表达模式。【结果】OsbHLH109 编码区全长为 1 164 bp,包含 6 个外显子,编码 388 个氨基酸,是一个含有 HLH 保守结构域的 bHLH 转录因子。系统进化分析显示,OsbHLH109 与玉米等单子叶植物中的同源蛋白亲缘关系较近,与双子叶植物中的同源蛋白亲缘关系相对较远。顺式作用元件分析表明,OsbHLH109 的启动子区含有 24 个植物激素响应元件和 25 个环境胁迫响应元件。qRT-PCR 分析表明,OsbHLH109 在水稻根、茎、叶和幼穗等组织中均有表达,但在叶片中的表达量最高;激素和非生物胁迫处理结果表明,叶片中 OsbHLH109 对细胞分裂素（6-Benzylaminopurine, 6-BA）、生长素（Indole acetic acid, IAA）、赤霉素（Gibberellic acid, GA3）、脱落酸（Abscisic acid, ABA）等激素处理的响应表达均达到显著差异水平;且叶片中 OsbHLH109 在低温、干旱、高温、盐胁迫等逆境处理的响应表达均达到显著差异水平,表明 OsbHLH109 的表达受 6-BA、IAA、GA3、ABA、高温、低温、PEG6000 和 NaCl 的诱导,推测其在水稻非生物胁迫响应过程中具有重要作用。【结论】水稻 OsbHLH109 为 bHLH 转录因子家族成员,主要在叶片中高表达,OsbHLH109 基因的表达受高温、低温、盐害等外界因素调控,同时响应 6-BA、IAA、GA3、ABA 等激素信号,推测其可能通过 ABA 等激素信号转导途径参与水稻的非生物胁迫响应。     

水稻OsRZFP34基因逆境表达特征及其启动子的克隆与分析

采用qRT–PCR技术分析水稻OsRZFP34在高温(42 ℃)、低温(4 ℃)、10%聚乙二醇(PEG)6000模拟干旱、高盐(100 mmol/L NaCl)和脱落酸(ABA)处理(100 μmol/L)下的表达模式;克隆OsRZFP34基因启动子,并利用在线软件New PLACE和PlantCARE对其序列进行顺式作用元件分析;构建OsRZFP34pro::GUS表达载体并转化水稻;通过组织化学染色和GUS酶活性检测,分析在不同胁迫处理条件下OsRZFP34启动子驱动GUS基因表达的活性。qRT–PCR分析结果表明,上述5种处理均能不同程度地诱导OsRZFP34的表达,其中高温胁迫对其表达的诱导程度最强,而ABA对其表达只有微弱的诱导。顺式作用元件分析结果表明,该启动子上包含有多个与逆境响应、激素响应以及Ca2+信号转导相关元件。GUS组织化学染色和荧光分析结果显示,OsRZFP34基因启动子的活性受到高温、低温、PEG、盐和ABA的调控,表明该启动子是受多种逆境诱导的诱导型启动子。     

水稻OsSsr1基因的生物信息学分析、亚细胞定位及其表达模式

为了探明盐敏感相关基因[OsSsr1（Oryza sativa L.salt-sensitive related gene 1,GenBank登录号为NM₀01065574）]的亚细胞定位及在水稻不同组织和各种逆境胁迫下的表达模式,通过生物信息学手段、洋葱表皮亚细胞定位、RiceXPro数据库和Real-time PCR对其进行研究。序列分析表明OsSsr1的开放阅读框为2 004 bp,编码一个由667个氨基酸组成并含有5个跨膜区的蛋白质,该蛋白质N端含有一个信号肽;其启动子序列包含TGACG-motif、ABRE、TCA-element和W box等多个与逆境相关的顺式作用元件。GFP融合表达显示,OsSSR1蛋白质定位于细胞膜。RiceXPro数据库中数据分析表明,OsSsr1基因在水稻不同发育期的不同组织中均有表达,在叶中的表达量最高,胚中的表达量最低。Real-time PCR结果表明,OsSsr1表达水平受干旱、高温、高盐、低温、机械伤害、稻瘟病菌、MeJA和ABA的诱导上调。这些结果显示,OsSsr1基因可能在水稻胁迫反应中发挥重要作用。     

