布鲁氏菌环介导等温扩增（LAMP）可视化检测方法的建立

应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立了布鲁氏菌可视化快速检测方法。针对布鲁氏菌外膜蛋白OMP25基因保守区设计6条特异引物,反应前加入染料羟基萘芬蓝(HNB)作为LAMP扩增的指示剂,63℃恒温反应60min,根据HNB的颜色变化进行结果判定。分别评价所建立LAMP方法的特异性和灵敏性,并对60份牛布鲁氏菌病虎红平板凝集试验(RBT)阳性血清样本,经LAMP和B4/B5-PCR方法进行平行检测。结果显示,本方法最低检出限约为17fg布鲁氏菌基因组DNA。本方法特异性良好,布鲁氏菌反应管均出现特异性LAMP扩增反应,而猪大肠杆菌K99、巴氏杆菌C48-1、猪链球菌ST171、绿脓杆菌等对照组均未出现扩增。针对60份RBT阳性血清的平行检测结果显示,LAMP和B4/B5-PCR这两种方法间的结果符合率为85.0%。B4/B5-PCR检测为阳性的43份样品,经本方法检测全部为阳性;B4/B5-PCR检测为阴性的17份样品,经本方法检测,9份为阳性,8份为阴性。LAMP的敏感性高于B4/B5-PCR方法。实验表明,本文所建立的基于颜色判定的布鲁氏菌LAMP检测方法具有特异、灵敏、设备要求简单等特点,适用于基层兽医部门进行布鲁氏菌的快速检测。     

肺炎克雷伯菌环介导等温扩增技术检测方法的建立

本研究旨在建立一种环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）检测食品中的肺炎克雷伯菌。选取肺炎克雷伯菌特有的毒力基因区域,设计2对引物（1对内引物、1对外引物）,进行体外恒温扩增反应。对反应体系内的甜菜碱、核酸原料（dNTPs）、内外引物比例、Mg²⁺浓度、反应时间和温度进行优化和选择,并进行特异性和灵敏性试验检测。应用建立的LAMP方法对灭菌鸡肉人工污染加标样品进行检测。结果表明,通过优化试验,筛选到最优反应体系和反应条件;应用优化后的LAMP反应体系对包括肺炎克雷伯菌在内的18种常见微生物进行特异性检测试验,特异性良好。肺炎克雷伯菌LAMP反应体系对基因组的最低检测限是0.875 pg/μL,比传统PCR方法灵敏性高100倍。对人工鸡肉阳性样品进行检测,检测限为30 CFU/mL。本试验成功建立了一种能检测食物中致病肺炎克雷伯菌的LAMP检测方法,该方法利用2对引物针对肺炎克雷伯菌目的基因6个区域进行体外恒温核酸阶梯性扩增,灵敏性更高,反应时间更短,检测成本更低。     

环介导等温扩增(LAMP)检测禽脑脊髓炎病毒方法的建立

根据已发表的禽脑脊髓炎病毒的VP2基因序列,设计并合成了6对特异扩增禽脑脊髓炎病毒VP2基因片段的引物,通过条件优化,成功建立了针对禽脑脊髓炎病毒的环介导等温扩增(LAMP)检测法,并测定其特异性和敏感性,对采集的禽临床样品的核酸分别进行了检测.结果表明,该法只检出禽脑脊髓炎病毒.敏感性扩增结果表明,Lamp检测禽脑脊髓炎病毒为100fg的RNA模板.该LAMP方法有简便、快速和特异性高的优点,可用于临床上对禽脑脊髓炎病毒的快速检测.     

环介导等温扩增法(LAMP)在水生动物病害检测中的应用

近年来我国的水产养殖发展迅速,养殖面积和产量都位居世界第一。但是疾病频发一直是困扰水产养殖的一个问题,而病原的快速检测是水产动物疾病防控的前提和关键。随着水产病害基础研究的不断深入,病原的检测技术也得到快速发展。本文介绍了一种新型的核酸扩增技术——环介导等温扩增(l oop-medi at ed i sot hermalampl i f i cat i on,LAMP),综述了近年来LAMP方法在水生动物病害检测领域的具体应用实例和研究进展,并对该方法的应用前景做了展望。     

