斑点蒙古马TRPM1和RFWD3基因分型及分子选育方案制定

被毛颜色不仅是品种和个体鉴别的重要依据,而且也是制定选育方案时需要考虑的重要性状之一。TRPM1和RFWD3是决定豹点毛色表型的2个关键候选基因。本研究首次将60匹斑点蒙古马为研究对象,对2个基因进行分型,从分子水平对其毛色做出鉴定,验证斑点蒙古马的毛色基因型是否与已公布的马豹点毛色研究结果一致。结果:60匹斑点蒙古马TRPM1基因与对照组(非斑点毛色马)相比,均存在C/T(ECA1 108 249 293)杂合位点;通过测定RFWD3基因的3′调控区序列, ECA3 23 658 447上存在3种不同的多态性,分别为T/T、T/G和G/G。本研究为今后斑点蒙古马的分子育种奠定理论基础。     

蒙古马黑素细胞激素受体1(MC1R)基因多态性与毛色表型相关性研究

为了探讨蒙古马的毛色与黑素细胞激素受体1(MC1R)基因的相关性,试验采用PCR-RFLP技术对蒙古马5个类群及三河马和纯血马的MC1R基因进行了多态性检测,并对多态位点与毛色性状之间的相关性进行分析.结果表明:蒙古马MC1R基因在901 bp处发生碱基错义突变(C→T),该突变导致出现EE、Ee及ee 3种基因型.群...     

蒙古马免疫组织NF-κB信号通路相关基因的表达研究

为丰富蒙古马NF-κB信号通路的研究内容,为蒙古马机体固有免疫调控的研究奠定理论基础,本研究采用实时荧光定量PCR和Western Blot方法,分析蒙古马肝脏、脾脏、肺脏和血液组织中NF-κB信号通路上7个基因的表达情况.结果表明,7个基因在4个组织中均有表达,但存在差异.NF-κB p50、IL-1β和NFKBIA...     

鲁禽3号麻鸡能量需要研究

为了研究鲁禽3号麻鸡的最佳能量需要,选用1日龄健康雏鸡1 080只,公母各1/2,随机分成9组,按不同营养水平饲喂,每组3个重复,每个重复公、母鸡各20只。试验分为一期(0~5周龄)、二期(6~10周龄)和三期(11~13周龄)3个试验期,利用SPSS软件对试验结果进行差异性分析。回归分析结果表明,在本研究条件下,鲁禽3号麻鸡能量需要量(MEI)可按下式估算:一期:MEI=(6 750.7 W0.75-69.2)△W 10.96 W0.75二期:MEI=(221.4-2 020.1 W0.75)△W 3.89 W0.75三期:MEI=(122.4-572.1 W0.75)△W 3.53 W0.75     

蒙古马肌酸激酶基因多态性和不同运动时期表达量的研究

采用PCR-SSCP方法检测CKM基因编码区序列在蒙古马群体中的遗传变异,发现在所检测的50匹蒙古马中未发现多态位点。另外,通过荧光定量PCR的方法,对不同运动时期的蒙古马骨骼肌中CKM mRNA的表达量进行了研究,发现从未训练过的蒙古马在长距离急性运动刚结束及运动后的恢复期(4 h后),CKM mRNA的表达量均发生了下降;但训练和骑乘过的蒙古马与从未训练的蒙古马相比,CKM mRNA的表达量发生了显著的下降(P<0.05),说明蒙古马CKM基因的表达与骨骼肌对运动的适应相关。     

蒙古马高负荷运动训练前后COX4I2、FABPpm和CAV-1基因表达量的研究

为研究蒙古马高负荷运动训练前后COX4I2、FABPpm和CAV-1基因表达量的影响,实验选择3匹5岁雌性蒙古马,采用qRT-PCR方法检测为期4个月的强度递增高负荷运动训练后蒙古马臀中肌3种基因在mRNA水平的表达变化。结果表明:经训练后蒙古马肌肉中COX4I2和FABPpm基因表达量均显著升高(P<0.05);CAV-1基因表达量也有升高(P>0.05)。可见,COX4I2、FABPpm和CAV-1基因与蒙古马的运动能力存在密切关系。     

