植物青枯菌致病因子研究

植物青枯菌致病因子研究中国农业科学院植保所康耀卫，毛国璋植物细菌性青枯病（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ），简称青枯病，是一种世界性分布的重大病害。青枯菌可以为害多种植物，据最近报道其可侵染４４个科数百种植物，比５０年代初记载的３３个...     

植物青枯菌的血清分型研究

以代表不同生化型的４个青枯假单胞菌的膜蛋白为免疫原制备了４个相应的抗血清，对我国植物青枯菌的血清分型进行了研究。琼脂双扩散试验结果表明：秋自我国６个省的１９种寄主植物的２１２个青枯菌株可分为８个血清型，其中血清型Ⅰ为优势类群，包括了主要茄科植物等１３种寄主的１４７个菌株，占全部供试菌株６９％。     

山东省植物青枯菌的生化型研究

近几年从山东省27个县市，7种植物青枯病病株上分离纯化203个菌株，从中选出代表菌株，根据Hayward划分青枯病的标准，进行晨娄划型。研究结果表明，山东省植物三病菌以生化型Ⅲ为主，约占61.9%，其次为生化型Ⅱ和Ⅴ，其中还存在其它生化型。（1）24株能利用3种双糖和甘露醇及山梨醇而不能利用甜醇的马铃薯青枯菌株，暂定为生化型Ⅲ的亚型Ⅲ－1。     

植物青枯菌相关基因的克隆及致病力测定分析

以PM2644为受菌体，通过基因功能互补的方法，将从野生青枯菌基因文库中筛选得到的克隆进一步克隆得到克隆pLTK15。胞外酶活性测定结果表明，pLTK15与突变株PM2644接合产生的接合子能完全恢复突变株PM2644聚半乳糖醛酸酶的活性，接合子上清液SDS－PAGE电泳结果表明，接合子只能互补PM2644缺失的62．5kDa的一种胞外蛋白，经致病力测定，pLTDK15能使突变株PM2644的致病力得到部分恢复。结果表明，聚半乳糖醛酸酶和62．5kDa的胞外蛋白在青枯菌的致病过程中起着一定的作用。     

细菌的群体感应及其信号分子

主要阐述细菌群体感应的类型、信号分子作用以及应用前景。     

纳米金对碳点荧光猝灭的研究

实验发现纳米金(AuNPs)能有效地猝灭碳点(CDs)的荧光.考察了CDs质量浓度、pH值、反应温度和时间等多种因素对荧光猝灭的影响,在最佳实验条件下猝灭常数为9.1×108 L/mol.此外,加入猝灭剂AuNPs前后CDs的荧光寿命基本不变;且随温度升高,猝灭常数减小.因此,推测AuNPs对CDs的荧光猝灭为静态猝灭.     

植物青枯菌LAMP检测方法的建立

【目的】由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum,简称青枯菌）引起的青枯病（bacterial wilt of plants）是世界范围内危害最为严重的土传细菌病害之一,严重制约了多种经济作物的生产。建立高效、精准的早期诊断技术,是实现青枯病有效防控的基础。论文旨在建立一种能够特异检测青枯菌的环介导等温扩增方法（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）,实现青枯菌的田间快速检测。【方法】通过比对分析青枯菌的lpxC基因序列,并利用在线引物设计软件Primer Explorer Version 4.0得到4条LAMP特异性引物,F3（5′- CCTGTACGTGGTCGGCTAT-3′）、B3（5′-ACCGCAACACGGGATCA-3′）、FIP（5′-TACGCCGTTTCATCGGCCAGGTACACGGCGCACAAGT -3′）、BIP（5′-ATCGTCACGTTCGACAAGGTGGAATGCCGGCTGCAACTG-3′）。通过单因素变化试验对LAMP反应体系中的各参数进行优化,设置反应温度为60、61、62、63、64、65℃,设置镁离子浓度为2、4、6、8、10、12 mmol·L^-1,设置内外引物浓度比为2﹕1、4﹕1、6﹕1、8﹕1、10﹕1、12﹕1,确定最优反应体系。以分离自不同寄主的24个青枯菌株为参试对象,5个非青枯菌株（Ralstonia mannitolilytica、Ralstonia pickettii、Enterobacter sp.、Acidovorax citrulli、Burkhoderia cepacia）为对照,验证LAMP检测方法的特异性。将青枯菌GMI1000菌株的基因组DNA进行10倍梯度系列稀释,以原液和10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷倍的稀释液为模板同步进行LAMP和普通PCR检测,比较两者的检测灵敏度。将马铃薯青枯病菌株Po41、姜青枯病菌株Z-Aq-1分别与马铃薯块茎和生姜根茎组织悬浮液混合,以LAMP检测方法对混合物进行检测,并以同样方法对表现典型萎蔫症状的人工接种番茄植株和健康植株以及田间马铃薯罹病块茎样品进行检测。反应结果直接通过观察产生的白色焦磷酸镁沉淀情况进行判定,或通过加入1 μL SYBR GreenⅠ荧光染料进行观察,阳性样品为绿色,阴性样品为橙色。【结果】建立了特异性检测青枯菌的LAMP方法,优化后确立了检测体系中FIP/BIP与F3/B3的浓度比为8﹕1（1.6﹕0.2 μmol·L^-1）,镁离子浓度为6 mmol·L^-1,反应温度为63℃。特异性检测结果显示,仅参试青枯菌反应管中的反应液呈现绿色,表明建立的检测体系具有高度特异性。以青枯菌GMI1000菌株的DNA原液及不同梯度的稀释液为模板进行的LAMP和普通PCR检测结果显示,LAMP的检测灵敏度为1.42 pg,比普通PCR高10倍。能够快速准确地从植物组织悬浮液、罹病番茄植物组织及田间罹病样品中检测到青枯菌。【结论】建立的青枯菌LAMP检测方法,高效特异,操作简单,无需复杂仪器,肉眼可直接观察检测结果,适合基层和现场检测。     