一个水稻抗逆候选基因OsHMGB3的鉴定与评价

OsHMGB3是一个位于水稻抗旱QTL区段内的抗旱相关候选基因,预测编码一个具有HMGB-UBF-HMG-box结构域的蛋白。Real-time PCR分析表明:OsHMGB3基因在多个组织器官中表达,且能够受到PEG、NaCl、低温、高温等逆境及ABA的诱导表达。对超表达OsHMGB3的转基因水稻进行了苗期甘露醇胁迫处理,转基因植株的鲜重和株高均极显著优于野生型植株,超表达OsHMGB3可提高水稻苗期抵抗渗透胁迫的能力。该基因对逆境的响应及转基因植株对渗透胁迫的抗性均暗示该基因与水稻抗逆性有密切的关系。     

水曲柳TCP4转录因子克隆及胁迫和激素下的表达分析

TCP转录因子家族是植物特异的一类调控生长发育和逆境胁迫的重要转录因子。本文揭示了水曲柳FmTCP4在非生物胁迫及激素信号诱导调控的表达特征,为该基因在水曲柳中调控生长发育以及逆境胁迫响应功能的研究奠定基础。通过前期研究克隆获得了水曲柳TCP4基因序列,并命名为FmTCP4,应用生物信息学软件对水曲柳FmTCP4基因的分子结构特征进行了分析,利用4 ℃低温、盐(NaCl)以及干旱(PEG6000)进行非生物胁迫处理,利用脱落酸(ABA)和赤霉素(GA₃)进行激素信号诱导,分析FmTCP4基因的表达特征。生物信息学分析表明该基因全长1 251 bp,具有完整的开放阅读框,编码416个氨基酸。FmTCP4具有螺旋-环-螺旋结构,为亲水性的不稳定蛋白,不存在信号肽,具有跨膜能力,亚细胞定位预测存在于细胞核中,并在细胞质到细胞核的调控中起作用。同源序列比对结果表明,FmTCP4与芝麻、烟草等物种的同源蛋白序列相比具有很高的同源性。非生物胁迫处理后,FmTCP4的表达量随处理时间而改变,但其变化趋势不同,表明FmTCP4明显响应了这3种非生物胁迫。激素信号诱导结果表明,外源植物激素调控了FmTCP4基因的表达,基因表达量相对于对照组具有显著性差异。非生物胁迫和激素信号诱导下的基因表达分析表明,FmTCP4响应了寒冷、盐、干旱等非生物胁迫以及激素信号,说明其参与了植物的生长发育和逆境胁迫的平衡。      

盐芥GRP7基因的克隆和逆境表达分析

【目的】从抗逆植物盐芥中分离GRP7(glycine-rich RNA-binding protein7,GRP7)基因,为进一步揭示GRPs基因在盐芥逆境应答中的作用机制及生物学功能奠定基础。【方法】利用盐芥GRP7基因的EST序列设计特异引物,克隆GRP7基因的全长序列,对其保守结构域和系统进化树进行分析,并对TsGRP7基因的启动子区进行预测;利用qRT-PCR技术,检测GRP7基因在不同逆境胁迫、不同组织中的表达情况。【结果】TsGRP7基因编码区全长522bp,编码173个氨基酸;TsGRP7蛋白的N端第9~82位氨基酸之间有1个RNA识别基序(RRM),RRM中含有保守的RNP-1和RNP-2亚结构域;多重序列比对和系统进化树分析表明,盐芥和拟南芥亲缘关系较近;启动子序列分析表明,盐芥GRP7启动子区含有HSE热激响应元件、LTR低温应答元件等多个逆境相关的顺式作用元件,表明盐芥GRP7基因参与逆境响应。qRT-PCR分析表明,盐芥GRP7基因在不同逆境胁迫条件及不同组织中表达不同。【结论】盐芥GRP7基因参与低温、高盐、PEG等逆境响应。     

