利用单碱基编辑器定点突变猪肌肉生长抑制素基因的研究

【目的】利用单碱基编辑器在宁乡花猪肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因第2外显子处引入终止密码子,以获得MSTN基因表达沉默的肾成纤维细胞系,为后期培育MSTN碱基编辑猪奠定基础。【方法】首先在MSTN基因的第2外显子处设计1条单向导RNA (single guide RNA,sgRNA),将其连接至pMLM3636-puro质粒,形成重组表达载体pMLM3636-puro-MSTN,与含有红色荧光碱基编辑器YE1-BE3-FNLS共转入宁乡花猪肾成纤维细胞中,在红色荧光和嘌呤霉素双筛选条件下,挑取单克隆细胞,测序验证后,分析阳性单克隆细胞的蛋白表达情况。【结果】在MSTN基因第2外显子处发生了碱基定点突变,目标位点的氨基酸序列由色氨酸(TGG)转变成终止密码子(TAA),且G→A突变率为5.5%。Western blotting检测结果表明,试验组10号单克隆细胞的MSTN蛋白表达量与野生型相比降低了60%。【结论】本研究运用单碱基编辑技术在宁乡花猪MSTN基因编码区引入终止密码子,使翻译提前终止,导致蛋白表达量显著降低,为后期MSTN基因碱基编辑猪的生产奠定基础。     

猪蛋白质二硫化物异构酶A4基因克隆及密码子偏好性分析

试验旨在研究猪蛋白质二硫化物异构酶(protein disulfide isomerase A4,PDIA4)基因的密码子使用特性及其与其他物种密码子使用的差异。试验以香猪子宫组织为试验材料,采用RT-PCR方法扩增获得猪PDIA4基因,参考从NCBI数据库中下载的18个不同物种PDIA4基因序列,对猪PDIA4基因的密码子使用特性及其与其他物种密码子的使用差异和进化关系进行分析,同时对猪PDIA4基因与4个模式生物密码子使用偏性进行比较。结果表明,猪PDIA4基因编码区长1 941 bp,共编码646个氨基酸。与NCBI数据库公布的野猪PDIA4基因(GenBank登录号:NM_001267834.1)的相似性达99%。猪PDIA4基因偏好使用G/C结尾的密码子,27种密码子为猪PDIA4基因的偏好密码子(RSCU>1),其中使用频率最高的前3个密码子分别为CTG(RSCU=3.69)、GCC(RSCU=2.31)和CGC(RSCU=2.29)。比较19个物种PDIA4基因发现,不同物种间PDIA4基因的有效密码子数(ENc)、密码子适应指数(CAI)、GC含量以及T、C、A、G、G+C在密码子第3位含量(T3s、C3s、A3s、G3s、GC3s)均存在差异,且密码子偏好以G/C结尾;聚类分析发现,基于CDS序列的系统进化树更符合19个物种的真实分类系统。在密码子使用频率上,猪PDIA4基因与小鼠基因组间密码子使用偏好程度更为接近,故小鼠更适合作为猪PDIA4基因的遗传转化和异源表达的受体系统。     