植物青枯菌遗传多样性及致病基因组学研究进展

植物细菌性青枯病是由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum Yabuuchi et al.）引起的一种世界性重大病害。作为复合种,青枯菌在与寄主长期协同进化过程中,表现出广泛的生态和寄主适应性。Fengan和Prior提出青枯菌演化型分类框架,用以描述青枯菌种以下的遗传多样性。青枯菌种内表型特征差异的本质是其基因组较其它植物病原细菌更为复杂和更具可塑性。笔者对近期青枯菌遗传多样性和致病基因组学方面的研究进展进行了归纳和讨论。     

植物病原黄单胞菌DSF信号依赖的群体感应机制及调控网络

群体感应是微生物之间相互交流的一种重要联络方式,它协助细菌能感应群体密度从而调节基因表达。20世纪80年代以来,多种群体感应信号及其传导机制得以阐明。DSF（diffusible signal factor）是近年来在野油菜黄单胞菌中首先鉴定的1个新型群体感应信号,化学结构为顺式11?甲基?2?十二碳烯酸,其信号传导途径包括RpfC/RpfG双组分感应系统、二级信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）、全局性转录因子Clp等。在野油菜黄单胞菌中,DSF群体感应信号调控3类生物学功能：一是促进致病相关基因的表达;二是抑制生物膜形成;三是促进黄单胞菌作出代谢调整,适应高群体密度环境。RpfF是DSF信号生物合成过程中的关键酶,黄单胞菌在高群体密度条件下通过一种新型自我诱导机制大量合成DSF。DSF信号不仅存在于所有黄单胞菌属细菌中,也广泛存在于苛养木杆菌、嗜麦芽寡养单胞菌、伯克氏菌、铜绿假单胞菌和许多海洋细菌中,其传导途径和生物学功能还有待进一步阐明。     

尼古丁猝灭牛血清蛋白荧光机制的研究

研究了尼古丁对牛血清蛋白荧光光谱变化,以及牛血清蛋白荧光猝灭机制,同时利用同步荧光研究了尼古丁对酪氨酸和色氨酸的影响,结果表明:尼古丁猝灭牛血清蛋白荧光是通过静态机制,形成常数为KA=2.1×107 L.mol-1,每一个牛血清蛋白分子结合尼古丁的位点数为0.22,牛血清蛋白与尼古丁的这种结合是很弱的,没有影响分子的构象,酪氨酸残基荧光没有变化,只是色氨酸荧光强度降低,荧光峰位置不变。     

