鸡输卵管表达的重组人溶菌酶的鉴定

为了对鸡输卵管特异表达载体表达的重组人溶菌酶(rhLYZ)的理化及生物学特性进行鉴定,用直接结晶法从重组载体注射鸡蛋清中提取溶菌酶,以兔抗hLYZ血清为一抗,HRP-标记的羊抗免IgG为二抗,进行Western blotting检测,结果表明表达在鸡蛋清中的rhLYZ能被hLYZ特异抗体识别;将纯化的rhLYZ和天然hLYZ在不同温度的水浴中孵育30min,用RBB-R染料标记比色法检测溶菌酶活性的变化,结果显示二者的热稳定性无显著差异;将纯化的rhLYZ和天然hLYZ用不同PH的溶液稀释,40C孵育30min后进行酶的活性测定,结果显示两者在pH3.0～11.0范围内具有活性,最强活性pH为7.0;以12种常见细菌为试验对象,用最小抑菌浓度法测定含rhLYZ蛋清和纯化rhLYZ的溶菌活性,结果显示两者对鲫鱼嗜水气单胞菌、变形杆菌、枯草杆菌、无鞭毛伤寒杆菌、白色念珠菌和柠檬色葡萄球菌具有很强的抑制作用,对痢疾杆菌、白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有较强的抑制作用,对有鞭毛伤寒杆菌和鳖嗜水气单胞菌无明显的抑制作用.这些试验结果显示,表达在重组载体注射鸡蛋清中的rhLYZ具有与天然hLYZ十分相似的相对分子质量、热稳定性、pH活性范围和溶菌谱.     

禽腺联病毒序列对鸡输卵管细胞表达人溶菌酶基因的促进作用

将鸡卵清蛋白基因5′-调控区控制的人溶菌酶（hLYZ）cDNA表达盒插入禽AAV末端反向重复序列之间,将CMV启动子控制的rep表达盒插入其下游,获得的表达载体pRep2ITR-OV4-LYZ用聚乙烯亚胺包裹,经翅静脉注射产蛋鸡,待蛋清中rhLYZ表达水平下降至注射前水平时,用pRep2ITR-OV4-LYZ进行3次重复注射,以RBB-R染料标记比色法和Western-blotting检测蛋清中rhLYZ表达,以细菌生长抑制试验检测rhLYZ活性。结果,在相同试验条件下,pRep2ITR-OV4-LYZ表达rhLYZ的水平和时间优于不含禽AAV序列的pOV4-LYZ,rhLYZ表达水平和时间随载体注射次数增加呈上升和延长趋势,rhLYZ的分子质量与天然hLYZ相同,对致乳牛乳腺炎大肠杆菌、葡萄球菌和链球菌具有显著的抑制作用。试验结果提示,禽AAV ITR和rep序列能促进hLYZ基因在鸡输卵管细胞中正确表达。     

重组禽腺联病毒介导的人溶菌酶在蛋清中的表达

为在鸡蛋清中表达人溶菌酶(hLYZ),将含有hLYZ输卵管特异表达盒的重组禽腺联病毒以每只鸡2×10~(11)经翅静脉注射正常产蛋母鸡,收集蛋清对重组蛋白的表达情况进行检测。RT-PCR结果显示,hLYZ只在输卵管部位表达,Western blot结果显示重组蛋白大小正确,抑菌活性表明注射重组病毒后的蛋清的抑菌活性明显优于正常蛋清的。动态表达水平检测结果显示,注射病毒后第1周即可以检测到重组hLYZ的表达,第5周时表达量最高,达68.3μg/mL,表达时间持续3个月之久。以上结果表明,重组禽腺联病毒能介导人溶菌酶在蛋清中的高效、长时表达,为人溶菌酶的开发应用提供了新途径。     

用表达人溶菌酶基因的重组质粒防治干乳期奶牛乳腺炎

将人溶菌酶（human lysozyme，hLYZ）cDNA插入由pcDNA3改造而成的pcDNAK表达载体。用获得的重组载体pcDNAKLYZ转染COS-1细胞，经免疫荧光试验证明能进行正确表达。将重组载体注射于哺乳母鼠，取其乳汁进行溶菌酶活性测定，结果显示，分泌在乳汁中的重组hLYZ高达139mg／L。根据乳汁体细胞检测结果，选择健康奶牛和乳腺炎阳性奶牛，分别在干奶时和产犊前2周2次注射重组质粒pcDNAKLYZ，注射途径为乳腺基部穿刺，注射剂量为300μg／乳区,于产犊后1个月采集奶样进行体细胞检测，结果显示，对前一泌乳期发生的奶牛乳腺炎的治愈率为91．5％，对下一泌乳期奶牛孔腺炎的预防有效率王少为96．97％。由此认为。构建的表达hLYZ基因的重组表达质粒，可以替代抗菌素类油乳剂用于干乳期乳腺炎的防治。     