鸭瘟病毒环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法的建立与应用

为建立一种简便、快速、灵敏、特异的鸭瘟病毒(DPV)检测方法,本研究根据GenBank中登录的DPV基因组序列,设计3对特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,经优化反应体系,建立了LAMP快速检测方法.结果表明,LAMP方法能够在63℃恒温下,1h内实现目的核酸的大量扩增.结果判定时只需要在扩增产物中加入SYBRGreen Ⅰ染料,就可以直接在可见光或紫外光下观察颜色变化.该方法敏感性可达0.245 μg/L,比普通PCR灵敏性高10倍;对鸭病毒性肝炎病毒、H9N2亚型禽流感病毒、鸭副黏病毒、鸭源偏肺病毒等的核酸无交叉反应;利用建立的LAMP检测方法对40份临床样品的阳性检出率为30％.该方法简便快捷,省时省力,是一种适用于基层实验室快速、准确检测DPV的方法.     

新城疫病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

根据GenBank中新城疫病毒(NDV)La Sota毒株保守蛋白F蛋白的编码序列,设计2对环介导等温扩增(LAMP)特异性引物,对甜菜碱浓度、Mg2+浓度、反应温度等LAMP反应体系的最佳反应条件,以及特异性、敏感性等进行研究,建立了一种特异性检测NDV的LAMP方法。结果显示,该方法最低能检测到10个拷贝数的病毒核酸,与其他禽类病毒无交叉反应,且向反应产物中加入SYBR GreenⅠ可直接观察样品是否含有NDV,表明建立的LAMP检测方法具有较强的特异性、较高的敏感性和较好的易操作性,且成本较低,为出入境检验检疫系统进一步搭建NDV快速高通量检测平台奠定基础。     

基于荧光显色的环介导等温扩增技术(LAMP)检测禽呼肠孤病毒

建立了一种基于荧光显色的禽呼肠孤病毒(ARV)环介导等温扩增(LAMP)检测方法.该检测方法使用针对ARV的p10基因8个区域的6条LAMP引物,能够在等温(63℃)条件下1h内完成反应,具有良好的敏感性和特异性,最低能够检出102个拷贝的病毒,敏感性比普通PCR高100倍,而对其他病毒检测结果为阴性.在荧光显色中分别应用SYBR Green Ⅰ和钙黄绿素作为显色剂,其结果与琼脂糖凝胶电泳一致.在对80份临床样本的检测中,使用LAMP和PCR检测出阳性样本的数量分别为68份和55份.因此,基于荧光显色的LAMP方法可以应用于ARV的快速检测,具有在科研机构、基层实验室特别是检测现场推广和应用的潜力.     

猪圆环病毒2型环介导等温扩增(LAMP)检测方法的研究

本研究介绍了一种便捷、灵敏而又特异的环介导逆转录等温扩增(LAMP)基因检测技术,该技术分别使用特异对应于靶序列中2对特殊引物,并在Bst DNA聚合酶的作用下对靶序列进行等温核酸扩增反应.本研究对LAMP反应体系和反应条件的优化,结果表明PCV-2 LAMP在63℃1 h内能够成功的检测猪圆环病毒2型基因;敏感性和特异性试验表明,本研究能够特异的检测PCV-2并且其敏感度可以达到10个拷贝的DNA分子,初步研究LAMP的阳性检出率与PCR的阳性检出率比较结果为94%符合.以上结果证明,LAMP扩增技术是一种检测程序简便、灵敏度和特异性较高的基因检测手段,在猪圆环病毒2型的快速检测方面具有一定的开发潜力.     

鸭疫里默菌环介导等温扩增检测方法的建立

采用对应于鸭疫里默菌16SrRNA基因442~461bp序列的5条特异引物,建立了环介导等温扩增(LAMP)反应体系,加入试剂盒提取的鸭疫里默菌DNA后,置63℃反应60min,通过监测反应液浊度判断结果。在此基础上,用煮沸10min的方法代替试剂盒提取DNA方法,并用显色方法代替浊度检测和琼脂糖凝胶电泳方法判断结果,通过敏感性、特异性、病原消长规律试验验证方法的准确性。另外,对临床采集的135只患病鸭的心血、脑组织、肝脏和心脏共540份样品提取DNA后,用LAMP和PCR进行检测,同时进行细菌分离和鉴定,比较各种方法检测结果的符合率。结果显示,菌液提取DNA后,LAMP和PCR方法最低分别可检测到2和10个CFU的鸭疫里默菌。菌液煮沸代替试剂盒提取DNA方法,使LAMP的敏感性降低5倍。显色法、浊度检测和琼脂糖凝胶电泳方法判断结果的敏感性和特异性相同。细菌分离法共获得201株鸭疫里默菌,且经LAMP与PCR法检测均呈阳性,LAMP与PCR法检出阳性样本总数分别为271和254份,LAMP方法阳性检出率高于PCR方法。建立的鸭疫里默菌LAMP检测方法具有较高的敏感性,进一步用菌液煮沸方法代替DNA提取法虽然使敏感性降低5倍,但节省了DNA提取步骤,再结合显色技术使反应结果直观可见,使其临床应用更加便捷。     