蒙古马肌肉中运动相关基因训练前后差异表达分析

为了进一步了解蒙古马超群的耐力性能形成的分子机理,试验对蒙古马训练前后肌肉组织中肌球蛋白(MHC)-Ⅰ和肌钙蛋白1(TNNC1)基因的表达量进行了比较分析,以6匹2岁的雌性蒙古马为试验对象,以自然状态和耐力训练后的状态为变异因素,采用q PCR的方法检测经耐力训练后蒙古马肌肉中MHC-Ⅰ和TNNC1基因在mRNA水平的表达变化。结果表明:经训练后蒙古马肌肉中MHC-Ⅰ基因的表达量极显著低于训练前(P0.01),而TNNC1基因的表达量极显著高于训练前(P0.01)。     

蒙古马和纯血马免疫相关基因差异表达分析

为了评价蒙古马(Equus mongolian horse)和纯血马(E.thoroughbred)免疫生理机能在适应特殊生存环境和人工选择压力过程中相关基因的表达多样性。本研究对健康成年蒙古马(n=3)和纯血马(n=3)的颈静脉血液进行RNA-Seq和品种间表达谱比较分析。对2岁左右健康蒙古马(n=3)和纯血马(n=3)采集肝脏、脾脏、肺脏和血液样品，利用qRT-PCR方法，分析NF-κB信号通路7个基因在两个品种中的表达情况。利用Western blot方法，分析蒙古马和纯血马肺脏中核因子κB亚基p65 (RELA proto-oncogene NF-kB subunit, NF-κB p65)蛋白和白细胞介素1β (interleukin 1 beta, IL-1β)蛋白的表达情况。结果表明，RNA-Seq共获得19.69～23.95 Gb的高质量数据和1 199个差异表达基因，许多差异表达基因直接参与机体的免疫过程。NF-κB信号通路7个基因在蒙古马和纯血马4个免疫组织中均表达，基因表达的品种间差异存在组织多样性；7个基因在蒙古马肺脏的表达量均高于纯血马，除肿瘤坏死因子(tum...     

蒙古马长期高负荷运动训练前后肌肉发育关键基因的表达研究

旨在比较研究长期高负荷运动训练前后蒙古马肌肉组织中与肌肉发育相关关键基因的表达量,从而为马匹耐力训练方案的制定提供数据支持。本研究以3匹5岁雌性蒙古马为试验对象,对其进行为期4个月的连续性高负荷耐力运动训练,并在实施运动训练前后采集臀中肌肌肉用于后续研究。采用RT-qPCR和Western blot方法,比较分析长期高负荷运动训练前后蒙古马肌肉组织中MYL-2和TNNC1基因在转录和翻译水平的表达量。结果表明,经长期高负荷运动训练后蒙古马骨骼肌中MYL-2和TNNC1基因在mRNA水平的表达量极显著高于运动训练前(P0.01)。在蛋白水平,MYL-2的表达量在运动训练后有了极显著的增加(P0.01),而TNNC1在运动后虽有增加但未达到显著水平(P0.05)。长期的高负荷运动训练对蒙古马肌肉发育相关基因MYL-2和TNNC1的表达均有促进作用,从而能够促进肌肉的发育,对蒙古马的耐力形成至关重要。     

基于高速双倍自助法对蒙古马系统发育树的研究

旨在利用高速双倍自助法研究蒙古马系统发育树的问题。本研究选用30匹蒙古马的mtDNA D-loop区碱基序列,其中包括5个蒙古马类群(巴尔虎马、三河马、乌审马、乌珠穆沁马、锡尼河马)各6匹,对其所有105个可能系统树(普氏野马作为外群,6匹)进行分析,利用生物信息学软件Mega6和PAMAL4.9,以最大似然法估计蒙古马的最大似然系统树。最后利用生物信息软件CONSEL、R3.0中的SDBP包等计算105个候补系统树的基于高速双倍自助法的可靠度(speedy double bootstrap P-value,SDBP)。结果表明,SDBP值最大的蒙古马系统树共有3个分支,巴尔虎马与乌审马合并为一个分支,具有较近的遗传关系;乌珠穆沁马与锡尼河马具有较近的遗传关系;三河马独立于其他4种蒙古马,构成一个系统发育分支。SDBP值最大的蒙古马系统树与三河马和其他4类蒙古马具有较远的预测血缘关系是一致的,同时此结果的系统树也具有最大似然值。本研究结果还表明,采用最大似然法结合SDBP值分析蒙古马的系统拓扑关系是较最大似然法结合渐近无偏(approximately unbiased,AU)值以及结合自助(bootstrap P-value,BP)值分析蒙古马系统拓扑关系更有效。同时也比非加权组平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)有效,而与邻接法(neighbor joining,NJ)得到了相近的结论。上述结果提示,我们的研究结果使蒙古马的进化理论奠定在更坚实的遗传学基础上,可推动蒙古马的进化理论进一步发展与完善。     