抗菌肽LL-37的抑菌作用及其稳定性研究

采用微量2倍稀释法测定抗菌肽LL-37对大肠杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC),并进一步研究温度、pH和保存时间对LL-37稳定性的影响。结果显示:LL-37对大肠杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度分别为3.12、1.56和0.78μg/mL。热稳定性试验显示:重组抗菌肽121℃加热21 min、100℃加热3 h仍有较好的活性。酸碱稳定性试验结果显示:LL-37在pH 2.0～12.0时均具有一定的活性,pH 5.0～6.0时活性最好。此外,-20℃为此抗菌肽长期保存的最佳条件。     

透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在大肠杆菌中的高效表达

利用PCR技术将透明颠菌血红蛋白基因（vgb）克隆到融合表达载体pET28a，在大肠杆菌BL21（DE3）表达。重组蛋白在30℃诱导获得可溶表达。利用Ni^2＋亲和层析对重组蛋白进行了纯化，得到重组的透明颠菌血红蛋白，蛋白呈红色。实验现象显示重组蛋白与血红索相结合。紫外光区和可见光区波长扫描分析显示：蛋白粗提物和纯化后的血红蛋白在230nm和413nm都有强吸收峰，初步表明，尽管重组蛋白比天然蛋白多36个氨基酸，重组蛋白仍然具有生理活性。诱导后4h和6h的培养液氨基乙酰丙酸含量分别达到17mg／L和21mg／L。说明重组蛋白的表达明显促进了体内heme合成途径。     

嗜水气单胞菌弹性蛋白酶的纯化及特性分析

为阐明嗜水气单胞菌弹性蛋白酶的性质及其在致病过程中的作用，试验以我国分离的嗜水气单胞菌J-1株为研究对象．纯化了其弹性蛋白酶．并对该酶进行热稳定性、蛋白酶抑制剂抑制作用、金属离子影响和致病性等特性分析。结果表明．嗜水气单胞菌J-1株的培养上清经35％～60％硫酸铵沉淀、阴离子交换层析和凝胶过滤层析，可获得纯化的弹性蛋白酶．SDS-PAGE显示单条带．相对分子质量约38000。该酶对热稳定，EDTA可抑制其活性，PMSF对其无影响，金属离子铜、锌、钴等抑制其活性。说明此酶属于热稳定金属蛋白酶。腹腔注射纯化的弹性蛋白酶能致死小鼠．其对小鼠的LD50为6．4μg（0．2mL）．表明该酶是一种直接致病因子。     

光敏生物素标记IgG检测羊接触传染性脓疱性皮炎病毒囊膜蛋白及重组表达蛋白

用光敏生物素标记从兔抗羊接触传染性脓疱性皮炎病毒超免疫血清中提取纯化的IgG，把从蔗糖密度梯度离心纯化的病毒用2-ME和NP40裂解后与重组转化菌pGRL-4A和pGRH-3Ag一起进行SDS-PAGE，并进行转移电泳。对用光敏生物素标记的IgG进行Western-blotting印迹杂交检测。结果，检测到产生IgG的病毒囊膜蛋白有5条，分子量分别为125．0、96．0、83．0、56．3和42．0ku；检测到重组菌pGRL-4A和pGRH-3A可表达分泌其中的3条囊膜蛋白，其分子量分别为83．0、56．3和42．0ku；pGRL-4A的表达较强，对42．0ku蛋白的分泌量最高。所重组的病毒DNA Hind Ⅲ／A 片段中含有该病毒囊膜蛋白抗原基因。     