青枯菌铜抗性基因copA 的功能

【目的】 植物细菌性青枯病（bacterial wilt of plants）是由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum ）引起的一种世界性重大土传病害。作为防治青枯病等细菌性病害的重要杀菌剂,铜制剂的广泛使用造成多种植物病原细菌群体中出现了铜抗性菌株。青枯菌Po82菌株大质粒上携带了丁香假单胞菌中的铜抗性编码基因copA 的同源物,论文旨在探明青枯菌Po82菌株copA 在铜抗性、致病性等方面的生物学功能。【方法】 以青枯菌Po82菌株为研究对象,利用MEGA6.0软件包,基于邻接法构建copA 的系统发育树,探究铜抗性基因copA 在青枯菌和其他植物病原细菌中的系统进化关系。通过反向遗传学的研究手段,采用基因同源重组双交换和电击转化法,构建copA 基因缺失菌株及相应互补菌株。通过最小抑制浓度（minimal inhibition concentration,MIC）测定、RT-qPCR、Biolog代谢芯片以及致病力等基础生物学测定研究手段,解析copA 与青枯菌铜胁迫应答、代谢活性、致病性和运动性等表型生物学特征之间的关系。【结果】 同源性比对分析结果显示,copA 广泛存在于青枯菌群体中,青枯菌copA 在亲缘关系上与耐金属贪铜菌最为紧密, 与稻黄单胞菌、丁香假单胞菌和大肠杆菌的亲缘关系较远。RT-qPCR结果显示copA 的表达受到铜离子的诱导,copA 的表达量随着CuSO₄浓度的增加而增加。CuSO₄浓度为1.0 mmol·L ^-1时,基因表达量最高。铜MIC测定结果显示copA 基因缺失菌株对铜离子的敏感性增加,copA 基因缺失菌株的MIC值为0.8 mmol·L ^-1,较野生型菌株的1.2 mmol·L ^-1下降了33.3%,互补菌株恢复了铜抗性能力,表明copA 在青枯菌的铜胁迫应答过程中发挥着重要作用。与野生型菌株相比,copA 基因缺失菌株在普通NA培养基及含0.6 mmol·L ^-1 CuSO₄的NA培养基中的对数生长期的生长速率降低,表明copA 与青枯菌的生长速率相关。copA 基因缺失菌株于发病前期病情指数较野生型菌株下降,接种第10天,copA 基因缺失菌株的病情指数较Po82野生型菌株下降了11.7%。copA 的缺失导致青枯菌对α -D-葡萄糖和D-海藻糖等碳源,L-丙氨酸和葡萄糖醛酰胺等氮源的代谢利用速率降低,使青枯病发病病程延长。与野生型菌株Po82相比,copA 基因缺失菌株中III型分泌系统的转录激活因子编码基因hrpG 和hrpB ,III型效应子RipX编码基因ripX 的表达量显著下调。 【结论】 铜抗性基因copA 在青枯菌铜胁迫应答、致病性等方面发挥一定的作用,研究结果可为进一步解析青枯菌的铜抗性分子机制以及铜抗性菌株的防治提供理论依据。     

受青枯菌诱导表达的马铃薯转录因子类StWRKY8的克隆与表达分析

【目的】从接种青枯菌（Ralstonia solanacearum）的马铃薯中薯3号（Solanum tuberosum）中克隆类StWRKY8部分序列,分析其序列结构特征,研究该基因在感、抗病基因型马铃薯中受诱导的差异表达模式及其不同的组织表达定位。【方法】分别培养抗病基因型马铃薯ED13、感病基因型中薯3号至9-10叶期,以伤根浸菌法接种青枯菌菌株PO41。提取叶片总RNA,反转录为cDNA,使用PCR筛选cDNA差减试剂盒构建消减文库,筛选出384个阳性克隆作为原始SMART cDNA文库,采用5'-RACE法根据SMART-RACE cDNA扩增试剂盒说明克隆全长类StWRKY8。并分别应用生物信息学软件BioEdit、BLAST、MEGA 5.0分析类StWRKY8的基因序列、序列相似性比对以及建立系统进化树。利用ProtParam、ProtScale、SWISS-MODEL、NetPhos2.0 Server、WOLF PSORT、TargetP1.1 Server等在线服务器预测类StWRKY8的理化特性、三级结构、磷酸化位点以及亚细胞定位。提取马铃薯ED13、中薯3号接种青枯菌后的叶片总RNA,采样时间点分别为处理后6 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d和6 d,运用反转录PCR和荧光定量PCR检测类StWRKY8的表达情况。以类StWRKY特异PCR产物制备地高辛标记探针,取材料茎、叶组织制作石蜡切片,并与标记探针进行原位杂交,定位其组织表达。【结果】获得了类StWRKY8 cDNA部分序列,长563 bp,包括一个完整开放阅读框258 bp,编码85个氨基酸。类StWRKY8属于第二类WRKY,锌指结构类型为C₂H₂,具有一个典型的WRKY保守结构域。其氨基酸序列与茄科（Solanaceae）其他成员具有高度同源性,与马铃薯转录因子StWRKY8相似性高达98%。预测类StWRKY8等电点约为9.1,半衰期大于5.5 h,为水溶性蛋白,其三维结构为非球状分子,含有3个磷酸化位点,亚细胞定位于细胞内。类StWRKY8受青枯菌诱导后表达上调,且在感、抗病基因型马铃薯中表达有差异。类StWRKY8在感病基因型马铃薯接种青枯菌6 h内表达量较低,而在抗病基因型马铃薯接种青枯菌6 h内高强度表达。该基因主要在茎叶维管束系统的韧皮部表达,具有组织特异性。【结论】类StWRKY8具有转录因子的一般结构特征,受青枯菌等病菌的诱导表达,同时受寄主植物固有抗性的影响,在感、抗病基因型中表达模式不同。推测其在植物防御反应中发挥作用并参与机体调控。     

