犬降钙素原蛋白多克隆抗体制备及应用分析

试验旨在获得高纯度犬降钙素原（procalcitonin,PCT）重组蛋白,并对该蛋白的临床应用进行分析。采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,将PCT基因克隆至原核表达载体pET-30a（+）中,经双酶切和测序鉴定阳性的重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,以终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达,采用镍柱进行重组蛋白的纯化,纯化蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting检测重组蛋白与犬PCT多克隆抗体的特异性,采用ELISA法检测健康犬和炎症犬血清PCT。双酶切及测序结果显示,犬PCT基因成功插入pET-30a（+）,未出现碱基突变;SDS-PAGE结果显示,重组蛋白以可溶性形式表达,分子质量为14.9 ku,间接ELISA法测定的免疫小鼠血清抗体效价达1：51 200。Western blotting结果表明,制备的多抗血清具有很好的特异性;ELISA结果显示,炎症犬血清内检测到PCT,且其浓度与炎症反应程度呈正相关。结果表明,本研究成功制备了犬PCT蛋白多克隆抗体,且犬血清PCT蛋白是一种潜在的新型严重细菌性炎症感染指示物。     

布鲁氏菌分泌蛋白BspI生物信息学分析及多克隆抗体制备

【目的】试验旨在对布鲁氏菌分泌蛋白BspI进行生物信息学分析,构建原核表达载体,获得BspI蛋白并制备其多克隆抗体,为后续研究该蛋白的生物学功能提供材料。【方法】使用在线软件对BspI蛋白的氨基酸序列进行生物信息学分析,参照布鲁氏菌16M株BspI基因序列(GenBank登录号:DK63_1233)设计引物,PCR扩增目的基因后连接至pMD19-T克隆载体并筛选阳性克隆,将目的基因连接到pET-28a表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,加入IPTG诱导蛋白表达,并进行SDS-PAGE分析,用镍柱亲和层析方法纯化蛋白,纯化后的蛋白与弗氏佐剂混合免疫试验兔,采血分离血清,通过Western blotting、间接ELISA法进行多克隆抗体特异性及抗体效价分析。【结果】BspI蛋白为不稳定亲水性蛋白,存在跨膜结构,无信号肽区域,有13个磷酸化位点和7个抗原决定簇,二级结构主要由α-螺旋、延伸链和无规则卷曲组成。PCR成功扩增出675 bp的BspI基因,成功构建了pET-28a-BspI表达载体。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,成功表达出25.3 ku的蛋白,纯化后无明显杂带,制备的多克隆抗体能够特异性地与BspI蛋白结合。间接ELISA结果显示,BspI蛋白多克隆抗体效价为1∶409 600。【结论】制备的兔源BspI蛋白多克隆抗体可以特异性识别BspI蛋白,该蛋白具有较好的反应原性。试验结果为进一步研究BspI蛋白在布鲁氏菌的胞内寄生中发挥的作用提供了参考。     

犬冠状病毒N蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在克隆犬冠状病毒(canine coronavirus,CCV)N基因,体外表达N蛋白,并制备抗该蛋白质的多克隆抗体,用于CCV的诊断及其抗原的检测。参考GenBank中CCV的N基因序列(登录号:KY063618.2),选择CCV流行毒株的N基因,通过对该基因密码子进行优化和基因合成,最后选择一段有效基因构建重组表达质粒pET-B2M-N,将成功构建的重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆提取质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,通过0.5mmol/L IPTG 30℃进行诱导表达。结果表明,优化诱导条件后成功表达出大小约为49ku的重组蛋白。将重组蛋白与弗氏佐剂按一定比例混合,每隔2周免疫G767、G768两只日本大耳白兔数次,用间接ELISA检测G768抗体效价可达1∶512 000,选用G768抗体进行抗体纯化,纯化后浓度可达10mg/mL,用间接ELISA、Western blotting和间接免疫荧光试验对N蛋白纯化后制备的兔多克隆抗体进行检测分析,表明表达的重组N蛋白免疫原性良好,制备的多克隆抗体具有良好的反应原性。本研究为犬冠状病毒抗原抗体检测以及靶标CCV诊断试剂盒的建立奠定了一定的基础。     