水稻黄嘌呤脱氢酶基因OsXDH克隆及表达分析

[目的]克隆水稻黄嘌呤脱氢酶(Xanthine dehydrogenase,XDH)基因(OsXDH),分析其生物信息学特性及表达特性,为研究XDH在水稻生长发育和响应逆境胁迫中的调控机制提供理论依据.[方法]以粳稻品种日本晴为材料,采用同源克隆技术克隆OsXDH基因,应用生物信息学方法对其氨基酸序列进行分析.利用实时荧光定量PCR (qPCR)检测OsXDH基因的组织表达特性及逆境胁迫下的表达情况,并对不同转基因株系乳熟期剑叶OsXDH基因表达量、XDH活性和叶绿素含量进行比较分析.[结果]克隆获得OsXDH基因的开放阅读框序列(ORF)(GenBank登录号LOC4333171),其长度为4110 bp,编码1369个氨基酸.OsXDH蛋白分子量大小为150.23 kD,理论等电点(pI)为6.54,与小麦、高粱、玉米、谷子和油菜等作物XDH蛋白氨基酸序列的相似性分别为84.54%、84.07%、81.52%、76.35%和69.22%,表明XDH蛋白氨基酸序列具有高度保守性.OsXDH基因在水稻不同组织部位均有表达,灌浆期的表达量显著高于苗期和分蘖盛期(P<0.05),且受干旱、黑暗、高温和盐胁迫诱导高效表达.OsXDH过表达水稻转基因株系乳熟期剑叶的XDH活性和叶绿素含量高于野生型,OsXDH干扰转基因株系的XDH活性和叶绿素含量低于野生型.[结论]OsXDH基因受水稻生长发育和逆境胁迫因子诱导表达,推测其是调控水稻生长发育和响应逆境胁迫的关键基因.     

水稻冷激蛋白基因OsCSP2启动子的克隆与分析

为了解水稻冷激蛋白基因OsCSP2的功能,对其启动子序列和表达模式进行了分析。利用PCR技术从水稻耐盐品种汕优10号中克隆该启动子片段,命名为Poscsp2。通过构建Poscsp2驱动的GUS融合表达载体转化水稻,利用组织化学染色及荧光定量PCR方法,分析低温和高盐胁迫下OsCSP2的表达模式。启动子序列分析表明,Poscsp2序列包含大量与低温、高盐等多种逆境胁迫相关的顺式表达元件。组织化学染色和荧光定量PCR结果显示,在低温及高盐胁迫处理后,GUS报告基因和OsCSP2基因表达水平显著升高。说明Poscsp2可以显著提高在高盐及低温条件下下游基因的表达水平。     

生菜低温胁迫转录因子LsICE1的克隆、特征分析及其转化水稻

 【目的】克隆生菜（Lactuca sativa L.）低温胁迫转录因子LsICE1,对其进行序列分析和水稻遗传转化,研究超表达LsICE1基因对水稻耐低温能力的影响。【方法】设计简并引物,利用RT-PCR技术获得生菜LsICE1基因保守区域,再通过SON-PCR技术获得LsICE1基因的5′端和3′端,拼接得到全长的cDNA。对该序列进行生物信息学分析,采用半定量RT-PCR研究LsICE1的低温表达模式。最后构建植物表达载体,利用农杆菌介导法对水稻进行遗传转化。通过比较低温处理后对照和转基因株系的存活率和生理指标,鉴定超表达LsICE1基因对水稻耐低温能力的调控作用。【结果】测序结果显示,拼接后的cDNA片段长1 622 bp,包含一个1 497 bp完整的开放阅读框,编码498个氨基酸残基,命名为LsICE1,GenBank登录号为HQ848932。半定量RT-PCR研究表明,LsICE1基因是冷诱导条件下差异表达的基因。进化树分析表明,LsICE1蛋白与葡萄的ICE1蛋白亲缘关系最近,处于同一进化分枝。PCR和RT-PCR分子检测证明,LsICE1基因已经整合到水稻基因组中。与对照相比,低温处理后超表达LsICE1基因的转基因株系存活率和脯氨酸含量明显增加,相对电导率和丙二醛含量积累速率明显下降。【结论】首次从生菜中克隆了低温胁迫转录因子LsICE1,超表达LsICE1基因水稻株系提高了抗低温胁迫能力。     

