猪流行性腹泻病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立

为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)血清抗体的间接ELISA方法,本研究以原核表达的重组N蛋白作为检测抗原,优化ELISA反应条件,建立了PEDV间接ELISA抗体检测方法。该方法仅对PEDV血清检测为阳性,对猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒感染猪的阳性血清检测结果均为阴性;其批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%。采用建立的ELISA方法检测了130份临床样品,其中78份血清样品为PEDV抗体阳性。表明建立的以重组N蛋白为包被抗原检测PEDV血清抗体的方法可以用于检测PEDV感染及相关的流行病学调查。     

PEDV流行株N基因主要抗原表位原核表达及ELISA方法的建立

为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白抗体的ELISA方法,应用RT-PCR从腹泻仔猪样本中扩增获得了1段PEDV河南流行毒株N基因全长序列,根据对其氨基酸序列的抗原性分析结果,将N基因上2个大的抗原表位区(112³21位氨基酸)克隆至原核表达载体pET-32α,构建pET-32α-N重组质粒并转化至宿主菌BL21(DE3)中。将重组菌在37℃条件下加入IPTG进行诱导使该蛋白获得了高效表达,表达产物为融合蛋白,相对分子质量约41 300。Western-blot分析表明,所表达的蛋白可与抗PEDV全病毒小鼠阳性血清发生反应。以纯化的重组N蛋白作为包被抗原建立了检测PEDV抗体的间接ELISA方法,抗原最佳包被量0.226μg/孔,血清最佳稀释度为1∶100,二抗最佳稀释度为1∶2 000,待检血清D450值≥0.28判定为阳性。国内首次用该方法对临床猪血清样本进行了检测,母猪血清PEDV抗体阳性率为84.26%(166/197),仔猪血清阳性率为27.93%(31/111)。结果表明,建立的间接ELISA方法特异性、灵敏性和可重复性良好,可用于临床上PEDV抗体水平的监测和PED流行病学调查。     

基于间接ELISA检测方法新生仔猪流行性腹泻病探析

本文为探析新生猪仔的流行性腹泻病毒,构建猪流行性腹泻病毒蛋白间接的ELISA检测方法,从新分离PEDV流行毒株中扩增其N基因,并将N基因克隆至DNA原核表达载体中构建重组质粒,经过诱导的重组蛋白呈可溶性表达。将纯化的N蛋白作为包被抗原建立ELISA检测方法,并且对各种检测条件进行优化优化后确定N蛋白最佳包被条件为37度,该间接ELISA方法为PEDV诊断和流行病学调查提供了有益参考。     

猪流行性腹泻病毒病S蛋白单抗制备及夹心ELISA检测PEDV方法的建立与应用

应用PCR扩增出PEDV毒株的纤突糖蛋白S基因序列,并将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建出pGEX-4T-1-S表达载体。应用IPTG诱导表达重组S蛋白,并将重组蛋白以弗氏完全/不完全佐剂乳化后免疫小鼠,制备抗PEDV S蛋白的单克隆抗体,并以此建立了检测PEDV抗原的双抗体夹心ELISA方法,确定、优化了所建立的ELISA反应条件。以建立的双抗体夹心ELISA和RT-PCR方法对PEDV样品进行了比较检测,两者的符合率为100%。应用ELISA检测了吉林省疑似PED流行猪场的粪便样品,发现PEDV阳性检出率为68%。该研究为PED诊断及流行病学调查提供了一种特异、敏感、快速和易于在基层应用的技术方法及本病的防治提供了流行病学理论依据。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白杆状病毒表达与间接ELISA方法建立

为了检测猪群中猪流行性腹泻(PED)抗体水平,用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,构建含有PEDV N基因的重组杆状病毒r Bac-PEDV N并在昆虫细胞中获得表达。用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,建立了检测PEDV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。与Western Blot的符合率为91.3%,说明该方法适用于PED的临床诊断。     

乳汁中猪流行性腹泻IgA抗体间接ELISA方法的建立

为建立检测母猪乳汁中猪流行性腹泻病毒(PEDV)IgA抗体的间接ELISA方法,研究以PEDV重组N蛋白和纯化全病毒作为包被抗原,方阵滴定法优化反应条件,建立了两种检测猪乳汁中PEDV IgA抗体的间接ELISA方法。结果显示,重组N蛋白和纯化全病毒的最佳包被抗原浓度均为2μg/mL,检测样品最佳检测稀释度分别为1∶10和1∶30,重复性试验的变异系数均小于10%,PEDV阳性乳汁的最低检测稀释倍数分别为1∶320和1∶960,对猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病病毒等阳性乳汁均无交叉反应性,两种方法对临床样品检测符合率为97.48%。表明两种方法均具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于检测和评价乳汁中特异性PEDV IgA抗体的水平。     