犬冠状病毒N蛋白的原核表达及其多克隆抗体的制备

本研究旨在克隆犬冠状病毒（canine coronavirus,CCV）N基因,体外表达N蛋白,并制备抗该蛋白质的多克隆抗体,用于CCV的诊断及其抗原的检测。参考GenBank中CCV的N基因序列（登录号：KY063618.2）,选择CCV流行毒株的N基因,通过对该基因密码子进行优化和基因合成,最后选择一段有效基因构建重组表达质粒pET-B2M-N,将成功构建的重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆提取质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,通过0.5 mmol/L IPTG 30 ℃进行诱导表达。结果表明,优化诱导条件后成功表达出大小约为49 ku的重组蛋白。将重组蛋白与弗氏佐剂按一定比例混合,每隔2周免疫G767、G768两只日本大耳白兔数次,用间接ELISA检测G768抗体效价可达1∶512 000,选用G768抗体进行抗体纯化,纯化后浓度可达10 mg/mL,用间接ELISA、Western blotting和间接免疫荧光试验对N蛋白纯化后制备的兔多克隆抗体进行检测分析,表明表达的重组N蛋白免疫原性良好,制备的多克隆抗体具有良好的反应原性。本研究为犬冠状病毒抗原抗体检测以及靶标CCV诊断试剂盒的建立奠定了一定的基础。     

家蚕丝素轻链蛋白多克隆抗体的制备及应用

本研究通过用回收纯化的Fib-L蛋白为抗原免疫家兔,获得多克隆抗体,通过与家蚕大造5龄5d的10个不同组织进行Western blot,结果表明,制备的FbL抗体能识别在后部丝腺特异合成的Fib-L蛋白,表明该抗体有较好的特异性。利用此抗体进行丝腺组织的免疫组化,经抗体的一系列的梯度稀释和条件探索,发现当Fib-L-抗在1：50和荧光二抗1：1000的条件下得到理想的免疫组化结果,在荧光显微镜下观察到了二抗标记的绿色荧光。以上结果显示,本实验成功制得Fib-L蛋白抗体,获得丝腺组织免疫组化的一些重要参考信息,为家蚕丝腺功能基因的研究及细胞定位提供了一定的参考价值。     

熊蜂SMRTER蛋白多克隆抗体的制备

熊蜂是重要的传粉昆虫,在促进农业生产及维护生态系统平衡等发面发挥着重要作用。Smr基因编码的蛋白为SMRTER(SMRT-related and ecdysone receptor interacting factor),是一个转录因子。在模式生物中发现,Smr基因参与调控包括器官发育、代谢及其他多个重要的生物学过程。本研究利用基因合成技术获得熊蜂Smr基因的编码序列,并把它克隆进原核表达载体进行诱导表达,产生SMRTER重组蛋白。然后,利用纯化的SMRTER蛋白制备兔抗SMRTER多克隆抗体。进一步的检测发现,此多克隆抗体对SMRTER蛋白具有良好的特异性。该研究对于更好理解Smr基因在熊蜂中所发挥的生物学功能具有重要的意义。     

布鲁氏菌分泌蛋白BspJ多克隆抗体的制备

为获得一定纯度及浓度的布鲁氏菌分泌蛋白BspJ并制备多克隆抗体,本研究通过常规PCR方法扩增BspJ基因,连接至pMD19-T克隆载体并筛选阳性克隆;使用限制性内切酶切下目的片段后连接至pET28a(+)载体,双酶切、菌液PCR验证阳性克隆菌并送测序;表达载体pET28a-BspJ转入大肠杆菌DE3后经IPTG诱导表达,收集表达菌进行SDS-PAGE分析;使用His标签蛋白纯化柱纯化目的蛋白rBspJ;将rBspJ蛋白混入弗氏佐剂分4次免疫实验兔,收集兔血清,Western blot鉴定多克隆抗体,饱和硫酸铵法纯化多克隆抗体.结果显示:PCR方法扩增出大小534 bp的目的片段,测序结果正确,表明成功构建出pMD19-T-BspJ克隆载体及pET28a-BspJ表达载体;表达菌表达出大小约24 kDa的rBspJ,纯化后的rBspJ条带明显,基本无杂带,表明成功纯化出rBspJ;真核表达的rBspJ与制备的多克隆抗体反应,表明成功制备多克隆抗体.本研究结果为BspJ蛋白的亚细胞定位分析、功能研究及布鲁氏菌致病机制的研究积累实验数据和奠定基础.     