猪蛋白质二硫化物异构酶A4基因克隆及密码子偏好性分析

试验旨在研究猪蛋白质二硫化物异构酶(protein disulfide isomerase A4,PDIA4)基因的密码子使用特性及其与其他物种密码子使用的差异。试验以香猪子宫组织为试验材料,采用RT-PCR方法扩增获得猪PDIA4基因,参考从NCBI数据库中下载的18个不同物种PDIA4基因序列,对猪PDIA4基因的密码子使用特性及其与其他物种密码子的使用差异和进化关系进行分析,同时对猪PDIA4基因与4个模式生物密码子使用偏性进行比较。结果表明,猪PDIA4基因编码区长1 941 bp,共编码646个氨基酸。与NCBI数据库公布的野猪PDIA4基因(GenBank登录号:NM_001267834.1)的相似性达99%。猪PDIA4基因偏好使用G/C结尾的密码子,27种密码子为猪PDIA4基因的偏好密码子(RSCU1),其中使用频率最高的前3个密码子分别为CTG(RSCU=3.69)、GCC(RSCU=2.31)和CGC(RSCU=2.29)。比较19个物种PDIA4基因发现,不同物种间PDIA4基因的有效密码子数(ENc)、密码子适应指数(CAI)、GC含量以及T、C、A、G、G+C在密码子第3位含量(T3s、C3s、A3s、G3s、GC3s)均存在差异,且密码子偏好以G/C结尾;聚类分析发现,基于CDS序列的系统进化树更符合19个物种的真实分类系统。在密码子使用频率上,猪PDIA4基因与小鼠基因组间密码子使用偏好程度更为接近,故小鼠更适合作为猪PDIA4基因的遗传转化和异源表达的受体系统。     

7个猪种MyoD基因家族中3个基因外显子的SNPs检测分析

本研究利用PCR SSCP技术,以7个猪种为研究对象,根据GenBank上猪的MyoG、MyoD和Myf5基因序列设计了17对引物,对此三基因的外显子进行了SNPs检测。检测结果:MyoG和MyoD两个基因均未检测到多态;在Myf5基因的3个外显子上都检测到了多态:第1外显子上有1个点突变G→C;第2外显子上有3个点突变C→A、A→G、G→A;第3外显子上,3387bp处有1个碱基A缺失,3417bp处有3个碱基T缺失,3443bp处有1个点突变T→C。Myf5基因的高度多态性,说明7个猪种含有丰富的遗传变异信息,具有很高的选择潜力。     

猪肺炎支原体SC株P46基因的定点突变

猪肺炎支原体P46基因中有3个密码子TGA用于编码Trp而非终止密码子,为了在原核表达系统中进行猪肺炎支原体P46基因的根表达,根据其序列设计了3对引物,采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)的方法将编码密码子TGA同义突变为TGG.将突变后的P46基因克隆至pEasy-T载体中,并进行测序.测序结果表明将P46基因中的TGA密码子突变为TGG很成功.     

小型猪与梅山猪Prop1基因的比较分析

Prop1是一种新发现的参与早期胚胎垂体发育的特异性转录因子.在人和动物均已发现由于该基因突变而引起的综合性垂体功能障碍,进而影响生长和繁殖.小型猪与梅山猪比较,其繁殖力和生长性能差异显著,为了了解这些差异的遗传基础,本试验对五指山猪、藏猪和版纳猪3种小型猪的Prop1基因进行克隆测序,并与已知梅山猪的序列进行对比,结果为:五指山猪与藏猪外显子1第69位发生G-A碱基替换,编码同义氨基酸;藏猪外显子2第115位发生A-G碱基替换,编码终止密码子;藏猪与版纳猪外显子3第466位和第631位均发生C-T碱基替换,第466位藏猪编码同义氨基酸;第631位版纳猪编码丝氨酸(TCC),梅山猪编码脯氨酸(CCC),即2种猪的Prop1基因产物不同.在Prop1基因终止密码下游250左右有一个腺苷酸丰富区,五指山猪与藏猪有15个腺苷酸串联,版纳猪有12个.上述结果为进一步研究大猪和小型猪之间生产性能差异的遗传基础提供了新线索.     

