基于WGCNA技术研究驴肉嫩度基因及代谢物调控网络

旨在通过WGCNA技术解析转录组和代谢组数据,探究驴肉嫩度调控机制。试验动物采用24～36月龄的健康雌性广灵驴(平均体重236.10 kg),将驴肉剪切力和肌内脂肪含量作为表型数据,以每个样品3个重复进行表型数据测定。本试验基于前期研究的具有显著剪切力和肌内脂肪含量差异的14个广灵驴背最长肌样本的转录组和代谢组测序数据,运用WGCNA技术筛选与驴肉嫩度相关的基因及代谢物并进行转录组与代谢组联合分析,解析嫩度相关基因与代谢物。结果表明,利用WGCNA技术通过|r|≥0.5以及P≤0.05筛选标准得到3个与嫩度相关的关键基因模块Greenyellow、Darkgrey、Darkgreen以及2个关键代谢物模块Brown、Yellow。对关键基因模块进行GO富集分析发现,模块内基因主要在甘油磷脂的生物合成、脂质氧化、脂肪酸β-氧化、细胞大分子分解代谢过程、肌肉器官发育、钙离子结合等GO功能上富集。存在于关键模块内的基因及代谢物经KEGG功能富集分析发现,其大多集中在精氨酸和脯氨酸代谢、Wnt信号通路、蛋白质消化吸收、脂肪酸代谢、TCA循环、胰高血糖素信号通路、甘油磷脂代谢、嘌呤代谢、β-丙氨...     

驴肌内脂肪沉积关键调控因子研究

旨在基于转录组(RNA-Seq)和代谢组(UPLC-MS/MS)关联分析,筛选驴肌内脂肪沉积的关键调控因子.本研究选用饲养条件相同、平均体重为236.10 kg的雌性广灵驴30头,对其背最长肌进行肌内脂肪(IMF)含量的测定,选择年龄一致的驴,并根据其IMF含量的高低分为两组:低肌内脂肪组(L组,每组3头)与高肌内脂肪...     

系统分析肝脏转录组解析猪脂肪沉积的分子调控机制

肝脏是调控猪能量平衡和代谢的重要器官。本研究选择松辽黑猪和长白猪背膘厚度显著差异的个体（每个品种内高、低各3头）为研究对象,利用高通量转录组测序技术鉴定其肝脏组织中基因的表达水平并进行差异表达分析,进一步对差异表达基因进行生物学功能分析。结果表明,在不同背膘厚度的比较中,共发现差异表达基因395个,其中部分参与了花生四烯酸代谢、谷胱甘肽代谢、P450细胞色素代谢过程、脂肪酸代谢、胰岛素抵抗、皮质醇的合成和分泌等通路。ACACA、ELOVL6、OGDHL、GSTO2、GGT5、CREB3L1等基因是肝脏中调控脂肪合成和代谢的关键基因。在不同品种猪中,鉴定出458个差异表达基因,显著富集在PPAR信号通路、细胞色素P450代谢通路、甘油三酯代谢通路、胆汁酸合成、MAPK信号通路、免疫相关通路等通路。PPAR信号通路和CD28、CD59、ICOS、CXCR4、FOS、INF等基因是影响不同品种猪生长性能和免疫性状差异的关键通路和基因。品种内与品种间脂肪沉积差异的分子机制并不相同。本研究对猪脂肪性状的遗传改良、肝脏功能解析有一定意义。     

饲粮蛋白质水平对肥育猪背最长肌嫩度及 骨骼肌特异性蛋白-核转录因子κB信号途径的影响

本试验旨在研究饲粮理想蛋白质水平对背最长肌嫩度及骨骼肌特异性蛋白-核转录因子κB( P94-NFκB)信号途径相关蛋白和钙蛋白酶抑制蛋白(CAST) mRNA表达量的影响.选择初始重约50 kg的杜洛克×长白×大白三元杂交猪90头,随机分配到3个处理,每个处理3个重复,每个重复10头,公母各占1/2.3个处理分别采用1...     

