绵羊CCL19基因启动子活性分析及其转录调控元件筛选

【目的】 鉴定绵羊趋化因子C-C基序配体19(C-C motif chemokine ligand 19,CCL19)基因启动子的核心启动子区域和关键转录因子,探究该基因在转录调控方面的作用机制。【方法】 选取绵羊CCL19基因5'-侧翼序列1 000 bp,PCR扩增启动子的7个不同长度的截短片段,并连接至pGL3-Basic质粒;将重组质粒与pRL-TK质粒共转染到293T细胞中,结合双荧光素酶报告基因检测系统分析不同截短片段的相对荧光活性。利用在线预测软件分析和筛选CCL19基因核心启动子区域内的转录因子结合位点。采用定点突变技术构建转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体,与pRL-TK质粒共转染到293T细胞,分析转录因子结合位点缺失质粒的相对荧光活性。【结果】 成功构建了7个不同长度(pGL3-P、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5及pGL3-P6)的CCL19基因启动子片段的荧光素酶报告载体;采用双荧光素酶报告基因检测系统鉴定出转录起始位点上游－256/－186 bp为CCL19基因启动子核心启动子区域,表明该区域对CCL19基因转录调控有重要作用。生物信息学分析预测到该区域存在POU5F1(-201/-189 bp)、ZBTB26(-228/-217 bp)、FOXI1(-239/-228 bp)、GLI2(-255/-243 bp)和SP2(-219/-211 bp) 5个转录因子的结合位点,并成功构建了转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体。双荧光素酶报告基因检测系统分析显示,POU5F1转录因子的结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性极显著降低(P<0.01),FOXI1、ZBTB26、SP2转录因子结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性均极显著升高(P<0.01)。【结论】 试验成功构建CCL19基因启动子荧光素酶报告载体,确定CCL19基因启动子的核心启动子区域为转录起始位点上游－256/－186 bp,并鉴定出转录因子POU5F1结合位点可能是CCL19基因转录的重要调控位点,为下一步研究绵羊CCL19基因在先天性免疫、适应性免疫和淋巴细胞迁移等方面的功能提供理论基础。     

海南黑山羊与其F1代杂交羊皮下脂肪转录组测序比较分析

为了研究海南黑山羊与其F1代杂交羊(努比亚山羊公羊与海南黑山羊母羊杂交)皮下脂肪组织的遗传差异,本研究采用RNA-Seq技术和生物信息学方法对2种山羊皮下脂肪组织进行转录组测序分析,运用DESeq鉴定2种山羊皮下脂肪组织间差异表达的mRNAs和lncRNAs,对差异表达的mRNAs进行GO功能、KEGG通路富集分析,同时对差异表达的lncRNAs进行靶基因预测分析。结果显示：海南黑山羊与其F1代杂交羊皮下脂肪间存在330个差异表达的mRNAs,其中4个基因在F1代杂交羊皮下脂肪中特异表达、1个基因在海南黑山羊皮下脂肪中特异表达,在330个差异表达的mRNAs中,根据差异倍数大小,排名前10位的基因分别是PLXDC1、AOC1、SHROOM3、NTS、SPATS2、LOC102181165、BDKRB2、GSDMA、ETNK2、EPOR;存在138个差异表达的lncRNAs,其中9个在F1代杂交羊皮下脂肪中特异表达、5个在海南黑山羊皮下脂肪中特异表达。此外,本研究共获得143个差异表达lncRNAs顺式作用靶基因和135个差异表达lncRNAs反式作用靶基因。本研究为进一步研究山羊皮下脂...     

鹅MyoG基因启动子活性及转录调控元件分析

旨在分析鹅MyoG基因启动子活性区域和转录因子,探究该基因的转录调控机制.本研究首先通过PCR扩增泰州鹅MyoG基因5'侧翼区序列1 245 bp并对其进行测序和生物信息学分析,其次,构建4个不同缺失片段的双荧光素酶报告载体,转染C2C12细胞系.进一步利用在线软件预测核心启动子区关键转录因子,对转录因子结合位点HNF...     

海南黑山羊CAST基因的时空表达分析

采用SYBR Green实时荧光定量PCR技术检测了CAST基因在1、2、3、4月龄和12月龄海南黑山羊骨骼肌、心肌、肝脏和脂肪组织中mRNA表达差异和发育规律,为揭示CAST基因的生物学功能及其对肉质的表达调控机理提供参考依据.结果表明,CAST基因在未成年羊的骨骼肌中mRNA表达量极显著高于其他组织（P＜0.01）,且在2月龄时达到最高水平;成年后在心肌、肝脏和脂肪中的表达量极显著升高（P＜0.01）,在骨骼肌中的表达量次之,但在脂肪中的表达量始终相对较低;该基因在3、4月龄各组织中的mRNA表达量相对较低,且四种组织在3、4月龄间表达差异不显著（P＞0.05）.     