6个猪种FUT1基因的多态性分析

α(1,2)岩藻糖转移酶基因1(α-1,2-Fucosyltransferase gene,FUT1)是可以调节大肠杆菌F18侵染猪小肠、并引起仔猪水肿和腹泻的一个抗性基因。采用PCR-SSCP方法,检测了FUT1基因在大白猪、长白猪、杜洛克、马身猪、山西黑猪、晋汾白猪6个猪种中的多态性。结果表明:在大白猪、长白猪和杜洛克这3个引进品种中,存在A、B、C 3种单倍型,A单倍型的平均分布频率为0.58;而在地方品种马身猪及其培育品种山西黑猪和晋汾白猪中只发现了单倍型A。经测序比对发现B单倍型第5位碱基发生了C→A的转换,第145个碱基处发生了T→C的突变;而单倍型C的第372位碱基A发生缺失。大白和杜洛克2个种群Hardy-Weinberg不平衡,FUT1基因在国外引进猪种大白、长白、杜洛克种群多态性丰富。     

藏猪与大约克夏猪GADD45A基因多态性与表达差异研究

为了探究GADD45A基因在猪肌肉生长中的作用,试验选择180日龄的藏猪和大约克夏猪各8头,采用实时荧光定量PCR法测定和分析两品种试验猪只背最长肌、腿肌和垂体组织中GADD45A基因的mRNA相对表达量;同时选择180日龄藏猪37头和大约克夏猪55头,PCR扩增两品种试验猪只GADD45A基因起始密码子上游3 000 bp左右的序列(5′侧翼区),通过混池测序分析序列的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)位点,同时分析SNPs对GADD45A基因转录的影响。结果表明：在背最长肌和腿肌组织中,藏猪GADD45A基因的mRNA表达量均极显著高于大约克夏猪(P<0.01);在垂体组织中,藏猪GADD45A基因的mRNA表达量显著高于大约克夏猪(P<0.05)。GADD45A基因5′侧翼区存在G1 952A、C1 689T、G1 614T 3个突变位点,并且这3个突变位点在藏猪和大约克夏猪中均差异极显著(P<0.01),且均符合哈迪-温伯格定律(P>0.05);经转录因子预测,在C1 689T位点中,当C碱基突变...     

麦洼牦牛SRY基因克隆及序列分析

SRY是Y染色体上具体决定生物雄性性别的基因片段,是多数哺乳动物性别决定基因之一。本试验采用克隆测序SRY基因并结合生物信息学对其序列进行分析,利用软件Codon W分析麦洼牦牛、普通牛、绵羊、山羊、猪、小鼠、鸡和人该基因编码区的密码子偏好性。克隆测序得到SRY基因序列含1个690 bp的开放阅读框,共编码229个氨基酸;其编码区核苷酸序列与普通牛、绵羊、山羊、猪、小鼠、鸡、人相应序列间的一致性分别为99.9%、93.9%、91.2%、76.5%、43.3%、21.4%、69.1%。经聚类分析,麦洼牦牛首先与普通牛聚在一起,绵羊与山羊聚为一类,这两类相聚后再依次与猪、人、小鼠相聚,最后与鸡聚为一类,其结果与以往的生物学分类结果一致。该基因编码的蛋白质分子式为C₁₁₅₅H₁₈₂₇N₃₅₁O₃₄₈S₁₁,相对分子质量为2655.0,理论等电点PI为9.55,亲水性平均数为-0.855。其密码子偏好性分析显示,T3_s为0.2905、C3_s为0.3240、A3_s为0.3728、G3_s为0.2963,第3位碱基中出现G和C占第3位碱基总量的48%,同义密码子数为61。上述数据表明麦洼牦牛SRY基因编码序列与普通牛、绵羊、山羊、猪、人具有较高的一致性,在物种进化过程中较为保守。该基因对含A的密码子有较高的偏爱性,尽量避开以G结尾的密码子,且其所编码的蛋白质为亲水性蛋白。     

PRRSV清道夫受体CD163基因的真核表达和功能鉴定

从猪肺泡巨噬细胞(PAM)中提取总RNA为模板,采用RT-PCR法获得猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的受体CD163全基因,将该基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1/V5-HIS A上,构建出真核重组质粒pcDNA3.1-CD163,经酶切和DNA测序证明获得了CD163基因,其序列与GenBank报道序列比较,核苷酸同源性为99.37%。将测序正确的CD163基因在脂质体LipofectamineTM2000介导下转染PK-15细胞,通过间接免疫荧光(IFA)检测到了CD163在PK-15中的表达。将转染的细胞感染PRRSV后,经IFA检测转染CD163的细胞能够被PRRSV感染。     