重组鸡β-防御素1O蛋白的原核表达及其抗菌活性的测定

鸡抗菌肽属β-防御素类，在鸡的先天性免疫中发挥重要作用。本研究将克隆得到的鸡β-防御素-10基因（AvBD10）亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中构建了重组表达质粒pGEX-AvBD10。将重组质粒转化至BL21，于37℃用IPTG诱导培养不同时间，SDS-PAGE电泳与灰度扫描显示该重组蛋白表达量占菌体总蛋白的34．3％。表达的AvBD10融合蛋白以包涵体的形式存在，分子量约为31ku。重组蛋白经纯化后，以对数生长中期的大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌和猪霍乱沙门氏菌为检测菌，利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定了重组鸡AvBD10蛋白的抗菌活性。结果显示，重组鸡AvBD10蛋白对大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌有抗菌活性。此外，重组鸡AvBD10蛋白在-70℃～100℃及在pH4-pH10条件下仍具有抗茵活性。     

乳制品中具有降胆固醇功能乳酸菌的体外筛选

用改良的o-phthalaldehyde法对pH3．0和0．3％牛胆酸钠有一定耐受性的10株乳酸菌的体外降胆固醇活性进行了测定。这些菌在含0．3％胆盐的培养基中，37℃厌氧培养24h后，均表现出较强的降胆固醇活性。胆固醇脱除率从30．4％～43．6％不等。其中鸟肠球菌WZ38—2对胆固醇的脱除率最高；其次为植物乳杆菌WHl3—1和WH23—1。     

人溶菌酶cDNA的克隆及其在小鼠体内的表达

根据已发表的人溶菌酶 (human lysozyme,h L YZ) m RNA序列设计引物 ,以人乳腺第 1链 c DNA为模板 ,用 PCR扩增出 1.5 kb h L YZ双链 c DNA,其推导的氨基酸序列与国外发表的从胎盘、巨噬细胞和结肠中克隆的 h L YZ氨基酸序列同源性为 10 0 % ,与从人组织细胞中克隆的 h L YZ仅有 1个氨基酸差异 ,但与从中国人胎盘中克隆的 h L YZ具有6个氨基酸差异。将此 c DNA克隆入乳腺特异表达载体 ,用所获得的基因构件注射哺乳期小鼠 ,经 RT- PCR和微球菌溶解试验证明 ,上述基因构件能有效地驱动目的基因在小鼠乳腺中表达 ,表达量为 6 9.3mg/ L,表达具有较好的组织特异性。这些试验结果表明 ,本研究构建的表达 h L YZ c DNA的基因构件可以用于乳腺生物反应器的研制。     

白酒糟酵母培养物对产蛋鸡生产性能、免疫机能和肠黏膜结构的影响

本试验旨在探讨饲粮中添加白酒糟酵母培养物对产蛋鸡生产性能、免疫机能及肠黏膜结构的影响。选取324只27周龄、产蛋率和体重相近的健康海兰褐蛋鸡,随机分成3个组,每组6个重复,每个重复18只鸡。3组产蛋鸡分别饲喂添加0(对照)、1%和2%白酒糟酵母培养物的玉米-豆粕型饲粮,试验分为预试期1周和正试期8周。结果表明:1)各时间段内各组间产蛋率差异不显著(P0.05),但1%白酒糟酵母培养物组产蛋率在1~4周、5~8周和1~8周比对照组分别提高了1.79%、2.07%和1.93%;1%白酒糟酵母培养物组5~8周和1~8周的平均日采食量有高于对照组的趋势(P0.10)。2)在第4周末,2%白酒糟酵母培养物组血清球蛋白含量较对照组和1%白酒糟酵母培养物组分别提高了19.0%(P0.10)和27.2%(P0.05),1%和2%白酒糟酵母培养物组血清磷含量均显著高于对照组(P0.05)。3)在第4周末,与对照组和1%白酒糟酵母培养物组相比,2%白酒糟酵母培养物组血清免疫球蛋白G和免疫球蛋白M含量均显著提高(P0.05);在第8周末,与对照组相比,2%白酒糟酵母培养物组血清免疫球蛋白A和免疫球蛋白M含量显著提高(P0.05),1%白酒糟酵母培养物组血清溶菌酶活性显著提高(P0.05)。4)与对照组和2%白酒糟酵母培养物组相比,饲粮中添加1%白酒糟酵母培养物显著提高了产蛋鸡空肠绒毛高度和隐窝深度(P0.05),有提高绒毛高度/隐窝深度的趋势(P0.10)。综上可知,产蛋鸡饲粮中添加适量(1%~2%)白酒糟酵母培养物可增强免疫机能,改善肠黏膜结构。     