Construction of IGF-II shRNA Knockdown Vector and Its Effect on Sertoli Cells in Yak

The aim of this study was to construct shRNA recombinant vector interfering insulin-like growth factor-II (IGF-II), and study the effects of IGF-II on the yak sertoli cells. The shRNA oligonucleotides targeting yak IGF-II were designed and synthesized and it was cloned into pLKO.1 plasmid vector, after transfected into yak sertoli cells, a stable cell line was obtained by puromycin selection. The relative expressions of IGF-II mRNA and protein were identified by qRT-PCR and Western blotting, respectively. The proliferation and apoptosis of sertoli cells were analyzed by proliferation measurement system. The results showed that the pLKO.1-shRNA vector interfering IGF-II was successfully constructed, which was stably expressed in sertoli cells and could interfere the expression of yak IGF-II effectively. Compared with the control group, the interference efficiency of pLKO.1-shRNA2 was the most significant, IGF-II expression down-regulated to 19.1% (P<0.05), and could reduce the expression of endogenous IGF-II protein by 76.3% (P<0.05). The stable cell line obtained by transfection and screening of pLKO.1-shRNA2 plasmid had significant lower activity of cell division and proliferation than that of control group after 48 h of culture (P<0.05). The results of qRT-PCR showed that the expressions of IGF-I and IGF-IIR in sertoli cells were significantly up-regulated (P<0.05), and the expressions of IGF-IR and Bcl-2 were significantly down-regulated (P<0.05) after interfering IGF-II. In conclusion, the interference plasmids of IGF-II were successfully constructed. After interference plasmid was transfected into yak sertoli cells, it could effectively inhibit the expression of IGF-II, change the expression pattern of IGF-IR and Bcl-2, and potentially affect the division and proliferation of yak sertoli cells, however, the specific regulation mechanism requires further studied.     

Construction and Identification of Cell Penetrating Peptides VP22 Gene Fused with Enhanced Green Fluorescent Protein and Three Antigens of Toxoplasma gondii

To study a novel vaccine of Toxoplasma gondii,the recombinant plasmids that cell penetrating peptides VP22 gene fused with one enhanced green fluorescent protein（EGFP)(pcDNA-VP22-EGFP)and three antigens of T.gondii（pcDNA-VP22-SAG1,pcDNA-VP22-GRA4 and pcDNA-VP22-AMA1）were constructed,respectively.The recombinant plasmids were identified by PCR,restriction endonuclease digestion and DNA sequencing.The pcDNA-VP22-EGFP plasmid was transfected into COS7 cells,and the expression of VP22-EGFP in COS7 cells was confirmed by fluorescence microscope and RT-PCR.The results showed that all recombinant plasmid were constructed correctly.Green fluorescence was observed successfully under the fluorescence microscope in transfected cells after 72 h.The gene fragment of 1 449 bp was obtained by RT-PCR.The results indicated that the recombinant plasmids were constructed successfully.     

牦牛IGF-II干扰载体的构建及其转染对睾丸支持细胞的影响

旨在构建干扰胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor-II,IGF-II）的重组质粒载体,研究IGF-II对牦牛睾丸支持细胞的影响。本研究设计并合成针对牦牛IGF-II的shRNA寡核苷酸,并将其克隆至pLKO.1质粒载体上,转染牦牛睾丸支持细胞后经嘌呤霉素筛选获得稳定的细胞株,并采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹法检测IGF-II基因和蛋白的表达,采用细胞生长分析仪分析支持细胞的增殖凋亡情况。结果显示,干扰牦牛IGF-II表达的pLKO.1质粒载体构建成功,其可在睾丸支持细胞中稳定表达,且能有效抑制IGF-II基因的表达。与对照组相比,pLKO.1-shRNA2的干扰效率最显著,IGF-Ⅱ的表达量下调至19.1%（P<0.05）,且pLKO.1-shRNA2可使内源性IGF-II蛋白的表达量减少76.3%（P<0.05）。pLKO.1-shRNA2质粒转染及筛选得到的稳定细胞株培养48 h后的细胞分裂增殖活性显著低于对照组（P<0.05）。qRT-PCR结果显示,干扰内源性IGF-II后,睾丸支持细胞中的IGF-I和IGF-IIR基因表达出现了显著的上调（P<0.05）,IGF-IR与Bcl-2的表达出现了显著的下调（P<0.05）。综上表明,牦牛IGF-II干扰质粒构建成功,其转染至牦牛睾丸支持细胞有效抑制了IGF-II的表达,改变了IGF-IR与Bcl-2的表达模式,潜在影响了牦牛支持细胞的分裂增殖,具体作用机制有待进一步研究。     