绵羊胚胎FGF5基因单碱基突变体系的建立

研究旨在利用单碱基编辑技术定点修饰绵羊（Ovis aries）成纤维细胞生长因子5（fibroblast growth factor 5，FGF5）基因第1外显子以引入终止密码子，获得定点编辑类型的绵羊胚胎，为培育具有长毛性状的绵羊提供试验材料。首先设计合成4个单导向RNA （single guide RNA，sgRNA）寡核苷酸链（sgRNA-T1~sgRNA-T4），构建4组不同的重组表达载体；将构建好的pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin和pCMV-AncBE4max-P2A-GFP质粒以共转染的方法分别转入4组绵羊成纤维细胞，随后用Cruiser^TM酶对转染的细胞进行活性检测并在胚胎水平进行测序验证。结果显示，sgRNA-T1和sgRNA-T4组细胞的PCR产物可被Cruiser^TM酶酶切，且测序结果表明都具有靶向效果，编辑效率分别为68.75%和47.37%。利用显微注射技术将不同浓度的AncBE4max mRNA与有效sgRNA混合注射到绵羊孤雌激活胚胎中，并检测胚胎卵裂率、囊胚率和编辑效率，结果显示，胚胎水平的最佳注射浓度组合为AncBE4max （ng/μL）∶sgRNA （ng/μL）=100∶50，从该浓度组中随机挑选的单枚胚胎测序结果显示，引入终止密码子的编辑效率为80%。而sgRNA-T1在不同浓度组合的注射胚胎中均未检测到编辑。本研究针对FGF5基因的第1外显子，通过在成纤维细胞转染表达载体，成功筛选到高效靶向绵羊FGF5基因的2个sgRNA （T1、T4）；通过显微注射绵羊孤雌激活胚胎，成功在胚胎上实现FGF5基因第1外显子打靶位点C→T的转变，为后期FGF5基因定点编辑羊的生产奠定基础。     

Efficient Site-directed Mutation of Porcine IGF2 Gene via Base Editors

This study was aimed to efficiently and accurately edit the growth trait-related gene insulin-like growth factor 2 (IGF2) in porcine fetal fibroblasts cells (PFFs) of Bama pigs using base editors.The IGF2 gene sequences of Bama pigs and Large White pigs were identified by PCR amplification and sequencing,and the expression vector of sgRNA-IGF2 targeting Bama pigs was constructed.Then the editing efficiency and product types at IGF2 gene via different base editors were studied by cell transfection,detection of mixed cell editing efficiency,screening of single cell colonies and genotyping.The results showed that there was a single nucleotide polymorphism (SNP) site at 3 072 bp in intron 3 of IGF2 gene between Bama pigs and Large White pigs,and a single-stranded oligonucleotide sequence targeting the IGF2 gene was designed.The single-stranded oligonucleotide was annealed and ligated with the BsaⅠ-linearized pGL3-U6-sgRNA plasmid to construct the sgRNA-IGF2 expression plasmid.The sequencing results of the recombinant plasmid showed that the sgRNA sequence was accurately inserted between the U6 promoter and the sgRNA scaffold.Four different cytosine base editors (rA1-BE3,hA3A-BE3,hA3A-BE3-Y130F and hA3A-eBE-Y130F) were co-transfected with sgRNA-IGF2-expressing plasmid into PFFs,respectively.The editing efficiency in mixed cells showed hA3A-BE3-based CBEs could introduce higher efficiency of C-to-T mutation than rA1-BE3 (P<0.05).The results of flow cytometry,single cell culture and genotyping showed that 71.43% of single cell colonies were mutant in hA3A-BE3 group,but 42.86% of them had insertions/deletions (indels).The editing efficiency of hA3A-BE3-Y130F (56.86%) and hA3A-eBE-Y130F (40.38%) were lower than hA3A-BE3(71.43%),but the indels of them were also lower (31.37% and 21.15%).In addition,single cell colonies with homozygous mutation at IGF2 gene site were achieved by base editors in this study.Base editors,as new gene editing tools,could efficiently and accurately modify SNP associated with economic traits in pig genome and accelerate genetic improvement.     