水稻低温应答基因OsLCL3的分离与功能鉴定

为探明水稻响应低温的分子机制,改良水稻对低温的抗性,从水稻低温诱导表达谱中挑选了1个受低温诱导的基因OsLCL3,通过实时定量PCR和启动子驱动GUS报告基因转化水稻的方法验证其功能。对OsLCL3进行同源蛋白搜索,发现它属于DUF761超家族,并对这个超家族中的部分蛋白序列进行了系统树分析;通过水稻原生质体瞬时表达系统,初步确定OsLCL3蛋白定位于细胞核和细胞质中。在水稻中超量表达OsLCL3基因,并对转基因植株进行低温胁迫处理,发现超量表达OsLCL3的植株在低温胁迫下的电导率显著低于野生型对照植株,胁迫后超量表达植株的存活率显著高于野生型对照植株。结果表明,OsLCL3可能在水稻对低温的应答中起着重要作用。     

水稻肌醇加氧酶基因的表达分析及植物表达载体的构建

为研究水稻肌醇加氧酶基因在植物水分胁迫分子应答中的作用,采用RT-PCR技术克隆了水稻肌醇加氧酶基因的cDNA编码区,命名为OsMIOX。该基因由927个碱基组成,编码308个氨基酸,与拟南芥肌醇加氧酶的氨基酸序列相比,同源性为78%。将克隆的OsMIOX基因连接pCAMBIA-1301载体,成功构建了35 s启动子驱动的植物超表达载体。实时定量PCR分析结果表明,水分胁迫下OsMIOX基因在旱稻IRAT109中上调表达,在旱稻(IRAT109和毫格劳)中的表达量显著高于水稻(越富和日本晴)。这说明水稻和旱稻的水分胁迫分子反应机制的确存在差异,而这种差异很可能就是水、旱稻抗旱性不同的原因之一。     

辣椒水通道蛋白基因CaAQP的克隆与序列分析

 【目的】分析辣椒水通道蛋白基因CaAQP的序列特征,并研究其在抗寒品种P70中经4℃低温胁迫处理后的表达模式,为探讨辣椒的耐寒机理及辣椒品种耐寒性改良积累资料。【方法】利用RACE 技术进行cDNA全长克隆,采用生物信息学软件分析克隆基因的编码蛋白特性,并以4℃低温胁迫处理不同时间的抗寒品种P70为材料,利用Real time-PCR分析所克隆基因在辣椒低温胁迫前后的表达模式,以25℃处理为对照。【结果】在4℃低温胁迫处理后的耐寒辣椒品种P70叶片中分离到与水通道蛋白基因相关的差异表达片段,并利用RACE技术克隆得到该基因的全长cDNA,命名为CaAQP,登录号为GU116569。序列分析表明,该基因大小为1 032 bp,含5′非编码区为69 bp,3′非编码区为210 bp,CDS长753 bp,编码250个氨基酸, 蛋白分子量为25.7 kD。应用生物信息学软件对CaAQP分析表明,CaAQP含有6个跨膜区,有2个NPA单元,其氨基酸残基与MIP家族蛋白保守区序列完全一致。氨基酸序列比对发现,该序列与其它物种TIP类液泡膜水通道蛋白氨基酸序列有很高的同源性。聚类分析表明,CaAQP与番茄液泡膜水通道蛋白遗传距离最近,与禾本科的玉米和大麦遗传距离相对较远。Real time-PCR分析结果证实,该基因在低温胁迫下呈现下调表达的趋势。【结论】利用cDNA-AFLP并结合RACE技术首次在耐寒辣椒品种中克隆了水通道蛋白基因CaAQP,该基因属于MIP蛋白家族的一员,具有其典型的功能域,表达模式分析表明,该基因在低温胁迫过程中具有重要的调控作用,该研究结果为进一步探讨辣椒逆境胁迫过程中基因表达调控机制提供了重要信息。     

青蒿B-BOX型锌指蛋白基因AaBBX22的克隆及表达分析

在外界环境刺激下BBOX型锌指蛋白基因往往可以诱导植物相关基因的应答反应抵抗逆境胁迫。为了研究青蒿中AaBBX22基因在逆境胁迫中的表达特点,我们从青蒿的cDNA文库中克隆得到了AaBBX22基因。该基因全长为1114bp,包含1个813bp的开放阅读框。生物信息学分析表明该基因具有2个典型的＆BOX型锌离子结合位点。进化树分析显示AaBBX22与葡萄和大豆的B-BOX型基N具有较近的亲缘关系。实时荧光定量PCR结果表明,在正常生长条件下,该基因在青蒿的各个组织部位中都有表达,其在根中的表达量最高,在花蕾中的表达量最低。盐和干旱处理都能显著诱导该基因的表达,脱落酸（ABA）、甲基茉莉酸（MJ）和低温处理显著抑制了该基N的表达,伤害处理在一定程度上抑制了该基因的表达。推测AaBBX22基因可能参与青蒿的耐盐和耐旱调控。     