鸡RNF165蛋白多克隆抗体制备及其生物信息学分析

【目的】制备鸡环指蛋白165(RNF165)多克隆抗体并对RNF165蛋白进行生物信息学分析,以期为研究鸡RNF165的生物学功能提供参考。【方法】以鸡胚成纤维细胞(DF-1)为试验材料,提取总RNA,反转录获得cDNA,通过PCR扩增RNF165基因,将其连接至pET-28a(+)质粒构建重组表达质粒pET-28a-RNF165。将测序正确的重组表达质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达,将表达的融合蛋白纯化后按照制定的免疫程序免疫7周龄BALB/c雌鼠。第3次免疫7 d后,分离小鼠血清,用Western blotting检测鼠抗RNF165蛋白多克隆抗体的特异性,间接ELISA法测定其效价。使用在线生物信息学软件对RNF165蛋白理化性质、信号肽、磷酸化位点、亚细胞定位、跨膜结构、二级结构和保守结构域进行分析。【结果】成功扩增得到大小为1 068 bp的RNF165基因。成功构建原核表达载体pET-28a-RNF165,并诱导表达出约43 ku的RNF165蛋白。Western blotting结果显示,制备的鼠抗RNF165蛋白多克隆抗体能特异性识别DF-1细胞中过表达的...     

布鲁氏菌分泌蛋白BspD多克隆抗体制备及其生物信息学分析

本研究旨在获得布鲁氏菌BspD蛋白,制备其多克隆抗体,并分析其潜在生物学功能。根据流产布鲁氏菌（Brucella abortus）2308的BspD基因序列（GenBank登录号：NC_007618.1）获得BspD基因序列,对布鲁氏菌BspD氨基酸序列进行生物信息学分析,然后将目的基因嵌入pMD19-T载体,使用限制性内切酶切下目的基因重组入pET-28a（+）载体,构建pET28a-BspD重组载体,经过双酶切、测序验证后,IPTG诱导表达菌株,SDS-PAGE法鉴定BspD的表达,His标签蛋白纯化柱纯化BspD蛋白,BCA试剂盒检测蛋白浓度。用纯化BspD蛋白免疫新西兰大白兔,Western blotting鉴定多克隆抗体的特异性,间接ELISA法检测抗体的效价及反应原性。结果表明,成功表达出37 ku BspD蛋白,BCA方法测得纯化BspD浓度为2 000 μg/mL;Western blotting结果显示制备的抗体具有良好的特异性,间接ELISA检测出BspD多克隆抗体的效价为1：12 800,成功制备出BspD多克隆抗体,但其反应原性较低。生物学信息分析得出BspD蛋白具有亲水性,存在跨膜区,无信号肽,有17个磷酸化位点和11个抗原决定簇,BspD蛋白二级结构以α-螺旋为主,达到86.80%,还存在少量延伸链、无规则卷曲、β-折叠等;在线软件Phyre 2构建BspD三级结构证实其多为α-螺旋。以上结果可为进一步研究布鲁氏菌分泌蛋白BspD的功能及分子机制提供参考。     

H3N2亚型犬流感病毒NP蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

将分离的H3N2亚型犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)A/Canine/Nanjing/11/2012(H3N2)株的核蛋白(NP)基因克隆至原核表达载体p ET28a(+)中,构建重组表达质粒p ET-NP,然后转化大肠杆菌E.coli Rosetta(DE)感受态细胞,经IPTG诱导后,采用SDS-PAGE和Western blot进行分析。结果显示,大肠杆菌表达的重组NP蛋白的分子量约为61 k Da,与预期相符,并能与犬CIV阳性血清发生特异性反应。将表达的重组NP蛋白进行纯化后,免疫大白兔制备抗NP蛋白多克隆抗体血清,Western blot检测该血清可与CIV的NP蛋白发生特异性反应,间接ELISA检测该多克隆抗体血清的效价达1:30 000,显示了较高的抗体效价。本研究为CIV快速检测方法的建立和流行病学调查奠定了科学依据。     

犬细小病毒NY株VP2蛋白多克隆抗体的制备与鉴定

试验旨在制备犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）VP2蛋白多克隆抗体。构建pET28a-CPV-VP2重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达,纯化目的蛋白与佐剂混合、乳化制备后作为免疫原,免疫家兔制备VP2蛋白多克隆抗体;采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法（immunoperoxidase monolayer assay,IPMA）检测抗体的免疫活性、抗体滴度、病毒滴度及中和活性。结果表明,重组VP2蛋白（rVP2）以包涵体形式存在,分子质量约为72 ku;所制备的多克隆抗体滴度为1 600倍,病毒滴度为10⁷ TCID₅₀ /mL,中和效价为1∶2 884,该抗体与体外培养的CPV呈特异性反应,CPV VP2蛋白的多克隆抗体免疫活性和特异性良好,且中和活性高,为CPV基因工程疫苗的研究和临床治疗奠定了基础。     

猪博卡病毒VP1蛋白的多克隆抗体制备及初步应用

旨在制备猪博卡病毒(porcine bocavirus,PBoV) VP1蛋白的多克隆抗体.利用PCR技术对PBoV VP1蛋白的基因进行扩增,将所获基因克隆入原核表达载体,将重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞中诱导表达.纯化后的目的 蛋白与ISA206佐剂混合后通过背部皮下免疫日本大耳白兔,3次加强免疫后,收集兔血清,利...     