碱基编辑器介导的猪IGF2基因高效定点突变

本研究旨在利用碱基编辑器在巴马猪胎儿成纤维细胞（porcine fetal fibroblast cells,PFFs）中对生长性状相关基因胰岛素样生长因子2（insulin-like growth factor 2,IGF2）进行高效、精确的定点编辑。通过PCR扩增和测序对巴马猪和大白猪的IGF2基因序列进行鉴定,构建靶向巴马猪的sgRNA-IGF2表达载体,进而通过细胞转染、混合细胞编辑效率检测、单克隆细胞筛选及基因型鉴定等技术手段研究不同碱基编辑器对猪IGF2基因靶点的编辑效率及突变类型。结果显示,巴马猪和大白猪IGF2基因第3内含子存在第3 072 bp处的单核苷酸多态性（SNP）位点,设计靶向巴马猪IGF2基因的单链寡核苷酸序列。单链寡核苷酸经退火后与BsaⅠ线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒进行重组连接,构建sgRNA-IGF2表达质粒,重组质粒测序结果表明,sgRNA序列已经精确连入U6启动子和sgRNA骨架之间。将rA1-BE3、hA3A-BE3、hA3A-BE3-Y130F和hA3A-eBE-Y130F 4种胞嘧啶碱基编辑器分别与sgRNA-IGF2表达质粒共转染至猪胎儿成纤维细胞中,对混合细胞编辑效率进行检测结果表明,对于IGF2基因靶点,hA3A-BE3系列碱基编辑器C到T的编辑效率显著高于rA1-BE3（P<0.05）。流式分选、单克隆细胞培养及鉴定结果表明,虽然有71.43%的hA3A-BE3单克隆细胞已被编辑,但有42.86%的细胞存在插入和缺失（indels）;hA3A-BE3-Y130F和hA3A-eBE-Y130F的编辑效率（56.86%和40.38%）虽低于hA3A-BE3（71.43%）,但是indels的效率也较低（31.37%和21.15%）。测序结果分析表明,利用碱基编辑器高效筛选到IGF2基因靶点纯合点突变的单克隆细胞。碱基编辑器作为新的基因编辑工具,可以对猪基因组中与经济性状关联的SNP位点进行高效、精确的基因修饰,为加速猪经济性状的遗传改良提供理论与实践基础。     