The studies on the transfection of EGFP-fused porcine circovirus Type 2 genome

This study described construction and transfection of an EGFP-fused Porcine Circovirus Type 2 (PCV2) genome and the recovery of the virus. Posttransfection, PCV2 (ORF1)-EGFP/pSK, PCV2 (ORF3)-EGFP/pSK, PCV2 (ORF4)-EGFP/pSK and PCV2(ORF5)-EGFP/pSK showed no fluorescent signals in transfected cells, while green fluorescent signals were observed in the nuclei of PK-15 cells after PCV2 (ORF2)-EGFP/pSK transfection. The presence of ORF2-EGFP fusion protein was demonstrated by dual signals of green fluorescence and anti-PCV2 antibodies conjugated with rhodamine in an immunofluorescence assay (IFA). Furthermore, the released EGFP-fused PCV2 genome was demonstrated by real-time PCR.     

Construction and Validation of Oct4-EGFP Pluripotent Reporter Vector in Pig

This study aimed to construct Oct4-EGFP pluripotent reporter vector in pig without destroying cells researching the expression pattern of Oct4, thus contributing to early embryonic development and stem cell research.Construct Oct4-EGFP pluripotency reporter vector with the In-Fusion PCR cloning technology, the Oct4 promoter sequence to direct the recombinant vector pEGFP-N1 instead of EGFP original CMV promoter plasmid pEGFP-N1 by Oct4 and liposomal transfection technology, and transfected into livability of porcine fetal fibroblasts cells.The results showed that it had successfully constructed Oct4-EGFP pluripotency reporter vector by PCR and sequencing verified, and initially verified the validity of the carrier in the parthenogenetic blastocysts.After liposomal transfection, 8 genetically modified cells of incorporates pluripotent report carrier with the Oct4-EGFP had been gained by screening and PCR.Thus, the In-Fusion PCR cloning technology could efficiently construct Oct4-EGFP pluripotency reporter vector and obtained transgenic positive cells could lay the foundation for the early development and embryonic stem cell research of pig embryos.     

猪Oct4-EGFP多能性报告载体的构建与验证

本研究旨在构建一套猪Oct4-EGFP多能性报告载体,可在不破坏细胞的前提下研究Oct4的表达规律,从而有利于早期胚胎发育研究及干细胞的研究。试验采用无缝克隆(In-Fusion PCR cloning)技术,将Oct4启动子序列直接重组到pEGFP-N1载体上,用Oct4代替质粒pEGFP-N1中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)原有的CMV启动子构建出Oct4-EGFP报告载体,并用脂质体转染技术转染入大白猪胎儿成纤维细胞中,分析Oct4-EGFP报告载体,表达情况。结果发现,经PCR及测序验证,成功构建了Oct4-EGFP多能性报告载体,并在孤雌囊胚上初步验证了载体的有效性;经过脂质体转染,经筛选及PCR鉴定,获得了8株整合有Oct4-EGFP多能性报告载体的转基因细胞。研究结果表明,运用无缝克隆技术可高效率构建Oct4-EGFP多能性报告载体,且获得的转基因阳性细胞可为猪胚胎早期发育和胚胎干细胞研究奠定技术基础。     

猪神经介素B受体基因慢病毒过表达载体的构建与鉴定

【目的】构建猪神经介素B受体(NMBR)基因慢病毒过表达载体,并检测其在猪Leydig细胞中的表达,为研究NMBR基因过表达在猪睾丸间质(Leydig)细胞中的功能提供参考。【方法】根据猪NMBR基因(GenBank登录号：KM058699)CDS序列设计并合成特异性酶切引物,通过RT-PCR扩增获得猪NMBR CDS全长序列,构建pMD19-T-NMBR质粒;通过XbaⅠ和EcoRⅠ对pCD513B-1和pMD19-T-NMBR质粒双酶切,构建pCD513B-1-NMBR重组质粒;将pCD513B-1-NMBR重组质粒与辅助质粒共转染人胚肾细胞(HEK-293T),转染48 h后通过荧光倒置显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)情况,收集细胞培养液上清获得猪NMBR基因过表达慢病毒,并通过倍比稀释法测病毒效价;然后将猪NMBR基因过表达慢病毒转染猪Leydig细胞,转染48 h后观察细胞中GFP表达,收集细胞并通过实时荧光定量PCR检测NMBR mRNA的表达情况。【结果】通过RT-PCR成功扩增获得猪NMBR CDS全长序列,大小为1 173 bp; pMD19-T-NMBR重组质...     