基于HS-SPME-GC-MS和OPLS-DA模型探究不同嫩度驴肉的关键挥发性物质成分差异

旨在检测驴肉挥发性物质成分,探究与广灵驴嫩度相关的关键差异风味物质并解析关键挥发性物质与嫩度基因之间的功能与联系。本研究选用30头生长环境和饲养条件相同、年龄相近的雌性广灵驴为研究对象,进行剪切力和肌内脂肪的测定并依据含量差异将其分为高嫩度组(HT,n=4)和低嫩度组(LT,n=4)。通过HS-SPME-GC-MS技术检测广灵驴背最长肌挥发性物质成分,利用香气活性值(odor activity value, OAV)筛选驴肉关键风味物质,并结合多元统计分析方法获得变量重要性投影(variable importance in the projection, VIP)筛选与嫩度相关的关键差异风味物质,后基于Pearson系数与转录组学进行联合分析,寻找出驴肉嫩度关键风味物质与差异基因之间的联系。结果,在广灵驴背最长肌中共鉴定出41种挥发性物质,包括醇类、醛类、烃类、酮类、酯类以及2种其他物质。通过OAV筛选出13种关键风味物质,发现影响驴肉的主要挥发性物质和贡献者是醛类。通过VIP和OAV值筛选出1-辛烯-3-醇、1-辛醇以及月桂醛既是嫩度的差异物质又是对驴肉风味有贡献的关键风味物质。利用...     

饲粮蛋白质水平对猪背最长肌calpainl含量、嫩度及血液激素水平的影响

为研究饲粮蛋白质水平对猪背最长肌calpain1表达的影响及其与肌肉嫩度的关系,选用54头约50kg的LY(长×大)二元杂交去势公猪,随机分为3个处理,每个处理3个重复,每个重复6头猪,分别饲喂10%、18%、26%3种蛋白质水平的饲粮,各饲粮能量及氨基酸模式保持一致,饲养76 d后屠宰取样,测定猪背最长肌中calpain1的相对含量、背最长肌的嫩度及血浆中的主要激素水平.结果表明,calpain1的相对含量和剪切力值均随蛋白质水平的升高而升高,但两者之间相关性不显著(P>0.05).血浆中皮质醇、甲状腺素(T<,4>)的含量随蛋白质水平的升高而减少(P=0.211,P=0.039),胰岛素的含量随蛋白质水平的升高而增加(P=0.103).Calpain1可能参与了血液中主要激素对蛋白质降解的调控过程.     

不同饲喂方式对生长猪背最长肌中钙蛋白酶抑制蛋白表达量以及肉嫩度的影响

为研究不同饲喂方式对猪背最长肌钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)表达量以及肉嫩度的影响,选用54头约60kg的三元杂交生长肥育猪,随机分为3个处理,每个处理3个重复,每个重复6头猪,分别按照自由采食组(对照)、限饲组(30%)、补偿生长组(前20d限饲30%后20d自由采食)进行不同的饲养。试验结果表明:自由组、补偿生长组、限饲组的肌纤维剪切力和钙蛋白酶抑制蛋白表达量依次显著升高,且随着钙蛋白酶抑制蛋白表达量的增多,剪切力值有上升的趋势。     

基于转录组测序研究健康三益菌对肉鸡脂质代谢的影响

旨在探讨健康三益菌调控肉鸡脂质代谢的主要基因和通路,阐明其影响脂质代谢的作用机理.本研究选取200只1日龄雄性黄麻肉鸡随机分为2组,每组5个重复,每个重复20只,对照组正常饮水,益生菌组在饮水中添加1％健康三益菌复合制剂(干酪乳杆菌:嗜酸乳杆菌:双歧杆菌=1 ∶ 1 ∶ 2),试验期为42 d.测定肉鸡肉质品质,并对回...     

基于转录组分析挖掘平凉红牛背最长肌肉质性状候选基因

旨在挖掘与平凉红牛背最长肌营养成分含量相关的候选基因,以提高肉品质。本研究选用相同饲养条件下30月龄及750 kg的40头阉牛,测定蛋白质、脂肪和水分3种常规营养成分的含量,分别挑选表型数据具有极端差异的高、低组,每组3个重复。通过主成分分析和比较转录组分析筛选具有显著因子载荷基因(significant factor loading genes, SFLGs)和差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs),并进行富集分析。利用所有样本的转录组数据和表型数据进行加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA),筛选与表型相关的目标基因模块(r>0.35且P<0.05)与Hub基因(hub genes, HGs)。针对蛋白质、脂肪和水分含量3个性状分别鉴定到91、81和80个SFLGs(第一主成分PC1和第二主成分PC2)和18、85和338个DEGs,其中PC1和PC2共有的SFLGs分别有8、4和3个,具有显著因子载荷的DEGs分别有1、3和2个,富...     