SADS-CoV S1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

猪急性腹泻综合征(SADS)是由猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)引起的仔猪急性腹泻、呕吐、脱水、体质量骤降,最终导致死亡的一类急性传染病。为制备SADS-CoV刺突蛋白(S1)的多克隆抗体,通过PCR扩增得到SADS-CoV S1基因片段,并将其克隆至原核表达载体pGEX-6p-1,构建出重组质粒pGEX-6p-1-S1。测序结果正确后将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,经GST标签凝胶纯化。纯化的S1蛋白与弗氏佐剂混合后经3次皮下注射免疫BALB/c小鼠后收集血清,通过免疫印迹试验(Western blot)和间接免疫荧光试验(IFA)进行检测。结果表明,重组的S1蛋白具有良好的反应原性和免疫原性,制备的鼠抗S1蛋白多克隆抗体也具备良好的反应活性和特异性,为后续SADS-CoV血清学诊断方法的建立及S1蛋白生物学功能研究奠定基础。     

非洲猪瘟病毒D250R蛋白生物信息学分析及多克隆抗体制备

【目的】分析非洲猪瘟病毒（Africa swine fever virus,ASFV） D250R蛋白潜在的生物学功能,制备其多克隆抗体,为ASFV D250R蛋白功能研究及相关诊断试剂的研发提供材料。【方法】应用生物信息学软件分析D250R蛋白的理化性质、信号肽、跨膜结构、磷酸化位点、生物功能及蛋白结构等。通过大肠杆菌表达系统表达重组D250R蛋白,采用镍亲和层析柱和分子筛纯化重组D250R蛋白,Western blotting检测纯化蛋白的反应原性,将纯化的D250R蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,用间接ELISA方法测定多克隆抗体效价,用间接免疫荧光试验（IFA）检测多克隆抗体特异性。【结果】生物信息学分析结果显示,D250R蛋白共由250个氨基酸组成,理论分子质量为29 822.54 u,理论等电点为8.96,为亲水性蛋白,无信号肽及跨膜区。修饰位点预测结果显示,D250R蛋白可能存在15个磷酸化修饰位点,其中丝氨酸（Ser）6个、酪氨酸（Tyr）6个、苏氨酸（Thr）3个;2个N-糖基化修饰位点,分别位于第61和197位氨基酸处。生物学功能预测结果显示,D250R蛋白含有Nudix序列,具有解水解酶活性。蛋白结构预测结果显示,D250R蛋白二级结构中α-螺旋、β-转角、延伸链、无规则卷曲占比分别为49.20%、7.60%、15.20%和28.00%,三维空间结构存在较多α-螺旋,与二级结构预测结果基本一致。将ASFV D250R基因克隆至pET-32a （＋）获得pET-32a-D250R重组质粒,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,在16℃、1 mmol/L IPTG诱导下,D250R蛋白以可溶性和包涵体2种形式表达,蛋白大小约44 ku,蛋白上清经镍亲和层析柱和分子筛层析纯化得到纯度较高的蛋白;Western blotting检测结果显示,重组蛋白具有良好的反应原性;间接ELISA检测结果显示,D250R蛋白抗体效价达到1：256 000,成功制备多克隆抗体;IFA检测结果表明该多克隆抗体具有良好的特异性。【结论】本研究在分子层面分析了D250R蛋白的理化性质及蛋白结构,在大肠杆菌表达系统中实现了ASFV D250R蛋白的高效表达,纯化的D250R蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体具有较高的特异性,为深入探讨ASFV D250R蛋白的生物学功能及ASFV相关诊断试剂的研发奠定了基础。     

禽安卡拉病毒Hexon蛋白多克隆抗体的制备

为进一步建立Ⅰ群血清4型禽腺病毒(FADV-4)的特异性检测方法,根据本实验室分离鉴定的安卡拉病毒的基因组序列,设计针对六邻体蛋白(Hexon)基因的特异性引物,经PCR扩增,连接至p ET-28a中,构建原核表达载体p ET-28a-Hexon。将其转化感受态BL21中,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,SDS-PAGE分析,获得重组蛋白大小为49 ku。Western blot分析纯化后重组蛋白能与FAd V-4阳性血清发生特异性反应。将纯化后的重组蛋白免BALB/c小鼠,制备了六邻体蛋白多克隆抗体,采用间接ELISA方法测定效价表明制备的血清效价大于1∶64 000。     