猪流行腹泻病毒N蛋白表达与PPA-ELISA抗体检测方法的建立

为建立一种快速的猪流行性腹泻病毒抗体检测方法,本研究参照已发表的猪流行性腹泻病毒(PEDV)N基因序列,RT-PCR扩增了长约1 300 bp的N基因片段,连接pET30a表达载体后获得了以可溶性形式表达的重组N蛋白.重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性.以该蛋白作为诊断抗原,建立检测PEDV抗体的PPA-ELISA诊断方法.该诊断方法具有良好的敏感性、特异性和重复性,为PEDV的快速诊断、免疫猪群抗体监测和PEDV流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法.     

小反刍兽疫病毒N蛋白抗体与H蛋白抗体在羊体内代谢消长规律的研究

为研究小反刍兽疫病毒N蛋白抗体与H蛋白抗体在羊体内的代谢消长规律,试验通过建立小反刍兽疫N蛋白双抗原夹心ELISA抗体检测方法、H蛋白阻断ELISA抗体检测方法与血清中和抗体试验方法,分别检测了羊免疫疫苗后体内N蛋白抗体与H蛋白抗体在每个免疫阶段的代谢消长变化。结果表明:羊免疫小反刍兽疫疫苗后,血清内的N蛋白抗体与H蛋白抗体在6~8周时血清抗体效价较高,对应的羊体内中和抗体效价为1∶512,且效价至少可以持续到10周以上,2种抗体具有一定消长代谢规律的相关性。该研究结果也为以N抗原与H抗原为基础建立相应的抗原捕获ELISA方法、竞争ELISA检测方法、间接ELISA检测方法以及双抗原夹心ELISA检测方法奠定了一定的理论依据。     

PEDV流行株重组截短N蛋白间接ELISA检测方法的建立

为了建立猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)抗体检测的间接ELISA方法,本研究以纯化的原核表达的PEDV截短N蛋白作为包被抗原,建立了PEDV抗体检测的间接ELISA方法,将该方法命名为rnPED-ELISA。该抗原不与其他常见的7种猪病的阳性血清发生交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数均小于13%;rnPED-ELISA相对于血清中和试验(SN)试验的敏感性为93.33%,特异性为90.00%;rnPED-ELISA与TSZ全病毒抗体检测试剂盒的符合率达91.67%。采用rnPED-ELISA方法检测200份临床样品,PEDV抗体阳性检出率为69.5%。本试验建立的rnPED-ELISA方法具有良好的敏感性和特异性,可为免疫猪群抗体监测和猪流行性腹泻流行病学调查提供一种快速、简便的血清学诊断方法。     

猪流行性腹泻病毒间接ELISA检测方法的建立

本研究获得5个猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)S1基因截短基因,原核表达后制备多克隆抗体。酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、Western blot和间接免疫荧光检测(indirect immunofluorescence assay,IFA)显示,仅有SE蛋白诱导的多克隆抗体具有免疫活性。因此以SE蛋白为抗原建立间接ELISA抗体检测方法,优化各反应参数并确定临界值为0.155。经特异性和符合性分析,该ELISA检测方法具有PEDV特异性,符合率为93.7%。批内、批间重复率变异系数均小于10%,表明建立的iELISA方法重复性良好。抗S蛋白的ELISA检测方法的建立为PEDV血清学抗体检测和疫苗评估奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测血清中非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFV p30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFV p30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a （+）中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42 ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2 μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1：100,最佳封闭液为1% BSA,酶标抗体最佳稀释度为1：4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1：1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均<10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。     

Development and Application of a PEDV Nsp7-based Indirect ELISA for Antibody Detection