基于转录组数据挖掘牦牛皱胃发育代谢的关键候选基因

旨在比较不同年龄段牦牛皱胃指数测定、转录组表达谱的变化,挖掘影响牦牛皱胃发育代谢的信号通路和关键基因,为进一步探讨牦牛皱胃发育机制提供理论基础。本研究对1日龄、20日龄、60日龄、15月龄与3岁的牦牛皱胃组织进行转录组测序,对转录组数据进行质控、比对、差异表达基因筛选,并对差异表达基因进行GO功能注释和KEGG富集分析。为进一步验证测序数据的可靠性,随机选取5个差异表达基因进行qRT-PCR验证。结果显示,在发育过程中,瘤胃重的增长最快,其次是瓣胃、网胃和皱胃。转录组结果显示,以1日龄组为对照,在20日龄、60日龄、15月龄和3岁组中分别鉴定到1 310、1 715、1 931和2 199个差异表达基因,4个组共有基因565个;以前一个时间点为对照,20日龄、60日龄、15月龄和3岁组分别鉴定到1 310、861、569和597个差异表达基因,4个对比组共有基因9个。GO功能注释发现,以1日龄组为对照,20日龄、60日龄、15月龄和3岁组分别富集到1 191、2 578、1 117和2 835条显著条目,不同年龄组的前10条显著性GO条目中有共有的,也有各年龄阶段特有的条目。KEGG富...     

乌头驴与三粉驴骨骼肌中miRNAs的表达鉴定与分析

试验旨在分析microRNAs （miRNAs）在德州驴骨骼肌中的表达情况,探讨小RNA （small RNA）在驴骨骼肌发育中的调控机制。采集德州驴2个品系（乌头驴和三粉驴）的背最长肌组织,构建乌头驴背最长肌（WB）和三粉驴背最长肌（SB）的small RNA测序文库并进行测序,运用生物信息学技术对WB和SB之间差异表达的miRNAs进行分析,预测和解析可能影响驴产肉性状的miRNAs,从中挑选了6个表达量较高的miRNAs,利用实时荧光定量PCR技术来验证测序结果的准确性。结果表明,在WB和SB文库中分别鉴定出保守miRNAs有982和1 149个,新miRNAs有106和143个。在WB与SB比较组中基于条件|log₂（fold_change）|≥2、P≤0.05获得17个差异表达的miRNAs,其中表达量上调的有5个,下调的有12个。通过GO注释,发现差异表达的miRNAs显著富集于调控细胞迁移分化、细胞分裂和骨骼肌细胞收缩等生物学过程（P<0.05）,并且挖掘到与驴骨骼肌发育相关的bta-miR-378d_L+1R-1_1ss22CA、bta-miR-378d_R-2,其靶向NPY1R、GPR152、BEST1、KCNH8、SPAG9等多个基因。KEGG富集结果表明,miRNAs富集于Wnt、MAPK、泛素蛋白水解系统等与骨骼肌发育相关的信号通路中,其中在Wnt信号通路中共涉及到17个差异表达miRNAs的207个靶基因,尤其以PC-5p-84483_31、hsa-miR-186-3p_R-3和cfa-miR-329b_1ss19CT的靶基因最多。实时荧光定量PCR结果与miRNAs测序结果一致,并发现除eca-miR-181b外,其他5个miRNAs在SB中的表达水平均高于WB。本研究首次对驴骨骼肌miRNAs进行转录组学分析,揭示了乌头驴和三粉驴miRNAs的表达差异,研究结果为阐明德州驴骨骼肌生长发育的分子调控机制提供参考。     

广灵驴分子系谱的建立及群体遗传结构分析

旨在对广灵县优种驴场保种群体进行调查的基础上构建分子系谱,并对其种群的遗传结构进行分析。本研究采集保种群成年、体况良好的广灵驴（体重350~400 kg）颈静脉血10 mL（n=107）,其中公驴13份,母驴94份,抗凝处理后提取全血DNA。采用12个微卫星标记进行荧光PCR扩增后,用ABI3730测序仪进行分型。分型结果采用Cervus 2.0和Pedigraph 2.4软件构建分子系谱,同时采用STRUCTURE2.3和Fstat软件计算群体遗传参数,采用R语言的hclust函数绘制7头公驴及其后代的系统发生NJ树（邻接树）。结果,对107头种驴进行了分子系谱构建,找到了30头子代的父亲和7头子代的母亲,系谱可靠性>90%;微卫星标记的平均观测杂合度（H_Obs）和多态信息含量（PIC）分别为0.676 5和0.593 9,标记遗传多样性较高;NJ树对7个公驴家系进行了聚类;群体分化系数（F_ST）为0.184,群体平均近交系数（F_IT）为0.033,群体内近交系数（F_IS）为-0.238,且群体处于哈代-温伯格平衡状态,存在很弱的近交。本研究建立了广灵驴保种群可靠性较高的分子系谱并对其遗传结构进行了分析,证明该群体遗传多态性较高,群体近交系数较低,处于较好的保种状态,具有较大的品种资源开发潜力。     