牛IRX3基因启动子转录调控分析

旨在探究牛IRX3基因组织表达规律,并鉴定其启动子区关键转录因子,以期阐明其转录调控机制。本研究采集3头成年公牛心、肝、脾、肺、肾、皮下脂肪、背最长肌、大肠、小肠、网胃、瘤胃、皱胃及睾丸组织,利用荧光定量PCR检测IRX3基因在不同组织中相对表达量。同时克隆牛IRX3基因1.8 kb启动子区序列并构建其启动子6个不同缺失片段的双荧光素酶报告载体,分别转染3T3-L1和C2C12细胞系。进一步利用在线软件预测核心启动子区关键转录因子,借助定点突变及siRNA干扰技术在3T3-L1细胞系内初步鉴定关键转录因子对IRX3基因的转录调控作用。结果表明,IRX3基因在牛13个不同组织中均有表达,且在肺、肾、心、皮下脂肪、背最长肌中高表达（P<0.05）。利用双荧光素酶报告载体检测到牛IRX3基因核心区域在-372/-42 bp。结合定点突变及siRNA干扰技术初步鉴定NRF1、KLF4、HOXA5和CREB1转录因子对IRX3基因的转录活性有重要的调控作用。综上表明,牛IRX3基因在背最长肌和脂肪组织中表达量相对较高,其启动子1.8 kb区有8个CpG岛,核心区关键转录因子NRF1、KLF4、HOXA5和CREB1位于CpG岛内且调控IRX3基因转录活性。本研究结果为探究IRX3基因在牛脂肪沉积过程中的分子调控机制奠定了重要理论基础。     

海南黑山羊产业发展现状与思路

海南黑山羊是海南省优良地方品种,同时也是国家农产品地理标志保护品种。黑山羊产业是海南省畜牧特色产业,作为海南“四大名菜”之一,黑山羊肉深受当地、两广及东南亚地区消费者喜爱。但黑山羊产业在发展过程中也存在着一些问题,如优良基因退化、产业规模水平较低、饲养技术落后等。本文综述了海南黑山羊产业发展现状,并针对其中存在的问题提出了一些发展建议,以期更好地促进海南黑山羊产业的健康发展。     

海南黑山羊及其F1代杂交羊背最长肌转录组测序比较分析

为了鉴定和分析海南黑山羊与其F1代杂交羊(努比亚山羊公羊与海南黑山羊母羊杂交)背最长肌中差异表达的mRNA和lncRNA,试验以6月龄海南黑山羊及其F1代杂交羊公羊为试验动物,逐头采集背最长肌样品,采用RNA-Seq技术和生物信息学方法对两种山羊背最长肌进行转录组测序分析,运用DESeq软件鉴定两种山羊背最长肌组织间差异表达的mRNA和lncRNA,对差异表达基因进行GO功能注释、KEGG信号通路富集分析,同时对差异表达的lncRNA进行靶基因预测分析。结果表明：海南黑山羊及其F1代杂交羊背最长肌间存在276个差异表达的mRNA,其中1个mRNA只在海南黑山羊背最长肌中表达,2个mRNA只在F1代杂交羊背最长肌中表达;在273个共同表达的mRNA中,根据差异倍数大小,排名前10位的分别是NDUFB5、TMEM237、LOC102170968、TXLNB、GPR63、OSBPL1A、KERA、LOC108638040、BMF、HSP70.1。存在145个差异表达的lncRNA,其中16个只在海南黑山羊背最长肌中表达,7个只在F1代杂交羊背最长肌中表达。276个差异表达基因共富集在50个G...     

海南黑山羊体尺与体重的通径分析及最优回归模型的建立

本文运用SAS软件分别分析了海南后备黑山羊和成年黑山羊的体尺与体重间的相关、体尺对体重的直接和间接影响以及体尺对体重的决定程度,最后建立了体重与体尺的最优回归模型。结果表明胸围是影响海南黑山羊体重的最主要的体尺因素。选择海南黑山羊快长系时应在选择体重的同时,加强对胸围的选择力度。海南黑山羊后备羊及成年羊体尺对体重的最优回归模型分别为:Y=-45.1117+0.2909X2+0.4115X3+0.6781X4+0.6815X6和Y=-46.3559+0.1802X2+0.4448X3+0.7701X4+0.8720X6。     