输卵管特异表达人溶菌酶基因重组禽腺联病毒的构建及鉴定

试验旨在利用杆状病毒表达系统制备输卵管特异表达人溶菌酶（hLYZ）的重组禽腺联病毒（recombinant avian adeno-associated virus,rAAAV）。参照已发表的hLYZ基因序列设计1对引物,PCR扩增hLYZ基因片段,亚克隆至含输卵管特异表达盒和禽腺联病毒（AAAV）两侧末端反向重复序列（inverted terminal repeat,ITR）的转移载体中,获得重组杆状病毒转移载体pFB-AIOVLYZ,将其转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒rBacmid-AIOVLYZ,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBac-AIOVLYZ。将其与表达AAAV结构蛋白的重组杆状病毒rBac-VP及表达AAAV功能蛋白的重组杆状病毒rBac-Rep以感染复数（multiplicity of infection,MOI）为5感染Sf9昆虫细胞,72 h后收集细胞沉淀,并经滤膜过滤、氯仿抽提和PEG沉淀,即为rAAAV-OVLYZ。电镜结果显示,病毒粒子大小约为20 nm,形态结构与野生AAAV相似;PCR结果显示rAAAV含有目的基因;体外细胞表达试验说明rAAAV能介导hLYZ在输卵管细胞中的特异表达。结果表明,本研究利用杆状表达系统成功制备了输卵管特异表达hLYZ基因的rAAAV,为hLYZ的大量制备奠定了基础。     

Construction and Identification of Recombinant Avian Adeno-associated Virus Oviduct-specific Expressing Human Lysozyme Gene

In order to produce recombinant avian adeno-associated virus (rAAAV) oviduct-specific expressing human lysozyme (hLYZ) by the baculovirus expression system, one pair of primers was designed according to the published sequences for hLYZ, the hLYZ gene was amplified by PCR and cloned into baculovirus expression vector, which contained the oviduct-specific expression cassette and the inverted terminal repeats of avian adeno-associated virus (AAAV), the resulted plasmid was named as pFB-AIOVLYZ.Then the recombinant vector pFB-AIOVLYZ was transformed into E.coli DH10Bac, and the positive recombinant bacmid rBacmid-AIOVLYZ was screened according to the resistant and the blue-white plague screening,rBacmid-AIOVLYZ was transfected into the Sf9 insect cells by liposome. Once the cytopathic effect was found, the rBac-AIOVLYZ could be harvested.Sf9 insect cells cultured in suspension culture were infected with three recombinant baculoviruses, rBac-AIOVLYZ, rBac-VP and rBac-Rep, at an MOI of 5. 72 h later, Sf9 insect cells were collected, and recombinant viral particles rAAAV-OVLYZ were purified by filtration, chloroform extraction and PEG precipitation. Electron microscopy showed a typical morphologic feature of Parvoviridae family with virus particle size of about 20 nm. PCR results indicated that the target gene existed in the viral genome. The in vitro cell expression test showed that rAAAV could mediate the specific expression of hLYZ in oviduct cells. These results indicated that the rAAAV oviduct-specific expressing hLYZ was successfully prepared by baculovirus expression system, which laid the foundation for the preparation of hLYZ.     

Chicken egg antibodies for prophylaxis and therapy of infectious intestinal diseases. III. In vivo tenacity test in piglets with artificial jejunal fistula

Large quantities of specific egg antibodies can be produced with little effort by immunization of laying hens. Several antibody containing egg preparations were subjected to a tenacity test against digestive activity taking piglets with artificial jejunum fistulas as a model. Even with high doses of orally administered yolk lyophilisate no antibody activity could be found in the distal jejunum. The additional feeding of egg white, however, showed a significant protective effect on the yolks antibodies during the digestive act. No difference between egg white of immunized hens and egg white of unimmunized hens could be detected. Buffering the acidic gastric environment with sodium bicarbonate increased the antibody activity in the intestine by an average of 40%. Eggs administered in hot (70 degrees C) beef stock had higher antibody titers than eggs that were boiled for 4 minutes. Tenacity in antibodies fed in pellets was significantly lower than in powdered feed.     