环介导等温扩增技术（LAMP）在肉源性检测中的应用及前景展望

近年来,肉类掺假事件时有发生,给消费者和相关食品安全监督部门造成一定的困扰,同时威胁着消费者的身体健康。传统意义上的检测方法如酶联检测法及PCR法均存在一定的局限性,限制其在市场上进行快速的肉类鉴别。环介导等温扩增(LAMP)是一种新型核酸扩增技术,其灵敏度高、特异性强,不依赖专业仪器设备,操作简单,已开始被广泛应用于食源性微生物的检验。本文从LAMP原理出发,阐述了LAMP技术在肉源性检测中的应用,对LAMP技术的发展前景进行了展望。     

Development of Loop-mediated Isothermal Amplification Assay for Detection of Torque teno sus Virus Type 2

In order to develop a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for rapid and specific detection of Torque teno sus virus type 2 (TTSuV2), two pairs of primers were designed according to the untranslated regions and the part of open reading frame 1 of TTSuV2.The LAMP system was optimized by adjusting the concentrations of some components and reaction conditions.The optimized amplification conditions of LAMP assay was at 64 ℃ for 90 min.The results showed the LAMP assay was specific for TTSuV2 detection, which could achieve a detection limit of 100 copies/μL viral nucleic acid, and no cross-reaction with TTSuV1, PCV2, CSFV, PRRSV and PBoV.In conclusion, this assay was a rapid, specific and sensitive detection technique which could provide a assistance for the rapid detection of TTSuV2.     

猪细环病毒2型环介导等温扩增检测方法的建立

为了能快速、特异的检测猪细环病毒2型(TTSuV2),本研究针对TTSuV2全基因序列的非编码区域和第1个开放性阅读框前端设计了2对引物,建立了TTSuV2的环介导等温扩增(LAMP)检测方法并对反应成分和条件进行了梯度摸索。试验结果显示,该LAMP检测方法最佳反应条件为64 ℃恒温90 min,可特异性检测TTSuV2,与猪细环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪博卡病毒无交叉反应,病毒最低检出限为100拷贝/μL。结果表明,建立的LAMP方法具有快速、特异且灵敏的特点,可在TTSuV2快速检测方面提供一定的技术支持。     

马疱疹病毒1型LAMP检测方法的建立

本试验旨在建立一种检测马疱疹病毒1型（EHV-1）的快速、灵敏、特异的环介导等温扩增技术（LAMP）,同时评价该方法的可靠性。根据马鼻肺炎糖蛋白B（gB）基因特异保守序列设计多对LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪监测反应进程,进行引物筛选和反应条件的优化,建立能特异性扩增EHV-1 DNA的LAMP检测方法,并加入SYBR GreenⅠ通过肉眼判断结果。该方法在65 ℃恒温下作用50 min,使EHV-1 DNA获得了高效率的特异性扩增,与其他马易感病毒如马疱疹病毒4型（EHV-4）等无交叉反应;且具有极高的灵敏性,可检测到10^-4稀释的目标病毒,比普通PCR的灵敏度高10倍;反应结束后加入SYBR GreenⅠ肉眼观察的结果与LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪监测结果一致。通过将4份临床样品的LAMP检测结果与已得到验证的PCR结果进行比对,结果显示符合率为100%。本研究建立的LAMP检测方法具有快速、特异、灵敏、简单易操作且设备要求低等特点,具有实地检测EHV-1的前景。     

Loop-mediated Isothermal Amplification Method and Its Application in Pathogen Detection

As a new molecular biology technique,the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) has the advantages of easy to operate,no need of specialized devices,low cost,short reaction time and so on.It has higher sensitivity and specificity than the common molecular biology techniques.It has been widely used in rapid and early infection by variety of pathogens including bacteria,virus and mycoplasmas.We reviewed the research progress on LAMP techniques and the diagnostic applications in the bacteria,viruses,Mycoplasma and other pathogens at home and abroad,so as to understand the advantages and disadvantages of LAMP and application situation,and provide a reference for its widespread application in the future.     