三穗鸭SLC4A9基因表达量及其多态性对蛋壳品质的遗传效应分析

为探究溶质载体家族4成员9（solute carrier family 4 member 9,SLC4A9）基因的表达量及其多态性对鸭蛋壳品质的遗传效应,试验采用实时荧光定量PCR法检测SLC4A9基因在三穗鸭不同组织中的表达水平,采用PCR产物直接测序法筛查三穗鸭SLC4A9基因的SNP位点,并分析SNP位点对三穗鸭蛋壳品质的遗传效应。结果显示,SLC4A9基因mRNA在三穗鸭10个组织中均有不同程度表达,其中在心脏和胰腺中为高度特异性表达,肾脏中为中度表达,其他为低度表达。试验共检测到10个SNPs位点,其中3个位于外显子上（g.6803 C>T、g.7065 C>T和g.7089 C>G）,且均为错义突变,7个位于内含子上（g.7162 C>G、g.11044 G>A、g.11090 T>C、g.11234 C>T、g.11261 C>T、g.11349 C>T和g.11403 G>A）,其中g.6803 C>T位点突变导致丙氨酸（GCG）变为缬氨酸（GTG）;g.7065 C>T位点突变导致丙氨酸（GCC）变为缬氨酸（GTC）;g.7089 C>G位点突变导致丙氨酸（GCA）变为甘氨酸（GGA）。χ²检验结果显示,g.6803 C>T、g.11090 T>C和g.11349 C>T突变位点的基因型分布均偏离了Hardy-Weinberg平衡状态（P<0.05）,其余位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。关联分析结果表明,g.11349 C>T位点的CC和CT基因型蛋壳强度显著高于TT基因型（P<0.05）。综上,SLC4A9基因的10个SNPs位点均对三穗鸭的蛋壳品质产生影响,其中g.11349 C>T位点达到了显著水平,可为蛋鸭蛋壳品质的改善及遗传标记提供参考依据。     

采用dCas9-SunTag-DNMT3A技术调控玻璃化冷冻牛卵母细胞IVF囊胚中IGF2R基因甲基化水平

旨在探究dCas9-SunTag-DNMT3A编辑系统对玻璃化冷冻牛卵母细胞IVF囊胚中IGF2R基因甲基化水平及胚胎发育能力的影响,为冷冻卵母细胞/胚胎特定位点DNA甲基化的精确调控奠定基础。本研究将经过体外成熟的牛卵母细胞进行玻璃化冷冻,随后进行体外受精,将受精所得到的原核胚进行dCas9-SunTag-DNMT3A编辑系统的注射,统计并计算卵母细胞的发育情况;通过亚硫酸盐测序的方式检测IGF2R基因启动子的甲基化水平,并利用荧光定量PCR检测IGF2R及相关基因的表达水平。与冷冻组相比,注射不同浓度的dCas9-SunTag-DNMT3A编辑系统后,只有40 ng·μL^-1组显著地提高了玻璃化冷冻卵母细胞IVF后的发育能力(P＜0.05),20和60 ng·μL^-1组间差异不显著(P＞0.05),但40 ng·μL^-1组发育效果仍然显著低于新鲜对照组(P＜0.05);对检测冷冻组、新鲜组、40 ng·μL^-1组IGF2R基因启动子甲基化水平分析发现,40 ng·μL^-1组水平与新鲜组相似,显著高于冷冻组(P＜0.05);荧光定量试验结果显示,40 ng·μL^-1组IGF2R基因mRNA表达水平相较于冷冻组显著降低(P＜0.05),与新鲜组相似。注射40 ng·μL^-1的dCas9-SunTag-DNMT3A甲基化编辑系统能够通过有效升高IGF2R基因启动子甲基化水平(P＜0.05)及显著降低其mRNA表达水平(P＜0.05),来正向调节玻璃化冷冻卵母细胞IVF胚胎的发育情况,提高胚胎发育能力,使得其卵裂率和囊胚率都得到显著提高(P＜0.05),同时促进胚胎发育相关基因的表达。     