猪MBL2基因序列特征分析

研究采用生物信息学方法分析了猪MBL2基因,进一步获得猪MBL2基因序列特征及编码蛋白的结构和功能,并且对CDS区里的编码蛋白的理化性质进行了预测。除此之外还对这些编码蛋白是亲水还是疏水、它们的糖基化位点、信号肽、二级结构以及三级结构进行了预测。实验结果表明,猪的MBL2基因的大小是723 bp,编码的氨基酸共有240个,蛋白质的相对分子质量为25 522.83 KDa,理论等电点PI为4.97。MBL2基因的二级结构是无规则的卷曲型,蛋白结构预测结果是一种可溶性蛋白,具有4个外显子;在第20-21位氨基酸之间存在信号肽,表现为亲水性。研究结果为进一步研究猪MBL2基因的功能提供了理论基础。     

不同日粮精粗比对海南黑山羊抗氧化性能的影响

为了探讨不同精粗比对海南黑山羊机体氧化应激的影响,选用3只体况良好的成年海南黑山羊去势公羊,采用3×3拉丁方设计,预试期7d,正试期22 d.以新鲜王草和混合精饲料为基础日粮,研究不同精粗比(50∶50、20∶80、80∶20)对海南黑山羊血浆抗氧化指标的影响.结果表明:精粗比为20∶80和80∶20的日粮条件下,血浆总抗氧化能力(T-AOC)和过氧化氢酶活性(ACT)显著低于对照组(精粗比50∶50)(P＜0.05),丙二醛(MDA)含量显著高于对照组(P＜0.05).精粗比20∶80处理组谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性显著低于对照组(P＜0.05),各组超氧化物歧化酶(SOD)活性差异均不显著(P＞0.05),精粗比20∶80与80∶20处理组间各项指标差异不显著(P＞0.05).说明日粮营养物质的缺乏和不平衡对机体氧化应激有明显影响.     

猪SEPW1基因的转录调控分析

本研究旨在对猪SEPW1基因的潜在启动子区进行克隆及转录活性分析,获得其核心启动子区域,并进一步分析转录因子SP1对SEPW1基因转录活性的影响,为探索SEPW1基因在猪肉质性状方面的功能奠定基础。利用实时荧光定量PCR检测SEPW1基因在大白猪各组织中的表达量,构建空间表达谱;通过PCR技术克隆得到6个逐级缺失的SEPW1基因启动子片段,构建6个双荧光素酶报告载体,通过检测各载体的双荧光素酶活性获得SEPW1基因的核心启动子区域;对核心启动子区进行生物信息学分析,发现潜在的SP1转录因子结合位点;通过过表达、抑制表达、定点突变及凝胶迁移试验（EMSA）确认SP1转录因子结合位点的存在及其对SEPW1基因转录活性的影响。结果显示,SEPW1基因在所检测的4月龄大白猪12个组织中均有表达,其中在腓肠肌及心脏中的表达量较高。双荧光素酶活性显示,猪SEPW1基因5'侧翼区-443~-231 bp为其核心启动子区,且-378~-306 bp存在1个潜在的SP1结合位点。过表达和抑制表达SP1基因结果显示,转录因子SP1能够促进SEPW1基因的转录;定点突变及EMSA试验确认,转录因子SP1可直接与SEPW1基因启动子区的SP1结合位点（-348~-339 bp）相结合。综合以上结果表明,转录因子SP1可直接靶向SEPW1基因的启动子区并促进SEPW1基因的转录。     

金堂黑山羊白介素10基因的克隆及表达分析

为探究山羊白介素10（interleukin 10,IL-10）基因的序列特征及在组织中的相对表达情况,试验采用PCR法扩增并克隆金堂黑山羊IL-10基因,用DNAMAN、DNAStar、ExPASy等生物信息学软件进行序列分析,运用实时荧光定量PCR法检测IL-10基因在金堂黑山羊不同组织中的表达情况。结果显示,金堂黑山羊IL-10基因序列长为379 bp,开放阅读框为276 bp,编码91个氨基酸残基。IL-10蛋白二级结构中含有α-螺旋、β-转角和无规则卷曲,分别为76.92%、2.20%和20.88%。IL-10蛋白三级结构模型与人IL-10（1ilk.1.A）基因同源性最高（86.81%）。系统进化分析结果发现,金堂黑山羊IL-10基因与挪威山羊IL-10基因亲缘关系最近。实时荧光定量PCR检测发现,在金堂黑山羊肺脏中IL-10基因表达水平显著高于脾脏、心脏、肌肉和肾脏（P<0.05）,在肾脏中IL-10基因表达水平显著高于脾脏、心脏和肌肉（P<0.05）,在脾脏、心脏和肌肉中IL-10基因表达水平较低,但差异不显著（P>0.05）。本试验结果揭示了IL-10基因具有高度的保守性,可能参与调控山羊的免疫应答反应。