LAMP方法及其在病原微生物检测中的应用

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一门新兴的分子生物学技术,该技术具有操作简单、不需要大型仪器设备、成本低廉、反应时间短、结果判定简单等优点,且具有比常规分子生物学方法更高的灵敏度和特异性.目前该技术在细菌、病毒及支原体等病原微生物的快速检测和早期诊断中已广泛应用.通过对国内外LAMP研究进展及该技术在细菌、病毒、支原体等致病菌中的诊断应用进行综述,以期介绍该技术的优缺点和应用现状,从而为今后的广泛应用提供参考依据.     

犬瘟热病毒RT-LAMP检测方法的建立及初步应用

环介导等温基因扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种特异、灵敏、快速的检测方法。为提高犬瘟热病毒(CDV)检测效率、降低检测成本,针对犬瘟热病毒N基因保守区的8个位点设计了6条引物进行RT-LAMP一步法扩增。对反应体系及条件优化,检测特异性、敏感性,扩增产物通过凝胶电泳、显色反应和浑浊度比较进行判定。试验结果表明,该方法特异性强、敏感度高,操作简便、快速、便于观察,适用于门诊和现场检测。     

环介导等温扩增技术的改进及其在病原微生物检测中的应用研究进展

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年来发展出来的一种新型核酸扩增技术。自建立以来,该技术不断改进和发展,并广泛应用于病原微生物的检测,文章将就此展开综述。     

快速检测双芽巴贝斯虫LAMP方法的建立

为提高双芽巴贝斯虫(Babesia bigemina)检出率,本研究采用环介导等温扩增技术(LAMP)建立一种快速、灵敏、特异的B.bigemina检测方法。根据GenBank上公布的Babesia bigemina细胞色素b(Cytochrome b,cyt b)基因序列,设计4条特异地识别B.bigemina的cyt b基因6个特殊区域的LAMP引物,优化反应体系和条件,在Bst DNA聚合酶的作用下,65 ℃反应60 min,加入SYBR Green Ⅰ后观察。结果表明,该LAMP检测方法特异性强,与牛巴贝斯虫(Babesia bovis)等DNA不发生交叉反应;敏感性高,对B.bigemina的cyt b基因最小检测值为0.085 fg/μL,是一般PCR方法的1000倍。该方法具有简单、快速、低成本的特点,可用于B.bigemina的基层现场快速检测。     

基于钙黄绿素显色的可视化LAMP检测猪流行性腹泻病毒的研究

针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的NP基因设计1套环介导等温扩增(LAMP)引物,在反应体系中添加钙黄绿素/氯化锰指示剂代替传统的反应后添加SYBR Green Ⅰ染料,建立了基于钙黄绿素的可视化LAMP检测PEDV的方法。该方法能在65 ℃ 1 h内特异性扩增PEDV,与猪瘟病毒(CSFV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)及大肠杆菌等均无交叉反应,检测下限为3.73 pg/μL,其结果可用肉眼判断,快捷方便。用该方法对龙岩学院动物医学研究所接诊的93份腹泻病例进行检测,结果表明,LAMP方法检测PEDV的阳性率为43.01%(40/93),高于普通PCR的检出率(38.7%,36/93)。本试验建立的可视化LAMP检测方法能用于PED诊断。     

Establishment and Application of Loop-mediated Isothermal Amplification for Rapid Detection of Porcine Epidemic Diarrhea Virus

This study was aimed to establish a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for detection of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), and provide a simple, sensitive, accurate and reliable tool for diagnosis of PEDV.The conservative PEDV N gene (GenBank accession number: KT799997) of PEDV was selected as a target to design six specific primers.The reaction system and temperature of LAMP were optimized, and the LAMP method for specific amplification of PEDV was established. Results showed that the PEDV LAMP detection method was established successfully, and it could detect PEDV specifically at 60℃ for 60 min,and the detection limit was 91 copies/μL, which was one hundred-fold higher than conventional RT-PCR method.75 clinical samples were detected by LAMP and PCR, respectively, the coincidence of LAMP and PCR was about 97.3%. All the data suggested that the LAMP assay had strong specificity, high sensitivity, simple operation, low equipment requirement, and was suitable for rapid detection of PEDV clinical samples.