This study was aimed to establish an indirect ELISA to detect antibodies against different strains of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV). Puried nonstructural protein 7(Nsp7) was used as coating antigen, and the indirect ELISA was established by optimizing the ELISA reaction conditions. The results showed that the optimal reaction conditions were as follow:The amount of coating antigen was 0.20 μg/well, and the coating condition was at 37℃ incubation for 1 h then 4℃ overnight; The working dilution of serum samples and HRP-labelled secondary antibody were 1:300 and 1:10 000, and the incubation time were 2 and 1.5 h, respectively; TMB substrate incubation time was 15 min. Serum sample was determined as positive when its S/P>0.1694 and negative when its S/P<0.1398. The ELISA was specific, reproducible and sensitive. Forty samples of suspected PEDV serum samples were tested by the established ELISA, and the coincidence rate between the ELISA and the commercial kit was 95%. The ELISA established in this study could be used clinically to detect the antibody level of different strains of PEDV, and it also had the potential for early diagnosis of PEDV, providing a basis for the development of effective measures to control PEDV.     

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立

旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的阻断ELISA方法.采用原核表达的ASFVp54蛋白作为包被抗原,并制备了针对p54蛋白的单克隆抗体,采用方阵滴定法确定了阻断ELISA方法的最佳反应条件,并对建立的方法进行了敏感性、特异性、重复性和符合性评价.结果显示,抗原最佳包被浓度为2.0 μg·mL-1,抗原包被温...     

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的ASFV p30重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体。以重组p30蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的p30单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化,建立了一种检测ASFV抗体的阻断ELISA方法。ROC曲线分析显示,该方法最佳阻断率临界值为16.63%。该方法与CSFV、FMDV-O/A、PRRSV、PEDV、SVA的阳性血清均无交叉反应;最低能检出1∶128稀释的阳性血清;批内和批间变异系数(CV)均＜10%。用本方法与商品化试剂盒平行检测208份血清样品,Kappa值为0.96,表明具有高度一致性。上述结果表明,本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的特异性和敏感性,可用于血清ASFV抗体的检测,为ASFV流行病学调查及猪群疫情监控提供技术支持。     

非洲猪瘟病毒p22蛋白表达、多克隆抗体制备及间接ELISA方法的建立

【目的】试验旨在表达与纯化非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)的结构蛋白p22,将其作为包被抗原建立ASFV抗体的间接ELISA检测方法,用于诊断非洲猪瘟。【方法】将ASFV p22编码基因KP177R的截短体(24―145位氨基酸)克隆至原核表达载体pET-32a(+)中,将重组质粒pET-32a-p22转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经0.1 mmol/L IPTG诱导表达5 h,利用镍柱亲和纯化p22蛋白,并进行Western blotting鉴定。利用p22蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清,并以含p22全长基因的真核表达质粒pCAGGS-EGFP-fp22转染HEK293T细胞为抗原基质,利用间接免疫荧光(IFA)鉴定抗血清的反应性。以重组p22蛋白为包被抗原,优化最佳抗原包被浓度、待检血清稀释度、封闭条件、抗原抗体反应时间、酶标二抗工作浓度等参数,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法,并对临床猪血清样品进行检测。【结果】ASFV p22截短蛋白在大肠杆菌中高水平表达,蛋白产量为0.85 mg/100 g菌体;p22蛋白具...     

Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of porcine epidemic diarrhea coronavirus antibodies in swine sera

An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detecting serum antibodies to the porcine epidemic diarrhea coronavirus (PEDV) was established by using cell culture-grown PEDV as antigen for coating. Ultracentrifugation through 20 and 45% (w/w) sucrose cushions proved to be the best antigen purification method. Examination of 1024 swine sera showed a high specificity and a greater sensitivity of the ELISA, when compared with indirect immunofluorescence. Reference sera with high antibody titers to PEDV originated from two pigs experimentally infected with PEDV. Three different antigen purification methods and the advantages of the ELISA compared with an immunofluorescence test are discussed.     

Establishment of Indirect ELISA Detection Method for Porcine Epidemic Diarrhea Virus