细胞松弛素B对猪孤雌胚胎和体外克隆胚胎发育能力的影响

为探讨细胞松弛素B（cytochalasin B,CB）对猪孤雌胚胎和克隆胚胎发育能力的影响,本研究通过在猪体外胚胎培养基中添加不同浓度CB以及不同孵育时间的处理,筛选出CB对猪早期胚胎发育的最适浓度和最佳孵育时间,同时通过Hoechst33342染色检测猪体外囊胚孵化期的细胞数差异,进一步研究CB对孤雌胚胎和克隆胚胎发育的影响。结果显示,培养基中添加CB浓度为7.5 μg/mL时孤雌胚胎和克隆胚胎的卵裂率分别为85.00%和90.23%,囊胚率为35.68%和42.58%,均显著高于其他各组（P < 0.05）;采用7.5 μg/mL CB处理电激活后的孤雌胚胎和克隆胚胎,孤雌胚胎孵育4 h组的卵裂率（83.80%）和囊胚率最高（35.39%）,与其他各组差异显著（P < 0.05）,而克隆胚胎孵育6 h组的卵裂率（83.98%）和囊胚率最高（55.62%）,与其他各组差异显著（P < 0.05）。此外,Hoechst33342染色结果显示,未添加CB处理的孤雌胚胎在囊胚孵化期的细胞平均数为28个,CB处理组的孤雌胚胎和克隆胚胎细胞平均数分别为36和52个,处理组和未处理组细胞数差异显著（P < 0.05）。结果表明,猪体外孤雌胚胎用7.5 μg/mL CB 处理4 h可获得较高的卵裂率和囊胚率;体外克隆胚胎用7.5 μg/mL CB 处理6 h卵裂率及囊胚率最高,且囊胚期内细胞团细胞总数最多。CB处理有利于体外胚胎早期发育,提高克隆胚胎移植受孕率。     

单宁酸对猪卵母细胞体外成熟及胚胎发育能力的影响

研究旨在探讨单宁酸对猪卵母细胞体外成熟质量及其胚胎发育能力的影响。在猪卵丘卵母细胞复合体（COCs）体外成熟培养液中添加不同浓度（0、1、10、100 μg/mL）单宁酸培养42 h后,检测COCs的扩散程度和卵丘细胞扩散指数,统计COCs的体外成熟率,检测成熟卵母细胞内谷胱甘肽（glutathione,GSH）、活性氧（reactive oxygen species,ROS）和生长分化因子9（growth differentiation factor 9,GDF9）的水平,并统计孤雌激活及体外受精胚胎48和168 h的卵裂率、囊胚率及囊胚总细胞数。结果显示,与对照组相比,10 μg/mL单宁酸组卵丘细胞扩散指数显著提高（P<0.05）,100 μg/mL单宁酸组显著降低（P<0.05）;1和10 μg/mL单宁酸组卵母细胞成熟率差异不显著（P>0.05）,100 μg/mL单宁酸组卵母细胞成熟率显著降低（P<0.05）;1和10 μg/mL单宁酸组GSH和GDF9水平显著提高（P<0.05）,ROS水平显著降低（P<0.05）。孤雌胚胎和体外受精胚胎发育能力结果显示,与对照组相比,各单宁酸组卵裂率差异不显著（P>0.05）,10 μg/mL单宁酸组孤雌胚胎囊胚率及体外受精胚胎囊胚率显著提高（P<0.05）,100 μg/mL单宁酸组孤雌胚胎囊胚细胞数及体外受精胚胎囊胚细胞数均显著低于其他各组（P<0.05）。以上结果表明,10 μg/mL单宁酸可通过提高卵丘细胞扩散能力及GSH和GDF9水平、降低卵母细胞内ROS水平,改善猪卵母细胞成熟质量,提高孤雌胚胎及体外受精胚胎的发育能力。     