广灵驴ADSL基因克隆、序列分析及组织表达研究

本研究旨在对广灵驴腺苷琥珀酸裂解酶（adenylosuccinatelyase,ADSL）基因进行克隆及生物信息学分析,并检测其在不同组织中的表达情况,为探究ADSL基因在广灵驴肌苷酸合成及风味形成中的作用机制提供理论参考。根据GenBank中公布的马（登录号：XM_001917207.5）、牛（登录号：NM_001102377.2）、猪（登录号：GU249574.1）等物种的ADSL基因mRNA序列,通过Primer Premier 3.0在线工具设计同源引物,RT-PCR法扩增并克隆ADSL基因序列,对编码序列进行结构与功能分析,最后用实时荧光定量PCR检测ADSL基因在广灵驴心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌组织中的表达水平。结果显示,广灵驴ADSL基因CDS长1 473 bp,编码490个氨基酸,提交至NCBI,登录号：MW037837,其核苷酸序列与马、牛、双峰驼、猪、绵羊、人、小鼠的相似性分别为99.5%、90.8%、92.3%、90.4%、90.7%、90.5%和86.0%。进化树分析结果表明,广灵驴与马的种属关系最近,与小鼠的亲缘关系最远。ADSL蛋白分子质量为55.44 ku,等电点为6.52,平均疏水指数为-0.243,是一种不稳定的酸性亲水蛋白。ADSL蛋白有41个磷酸化修饰位点,6个糖基化修饰位点,没有信号肽和跨膜结构,有1个卷曲螺旋。ADSL蛋白主要定位在细胞质,α-螺旋（68.98%）是主要的二级结构。ADSL基因在广灵驴6个组织中都有表达,其中肺脏中的表达量最高,显著高于其他组织（P<0.05）,其次是心脏和肝脏,脾脏、肾脏和背最长肌中的表达量最低。本研究结果为今后探究ADSL基因在广灵驴肌苷酸合成及风味形成的分子机制奠定基础。     

广灵驴HSL基因克隆、序列分析与差异表达

试验旨在对广灵驴的激素敏感脂酶（hormone sensitive lipase,HSL）基因进行克隆和序列分析,并对HSL基因在广灵驴不同组织中的差异表达水平进行分析。使用RT-PCR法扩增并克隆广灵驴HSL基因CDS区部分序列,将序列拼接后得到HSL基因完整的CDS区全长序列,并对序列进行一系列生物信息学分析,通过实时荧光定量PCR检测HSL基因mRNA在广灵驴的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌和皮下脂肪7个组织中的表达情况。结果显示,广灵驴HSL基因完整的CDS区全长为2 286 bp,共编码761个氨基酸,序列已提交到NCBI,登录号：MN231003。广灵驴HSL基因的核苷酸序列与马、羊驼、骆驼、猪、牛、山羊、小鼠、绵羊相应序列的同源性分别为99.6%、88.9%、88.6%、88.1%、86.9%、85.6%、80.8%、79.1%。系统进化树预测表明,广灵驴HSL基因与马的亲缘关系最近,与小鼠的亲缘关系最远。生物信息学分析发现,HSL蛋白的理论等电点为6.51,不稳定指数为56.83,亲水性的总平均值为-0.048,说明HSL是酸性不稳定的水溶性蛋白。蛋白保守域中存在N-末端结构域、α/β水解酶折叠结构域以及调节结构域。蛋白序列中共存在88个磷酸化修饰位点、25个糖基化修饰位点。蛋白中存在较强的疏水性区域,没有信号肽及跨膜区域。二级结构显示此蛋白是由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲构成的,分别占45.33%、11.70%、5.65%、37.32%。实时荧光定量PCR检测结果显示,HSL基因mRNA在广灵驴的7种组织中均有表达但存在差异,在皮下脂肪中表达量最高,在心脏中表达量最低,说明广灵驴HSL基因可能在体内脂肪沉积中发挥着非常重要的作用。该试验为进一步研究HSL蛋白功能及其在广灵驴脂肪沉积中代谢调控机制提供了理论基础。     