山羊痘病毒双向启动子序列的克隆与鉴定

为鉴定山羊痘病毒(GPV)基因组中的启动子序列,本研究预测GPV基因组中早期转录因子VETF-l和中期转录因子VITF-3基因序列之间56 bp的一段序列为双向启动子,并将其命名为Pb56。通过PCR技术将该启动子序列的两个方向(Pb56+,Pb56-)分别与绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因融合,构建重组转移重组质粒,分别命名为pUC-TK12-Pb56(+)-EGFP和pUC-TK12-Pb56(-)-EGFP。用脂质体转染法将2个转移重组质粒以及阴性对照pUC-TK12-EGFP及阳性对照pUC-TK12-P7.5-EGFP分别转染GPV预感染的BHK细胞;采用EGFP报告基因的表达水平评估双向启动子的活性。结果表明该基因序列的两个方向均能启动EGFP的表达,初步证实了该基因序列为GPV的双向启动子;Pb56+和Pb56-的转录活性均高于痘苗病毒的P7.5启动子。     

BMP4调控睾丸支持细胞增殖的初步研究

旨在研究BMP4对睾丸支持细胞增殖的调控。本试验选取0、1、2和3月龄组的健康大足黑山羊公羊各3只,采集睾丸支持细胞,每次试验均设3个生物学重复和3次技术重复,通过体外培养、细胞免疫荧光、基因干扰、过表达、qPCR和Western blotting等技术对BMP4是否通过Id2对山羊睾丸支持细胞进行调控以及它们的调控关系进行验证。结果发现,BMP4在2月龄组大足黑山羊睾丸支持细胞中的表达量极显著高于0、1月龄组（P<0.01）;在一定范围内,随着BMP4浓度的增加睾丸支持细胞的增殖活性有所增强,BMP4浓度为200 ng·mL^-1时其增殖能力最强（P<0.05）;干扰BMP4后,细胞增殖活力显著下降（P<0.05）,但在72 h后回到正常水平（P>0.05）,PCNA的表达极显著降低（P<0.01）,表明干扰BMP4后细胞的增殖能力受到限制,细胞增殖指数测定结果进一步说明,干扰BMP4后细胞的增殖能力受到限制;过表达BMP4后,Id2基因表达水平极显著增加（P<0.01）,表明BMP4对Id2具有正向调控作用;相对过表达BMP4再干扰Id2试验组,干扰Id2试验组的PCNA基因的表达水平显著降低（P<0.05）,这进一步证明BMP4可以调控该基因和蛋白表达。综上所述,山羊睾丸支持细胞的增殖活力在一定范围内与BMP4的浓度呈正相关;且BMP4能够正向调控Id2的表达,并通过促进Id2的表达进而促进支持细胞的增殖。本研究为阐明BMP4调控山羊睾丸支持细胞的分子机制和生理功能提供了基础。     

牛lncRNA H19过表达载体构建

[目的]构建以及鉴定牛lncRNA H19过表达重组载体,为进一步探究lncRNA H19与miRNA 491和牛CART基因的互作关系奠定试验基础。[方法]NCBI获取牛lncRNA H19序列,经聚合酶链式反应(PCR)扩增,双酶切后载入pcDNA3.1-EGFP载体得到重组质粒。将pcDNA3.1-EGFP-H19、miRNA 491和CART 3种质粒共转染至HEK293T细胞,在细胞内反复扩增过表达之后,利用荧光定量技术检测pcDNA3.1-EGFP-H19的表达量。[结果]结果显示pcDNA3.1-EGFP-H19载体序列正确;293T细胞绿色荧光达50%,且强度适中,说明转染效果良好;lncRNA H19在293T细胞中显著表达。[结论]pcDNA3.1-EGFP-H19载体构建成功,试验将为后续探究lncRNA H19与miRNA 491和CART基因之间的互作关系创造试验条件。