兔抗猪CD163蛋白多克隆抗体制备及鉴定

为制备兔抗猪CD163多克隆抗体,采用RT-PCR方法从猪PAMRNA中扩增CD163胞质外区部分基因SRCR4-5,克隆至pGEX-6p-1原核表达载体,在IPTG诱导下获得约50000以包涵体形式表达的重组蛋白。WesternBlotting分析表明,表达产物能够被GST单抗所识别。用该重组蛋白免疫兔制备多抗血清,经间接ELISA检测,多抗血清效价可达10^5,流式检测发现可与Marc-145和PAM上的天然CD163分子相互作用。抗体阻断试验证明制备的多抗血清可以部分阻断PRRSV感染。本试验为进一步研究PRRSV与受体一CDl63相互作用机制打下了基础。     

猪STING多克隆抗体的制备及应用研究

干扰素基因刺激因子(STING)是天然免疫信号通路环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cGAS)-STING中重要的衔接蛋白,它能够识别细胞内第二信使环磷酸鸟苷-腺苷(c GAMP),激活I型干扰素(IFN-I)的表达。为了制备猪STING(pSTING)多克隆抗体(ppSTING)并对其初步应用,本研究利用PCR方法扩增pSTING基因构建重组表达质粒pGEX-6p1-pSTING,转化大肠杆菌BL21(DE3)并经IPTG诱导后经SDS-PAGE和western blot方法鉴定GSTpSTING蛋白(rpSTING)的表达;利用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析方法纯化rpSTING并免疫新西兰大白兔制备ppSTING,经Protein G亲和层析介质纯化后分别采用SDS-PAGE鉴定纯化的ppSTING。结果显示rpSTING以可溶形式表达,分子质量约为52.5 ku。SDS-PAGE结果显示,制备的ppSTING包含重、轻链且纯度较好。将ppSTING分别应用于western blot、间接免疫荧光试验(IFA)检测外源表达及CRL-2843细胞中内源表达的pSTING;将其应用于Co-IP试验检测ppSTING与外源表达pSTING的相互作用;将其应用于激光共聚焦试验检测cGAMP刺激后的PK-15细胞中内源表达的pSTING与AP-1在该细胞中的共定位;将其应用于western blot检测ASFV感染后PAMs中的pSTING蛋白。Western blot和IFA结果显示,制备的ppSTING能特异性地识别HEK293T细胞中过表达及CRL-2843细胞中内源表达的pSTING蛋白;Co-IP结果显示,ppSTING与pSTING蛋白存在相互作用;激光共聚焦试验结果显示,ppSTING可用于检测PK-15中内源表达的pSTING蛋白且在cGAMP刺激后的PK-15细胞中的pSTING能够与AP-1定位于高尔基体。Western blot结果显示,ppSTING能够与未感染ASFV的PAMs中内源表达的pSTING蛋白反应,且在ASFV感染PAMs 24 h后pSTING蛋白的表达量增加。上述结果表明,本研究制备了ppSTING并且证实其可以用于宿主天然免疫方面的应用研究。本研究为探究pSTING蛋白的生物学功能以及cGAS-STING信号通路奠定了基础。     

牦牛ATG5多克隆抗体的制备及应用

为了进一步研究自噬在牦牛生殖活动中发挥的作用,本研究通过合成牦牛自噬相关5(autophagy related 5,ATG5)基因,并将合成的基因插入pET-32a质粒,转化BL21(DE3)感受态细胞,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-Thiogalactoside, IPTG)诱导表达ATG5重组蛋白并纯化,免疫日本大耳白兔,制备牦牛ATG5多克隆抗体。采用间接ELISA法检测抗体的效价,蛋白质印迹(Western blot, WB)技术检测多克隆抗体的特异性。通过Western blot、免疫组织化学法(immunohistochemistry, IHC)和免疫荧光技术(immunofluorescence, IF)应用所制备的抗体检测ATG5蛋白在牦牛生殖器官中的表达。结果成功构建了pET-32a-ATG5原核表达质粒,转化大肠杆菌IPTG诱导获得了大小约为53 kDa(含His和Trx标签)的重组蛋白;制备的牦牛ATG5多克隆抗体效价为1∶1 280 000,特异性良好。应用显示,ATG5蛋白在牦牛睾丸和输卵管中均有表达。本研究成功制备了牦牛ATG5多...