广灵驴FTO基因克隆、序列分析及组织差异表达

【目的】对广灵驴脂肪和肥胖相关基因(fat mass and obesity-associated gene, FTO)进行克隆及序列分析,同时检测其在广灵驴各组织中的表达差异,以探究广灵驴FTO基因结构对其生理代谢功能的影响。【方法】运用RT-PCR技术扩增并克隆广灵驴FTO基因CDS序列,进行基因及蛋白质功能分析,同时运用实时荧光定量PCR方法检测FTO基因在广灵驴7种组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌及皮下脂肪)中的差异表达。【结果】广灵驴FTO基因CDS区序列长1 518 bp,编码505个氨基酸,序列提交至NCBI,登录号:MZ169553。广灵驴FTO基因与马、猪、牛、人、羊驼、绵羊和山羊的相似性为99.3%、90.3%、89.5%、90.8%、90.7%、89.2%和89.2%;系统进化树分析发现,广灵驴与马的亲缘关系最近。FTO蛋白分子质量为58.35 ku,理论等电点为5.07,脂肪系数为80.36,不稳定系数为48.82,平均疏水指数为-0.550,为不稳定的酸性亲水蛋白。FTO蛋白无信号肽和跨膜区,主要定位于细胞质中,具有34个磷酸化位点与5个糖基化位点...     

广灵驴DGAT2基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

本研究旨在对广灵驴二酰基甘油酰基转移酶2（DGAT2）基因进行克隆,生物信息学分析和检测其在不同组织中的表达情况,为探究DGAT2基因在广灵驴脂肪沉积和提高乳脂率等方面的作用机制提供理论参考。根据GenBank上公布的马（登录号：XM_023645689.1）、双峰驼（登录号：XM_010973154.1）、绵羊（登录号：XM_027979550.1）等物种的DGAT2基因mRNA序列,利用Primer Premier 3.0在线工具设计同源引物,应用RT-PCR法扩增DGAT2基因序列,用生物信息学方法分析DGAT2基因编码序列,用实时荧光定量PCR技术检测DGAT2基因在广灵驴心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、背最长肌、肌间脂肪、皮下脂肪组织中的表达。结果显示,广灵驴DGAT2基因CDS序列1 086 bp,编码361个氨基酸,提交到GenBank,获得登录号：MT993643,其编码序列与马、牛、双峰驼、猪、绵羊、人、小鼠的同源性分别为99.0%、92.0%、93.5%、92.0%、92.7%、85.3%、84.1%。系统进化树分析表明,驴与马的亲缘关系最近,和小鼠的关系最远。DGAT2蛋白分子质量40.96 ku,脂肪系数92.85,等电点9.16,是一种具有跨膜区的稳定碱性疏水蛋白。DGAT2蛋白有28个磷酸化修饰位点,2个糖基化修饰位点,没有信号肽,主要定位在内质网,α-螺旋（39.89%）和无规则卷曲（36.01%）是主要的二级结构。DGAT2基因在检测的8个组织中都有表达,其中皮下脂肪中的表达量显著高于其余组织（P<0.05）,其次是心脏、肝脏和肾脏,背最长肌中的表达量最低。本试验结果为探究DGAT2基因在广灵驴脂肪沉积和提高乳品质性状的作用奠定基础。     

广灵驴CAPN1基因克隆、生物信息学分析及表达研究

本研究旨在对钙蛋白酶1（CAPN1）基因CDS区进行克隆及生物信息学分析,并鉴定其在广灵驴各组织中的表达量。应用生物信息学方法对广灵驴CAPN1基因CDS区进行序列分析,并对其编码蛋白的理化性质、亚细胞定位、翻译后修饰结构和蛋白结构进行预测;利用实时荧光定量PCR技术对CAPN1基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和背最长肌6种组织中的表达水平进行分析。结果显示,广灵驴CAPN1基因CDS区全长2 148 bp,可编码715个氨基酸,已提交至NCBI,登录号为：MN158194,其核酸序列与马、绵羊、牛、人、山羊、小鼠、猪的同源性分别为99.7%、92.3%、92.5%、92.0%、92.5%、85.9%和92.9%;CAPN1蛋白的分子质量为82.01 ku,理论等电点为5.59,平均疏水性为-0.374,不稳定系数为36.42,不存在跨膜区及信号肽;其编码蛋白的二级结构由无规则卷曲、α-螺旋、β-转角和延伸链组成;CAPN1基因在广灵驴的6种组织中均表达,其中在背最长肌中的表达量最丰富,其次是肝脏,在心脏中的表达最低。本研究成功克隆了广灵驴CAPN1基因CDS,并对其在不同组织中的表达量进行了分析,为进一步研究CAPN1基因在肌肉嫩度方面的表达调控功能及发展地方品种广灵驴肉制品产业提供了理论依据。