虫草粉联合酵母硒对蛋鸡产蛋高峰中期产蛋性能、蛋品质、抗氧化性和免疫功能的影响

为了研究虫草粉（古尼虫草地顶孢霉培养物）联合酵母硒对蛋鸡产蛋性能、蛋品质、抗氧化功能和免疫功能的影响,试验选用450羽24周龄海兰褐壳蛋鸡,随机分为5组,每组6个重复,每个重复15羽。对照组饲喂基础饲粮,试验Ⅰ~Ⅳ组饲喂添加0.1 mg/kg酵母硒联合不同剂量虫草粉（0、0.2%、0.3%和0.4%）的基础饲粮,试验期27周;选取产蛋高峰中期（第40周龄）蛋鸡进行产蛋性能、鸡蛋品质、免疫功能和抗氧化功能分析。结果显示,与对照组相比,产蛋高峰中期试验Ⅲ组蛋鸡的产蛋率、平均蛋重均显著提高,料蛋比显著降低（P<0.05）;鸡蛋哈夫单位、蛋壳颜色、蛋壳强度、蛋黄颜色、蛋清粗蛋白质含量、蛋黄粗蛋白质和粗脂肪含量均显著升高（P<0.05）,蛋清中必需氨基酸Leu、Lys、Met、Trp、Phe、Thr、Val和His及非必需氨基酸Ala、Asp、Glu、Pro和Tyr水平也显著增加（P<0.05）;试验Ⅳ组蛋鸡的蛋壳颜色、蛋壳强度、哈夫单位和蛋清粗蛋白质含量均显著提高（P<0.05）,蛋清中必需氨基酸Ile、Gly、Arg和非必需氨基酸Cys、Ser水平均显著增加（P<0.05）;试验Ⅰ~Ⅳ组蛋鸡蛋黄、蛋清中硒含量均显著增加（P<0.05）。同时,与对照组相比,产蛋高峰中期试验Ⅲ组蛋鸡血清MDA含量显著下降（P<0.05）,WBC数量、血清IFN-γ和IL-2水平及T-AOC和T-SOD活性均显著升高（P<0.05）。结果表明,饲粮中联合添加酵母硒和适量的虫草粉能明显提高产蛋高峰中期蛋鸡的产蛋性能和鸡蛋品质,增强机体免疫力和抗氧化能力,以0.1 mg/kg酵母硒联合添加0.3%虫草粉的效果最佳。     

洪江雪峰乌骨鸡和罗曼粉蛋鸡鸡蛋营养成分和蛋品质比较

试验旨在比较洪江雪峰乌骨鸡和罗曼粉蛋鸡的鸡蛋营养成分和蛋品质,为洪江雪峰乌骨鸡蛋用新品系选育提供依据。随机选取40周龄的洪江雪峰乌骨鸡(绿壳)、洪江雪峰乌骨鸡(粉壳)和罗曼粉壳蛋鸡各100只,每品种鸡随机分为5个重复,每个重复20只,在相同饲粮和饲养管理方式下进行饲养,45周龄收集鸡蛋检测营养成分和蛋品质指标。结果表明:洪江雪峰乌骨鸡绿壳蛋的蛋黄比例极显著高于罗曼粉壳蛋(P<0.01),蛋重、蛋壳厚度、哈氏单位极显著低于罗曼粉壳蛋(P<0.01),洪江雪峰乌骨鸡粉壳蛋的蛋重和蛋壳厚度极显著低于罗曼粉壳蛋(P<0.01);洪江雪峰乌骨鸡蛋中的多不饱和脂肪酸和硒元素含量均极显著高于罗曼粉壳蛋(P<0.01),洪江雪峰乌骨鸡绿壳蛋胶原蛋白含量极显著高于罗曼粉壳蛋(P<0.01)。综上所述,洪江雪峰乌骨鸡鸡蛋蛋黄比例高,蛋黄多不饱和脂肪酸、胶原蛋白、硒和锰含量高,适合作为优质禽蛋开发。     

肠炎沙门氏菌污染饲料对鸡蛋安全的影响

本研究选用160只60周龄白来航蛋鸡,随机分为4组,分别一次性采食30g添加了0、4.7×102、4.7×105、4.7×108cfu肠炎沙门氏菌(SE)的饲料,然后用特异性PCR法对试验鸡所产鸡蛋的不同部位进行SE检测,并观察记录生产性能。结果显示,对照组鸡蛋各部位均为阴性,试验组的蛋壳、壳膜、蛋黄、蛋白均能检测到SE,且随染菌量的增大,检出率增高。当摄入108cfu的SE时,会降低产蛋率,但对鸡蛋的表观性状没有显著影响,成为危害人类健康的潜在隐患。