小麦脱水素基因TaDHN-1的特征及其对非生物胁迫响应

【目的】分析小麦脱水素基因特征及其在干旱、高盐、低温和高温胁迫过程中的表达模式,探讨脱水素在小麦抗逆过程中的功能,为脱水素基因在小麦抗逆分子育种中的应用提供理论依据。【方法】利用RT-PCR克隆小麦脱水素基因,通过生物信息学分析研究其编码蛋白特征;采用qRT-PCR分析该基因表达特性模式。【结果】克隆了包含完整编码区的小麦脱水素基因TaDHN-1,序列分析显示该基因cDNA长487 bp,编码112个氨基酸,推测编码蛋白分子量约为11.5 kD,等电点为6.6。氨基酸序列分析表明,TaDHN-1在C端具有保守的K片段,属于Kn类脱水素;二级结构预测显示,该脱水素无规则卷曲占整个蛋白的82.1%,具有很高的亲水性;PredictProtein预测显示,该脱水素无跨膜区域,亚细胞定位于细胞质中。表达特性分析表明,TaDHN-1受植物激素ABA的诱导;在干旱、高盐和低温胁迫条件下,该基因均受胁迫的诱导而表达上调,但对42℃高温胁迫不敏感;在种子发育过程中,TaDHN-1的表达呈下调趋势,且在种子发育后期的表达量极低,推测TaDHN-1不参与小麦种子成熟后期的脱水保护过程。【结论】小麦脱水素基因TaDHN-1属于脱水素基因家族的Kn亚类。该基因通过依赖ABA的非生物胁迫响应路径发挥功能,可能参与了小麦对干旱、高盐和低温胁迫的耐受调节过程,但对高温胁迫不敏感,也未参与种子发育后期的脱水保护过程。     

黄鳝抗菌肽hepcidin基因大肠杆菌表达载体的构建

[目的]构建黄鳝抗菌肽hepcidin基因大肠杆菌表达载体。[方法]根据Genbank中黄鳝hepcidin基因序列设计引物进行PCR扩增,将测序正确的基因片段连接入载体pET-28a中。[结果]以黄鳝cDNA为模板,扩增出hepcidin基因片段,长度为291 bp,连接到pET-28a上。经PCR扩增、双酶切验证,证实成功构建原核表达载体。[结论]成功构建了黄鳝hepcidin基因大肠杆菌表达载体。     

Cloning and Characterization of a Putative CTR1 Gene from Wheat

CTR1 is a key negative regulator in ethylene signal transduction. A salt-induced CTR1 like gene （TaCTR1） was cloned from wheat, its expression under abiotic stresses, subcellular localization and the effect of overexpression of TaCTR1 on salt tolerance in tobacco was studied. A putative CTR1 gene was cloned and characterized from wheat via rapid amplification of cDNA ends （RACE） and RT-PCR. TaCTR1 expression under stresses was analyzed using semi-quantitative RT-PCR and the effect of overexpression of TaCTR1 on salt tolerance was conducted in tobacco. The full-length cDNA of TaCTR1 is 2 635 bp which codes for a polypeptide of 759 amino acids. There is a conserved serine/threonine protein kinase domain at the carboxyl terminus containing an ATP-binding site. Southern blot analysis revealed that TaCTR1 consisted of a gene family in wheat. The amino acid homologies of CTR1 among different organisms share higher similarities. Expression analysis revealed that TaCTR1 was induced by NaC1 and drought stress but inhibited by ABA treatment. Transient expression of TaCTR1-GFP in the onion epidermal cells indicated that TaCTR1 was probably targeted to the plasma membrane. Overexpression of TaCTR1 decreased salt tolerance in transgenic tobacco （Nicotiana tabacum L.） plants compared with the control. To our knowledge, TaCTR1 is the first CTR1 gene cloned in wheat and may be involved in various abiotic stresses. Overexpression of TaCTR1 decreased the salt tolerance in tobacco suggested that TaCTR1 may act as a negative regulator of salt stress in plants.