青枯雷尔氏菌胞外多糖研究进展

从胞外多糖合成基因、代谢调控及生物学功能等方面,综述青枯雷尔氏菌的胞外多糖研究进展。     

我国植物青枯菌遗传多样性研究进展

综述了我国植物青枯病的发生情况、新出现的青枯菌寄主、青枯菌的分类体系、植物青枯菌遗传多样性以及植物青枯病防治等方面的研究进展。     

青枯菌M5菌株特异基因组消减文库的构建

为筛选青枯菌M5菌株特有的序列,利用SSH技术对青枯菌生理小种5号菌株M5（tester）和生理小种1号菌株GMI1000（driver）基因组进行了比较。分别提取二者基因组DNA,RsaⅠ酶切,将酶切后M5菌株DNA分为两份,分别与接头1和接头2R连接,然后进行两轮杂交和两轮PCR扩增,并检测连接效率与消减效率。将获得的消减PCR产物,即差异基因/差异DNA片段,与pGEM-T载体连接,转化E.coli DH5α感受态细胞,建立消减文库。随机挑取96个白色克隆,经菌液PCR法测定,80个为预期阳性,含有预期的插入片段。首次构建了青枯菌M5菌株特异基因的抑制消减文库,为进一步筛选、克隆青枯菌M5菌株特异核苷酸片段奠定了基础。     

桑青枯雷尔氏菌MR111的腺苷酸激酶adk基因的克隆和序列分析

腺苷酸激酶是广泛存在的一种重要的核苷酸激酶.进行PCR扩增和克隆测序获得桑青枯雷尔氏菌MR111的腺苷酸激酶adk基因长502 bp的序列,NCBI在线BLAST分析其与大肠杆菌、流感嗜血杆菌同源基因的相似性在80％以上,序列编码蛋白有腺苷酸激酶保守的AMP结合结构域和LID结构域,为长型腺苷酸激酶.聚类分析结果表明,该基因与其他细菌的同源基因聚合在同一分支.     

桑青枯雷尔氏菌gsp C和gsp M基因的获取与序列分析

II型分泌系统广泛存在于革兰氏阴性细菌中,转膜蛋白基因簇是其分泌途径的中心。利用PCR扩增和测序,获得了桑青枯雷尔氏菌MR111的gsp C基因707 bp和gsp M基因575 bp的序列,SMART软件预测gsp C基因编码的7~29位氨基酸为跨膜结构域,羧基末端无PDZ结构,gsp M的胞质结构域有2个α螺旋和4个β折叠。使用gsp C和gsp M的保守序列组成的联合矩阵构建系统发育树,结果表明,桑青枯雷尔氏菌MR111与罗尔斯顿氏菌和雷尔氏菌属优先聚合在同一分支,伯克氏菌和伯克霍尔氏菌位于较远分支。     

茄科作物青枯病原菌的脂肪酸鉴定

 【研究目的】采用脂肪酸鉴定技术对茄科作物青枯病原菌进行鉴定,以期为青枯病的预防与防治提供技术支持。【方法】采用选择性培养技术对茄子、番茄和辣椒病株进行青枯病原菌的分离和纯化,而后对青枯病原菌进行脂肪酸鉴定。【结果】经选择性培养分离得到的36株青枯病原菌中,有33株鉴定为典型的青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）,占91.67%;茄子、番茄和辣椒上的青枯病原菌被鉴定为青枯雷尔氏菌的比例分别为100%、90%和89.47%。【结论】脂肪酸鉴定技术具有快速性、准确性,并可通过计算机的运用使分类达到数据化、自动化,可在茄科作物青枯病的检测中得到广泛的应用。