Porcine epidemic diarrhea (PED) is an acute, highly contagious enteric disease of pigs. Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) is the causative agent of PED. PED has caused significant economic losses to the pig industry. In this study,the purified PEDV as the coating antigen, by optimizing the ELISA reaction conditions,the indirect ELISA antibody detection method was established. The optimized reaction conditions were as follows: Antigen working concentration was 20 μg/mL; Serum sample dilution was 1:500;It was coated at 4℃ overnight; The plates were blocked by 5% calf serum incubated at 37℃ for 1 h; The secondary antibody was diluted at 1:10 000,incubated at 37℃ for 1 h. It was judged as positive when the cutoff value D_{450 nm}≥0.289,as negative when D_{450 nm}≤0.236,and as suspicious between 0.289 and 0.236.It could not react with the positive sear of other six viruses such as porcine respiratory and reproductive syndrome virus,porcine circovirus 2, classical swine fever virus, porcine parvovirus,pseudo rabies virus and foot-and-mouth disease virus. The variation coefficient of repeated test was less than 10%.74 pig serum samples from Jiangsu, Jiangxi, Fujian and Guangdong were detected,and the positive rate was 84%.It indicated that this method could be used for PEDV epidemiological surveys and diagnosis in the future.     

猪流行性腹泻病毒间接ELISA检测方法的建立

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的猪的一种急性、高度传染性肠道疾病,给养猪业造成了严重的经济损失。本研究以纯化的PEDV 为包被抗原,通过优化 ELISA 反应条件,建立了间接 ELISA 抗体检测方法,其反应条件为：抗原最佳包被浓度为 20 μg/mL,血清标准品最佳稀释度为 1：500,包被时间为4℃过夜,5%小牛血清37℃封闭1 h,二抗 1：10 000稀释,37℃作用1 h,抗体临界值为 D_{450 nm}≥ 0.289判为阳性,D_{450 nm}≤ 0.236判为阴性,介于二者之间为可疑。检测猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、伪狂犬病毒、细小病毒和口蹄疫病毒标准血清抗体均为阴性,重复试验变异系数均小于10%,对江苏、江西、福建、广东地区74份猪血清样品进行检测,抗体阳性率达84%,表明该方法具有较好敏感性、特异性和重复性,可用于 PEDV 抗体检测和流行病学调查。     

Use of two enzyme-linked immunosorbent assays to monitor antibody responses in swine with experimentally induced infection with porcine epidemic diarrhea virus.

A blocking ELISA was developed to detect antibodies directed against porcine epidemic diarrhea virus (PEDV). The PEDV antigen was first incubated with dilutions of test sera. Any antigen that was not blocked by antibodies in the serum was assayed in a double-antibody sandwich ELISA, using 2 monoclonal antibodies directed against different antigenic sites on PEDV as capture and detecting antibodies, respectively. The blocking ELISA was compared with a fixed-cell ELISA that used monolayers of Vero cells infected with PEDV prototype strain CV777 as a solid phase and a conjugate of an IgG-specific monoclonal antibody for antibody detection. Pigs were inoculated with PEDV strain CV777 or 1 of 2 field isolates, and antibody responses were measured by use of the 2 tests. Antibodies were detected by the blocking ELISA as early as postinoculation day 7 and, by the fixed-cell ELISA, as early as postinoculation day 14. From day 14 on, antibody titers for both tests correlated highly. Titers for the fixed-cell ELISA were 5.4 times higher than those for the blocking ELISA. The latter technique is easier to perform and discriminates well between infected and noninfected pigs, which makes this test useful for routine diagnosis and serologic surveys of porcine epidemic diarrhea.     

基于单克隆抗体的O型口蹄疫病毒抗体固相竞争ELISA检测方法的建立

为建立评价O型口蹄疫病毒(FMDV)疫苗免疫水平的方法,本研究以单克隆抗体(MAb)3D9为捕获抗体,以HRP标记的MAb 8E8作为检测MAb,经过条件优化建立了基于MAb的检测O型FMDV抗体的固相竞争ELISA(SPCE)方法。对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,MAb 3D9的最佳稀释度为1:25 000,灭活O型FMDV抗原的最佳稀释浓度为1:3,HRP标记的MAb 8E8的最佳稀释度为15 000,当血清1:32稀释时,检测的临界值确定为45%。该方法分别检测A型FMDV抗体阳性参考血清以及牛冠状病毒、牛轮状病毒以及猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒的标准阳性血清,检测结果均为阴性,未出现交叉反应。经检测,当阳性标准血清的抗体稀释度在1:512时,该方法仍具有较好的敏感性;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,表明其重复性较好。并将该方法与液相阻断ELISA(LPBE)方法和病毒中和试验(VNT)的相关性进行了比较,结果显示该方法与LPBE和VNT的相关性分别为0.896和0.923。本研究为国内评价O型FMDV疫苗免疫水平建立了一种新的方法。