长顺绿壳蛋鸡SLC8A1基因多态性及其对蛋壳品质的影响

【目的】探究溶质载体家族8成员A1（solute carrier family 8 member A1，SLC8A1）基因多态性对长顺绿壳蛋鸡蛋壳品质的影响，为今后改善蛋壳品质提供参考。【方法】根据GenBank数据库中鸡SLC8A1基因序列（登录号：NC_052534.1），使用Primer Premier 3.0软件设计引物进行PCR扩增，采用直接测序法筛选SLC8A1基因SNP位点，并利用SPSS 22.0软件检测SNP位点不同基因型蛋壳指标的差异。【结果】在SLC8A1基因外显子11上共发现3个新的SNPs：g.16085681 T>C、g.16085766 C>T和g.16085781 T>C，共存在3种单倍型：H1（TCT）、H2（CTC）、H3（TTC），以及6种双倍型：H1H1（TTCCTT）、H1H2（TCTCTC）、H1H3（TTTCTC）、H2H2（CCTTCC）、H2H3（CTTTCC）、H3H3（TTTTCC）。χ²检验结果显示，3个SNPs位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05），均表现为中度多态。关联性分析结果显示，g.16085681 T>C位点TC基因型个体蛋壳强度显著高于TT基因型（P<0.05），g.16085681 T>C位点和单倍型H2（C_16085681T_16085766C_16085781）对SLC8A1基因mRNA二级结构产生明显的影响；g.16085766 C>T位点CC基因型个体蛋形指数显著高于TT基因型（P<0.05）；双倍型H1H1、H1H3个体蛋形指数显著高于H2H3，H2H3个体蛋壳强度和蛋壳厚度均显著高于H1H3，H1H2、H2H2个体蛋重均显著高于H3H3（P<0.05）。【结论】g.16085681 T>C位点可作为影响蛋壳强度的标记位点，g.16085766 C>T位点可作为影响蛋形指数的标记位点，双倍型H2H3可能是蛋壳强度和蛋壳厚度的有利双倍型。     

乌珠穆沁羊DGAT1、NR6A1、MAN1A1基因多态性与其生长性状的关联分析

试验旨在探究甘油二酯酰基转移酶（diacylglycerol acyltransferase 1,DGAT1）基因g.13504098 C>T位点、核受体辅抑制子1（nuclear receptor subfamily 6 group A member 1,NR6A1）基因g.11204707 A>C位点和α-甘露糖苷酶（alpha-mannosidase,MAN1A1）基因g.18795097 C>T位点的多态性与乌珠穆沁羊生长性状之间的关系,为高产乌珠穆沁羊分子选育提供新的遗传标记。运用Sequenom MassARRAY^®SNP技术对乌珠穆沁羊DGAT1、NR6A1和MAN1A1基因的3个多态位点g.13504098 C>T、g.11204707 A>C和g.18795097 C>T进行检测,同时利用线性混合模型分析基因型与其4、6月龄生长性状的关联性。结果显示,在这3个位点中均检测到3种基因型,具体为：g.13504098 C>T位点的基因型为：CC、CT和TT,优势基因型为CC （0.49）,优势等位基因为C （0.70）;g.11204707 A>C位点的基因型为：AA、CA和CC,优势基因型为AA （0.54）,优势等位基因为A （0.73）;g.18795097 C>T位点的基因型为：CC、TC和TT,优势基因型为TC （0.51）,优势等位基因为C （0.55）。卡方检验显示,g.13504098 C>T、g.11204707 A>C和g.18795097 C>T位点在乌珠穆沁羊群体中均处于哈代-温伯格（Hardy-Weinberg）平衡状态（P>0.05）。群体遗传学分析表明,这3个位点在乌珠穆沁羊种群中属于中度多态性（0.25<PIC<0.50）。关联分析结果显示,g.13504098 C>T位点与乌珠穆沁羊4、6月龄的体重、体高、胸围、管围及6月龄的胸宽均呈极显著相关（P<0.01）;g.11204707 A>C位点与乌珠穆沁羊4、6月龄的体高、体斜长及4月龄的体重、6月龄的胸围均呈极显著相关（P<0.01）,与6月龄的体重、管围均呈显著相关（P<0.05）;g.18795097 C>T位点与乌珠穆沁羊4月龄的体高、6月龄的胸围均呈极显著相关（P<0.01）,与4月龄的体重、胸围以及6月龄的胸宽均呈显著相关（P<0.05）。综上所述,DGAT1基因g.13504098 C>T、NR6A1基因g.11204707 A>C和MAN1A1基因g.18795097 C>T位点多态性与乌珠穆沁羊群体部分生长性状具有显著的关联性,可以作为乌珠穆沁羊遗传选育的候选分子标记。