牛源多杀性巴氏杆菌血清分型及毒力相关基因的检测研究

为确定新疆北疆部分地区疑似病例中分离的牛源多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）流行的血清型、ST型及毒力相关基因的分布情况,本研究以分离的17株牛源Pm为研究对象,采用荚膜多重PCR分型法、脂多糖多重PCR分型法（LPS-mPCR）、多位点序列分型法（MLST）及PCR方法检测17株Pm分离株的荚膜型、脂多糖型、MLST型及7类共25个毒力相关基因的分布情况。结果显示,13株Pm的荚膜脂多糖型为A：L3型,ST型均为ST1型,4株Pm荚膜脂多糖型为B：L2型,ST型均为ST44;17株Pm毒力相关基因（exbB、exbD、fimA、fur、hgbA、hsf2、nanB、oma87、ompA、ompH、plpB、psl、ptfA、sodA、sodC、tonB和tbpA）的检出率高达100%,toxA基因的检出率为0。结果表明,从新疆北疆部分地区规模化牛场疑似病例中分离的Pm主要血清型为A：L3：ST1型。     

犊牛肺炎多杀性巴氏杆菌荚膜血清型和基因型的研究

从石河子及附近地区规模化牛场死于肺炎的犊牛肺脏中共分离8株多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm),为了确定分离菌株的血清型和基因型,分别进行了多重荚膜特异基因PCR检测、脂多糖多重PCR(LPS-m PCR)分型和多位点序列分型(MLST)鉴定和分析。结果显示8株分离菌中,7株为荚膜A型,1株为荚膜B型;LPS-m PCR结果显示其中7株菌为L2,1株为L3基因型;MLST技术将8株细菌中的7株分为ST1型,1株分为ST44型,且两者亲缘关系较近。结果表明8株Pm以荚膜血清A型为主,根据LPS基因特异性将其分为2个基因型,基于管家基因的MLST将8株Pm分为两种ST型。     

牛源多杀性巴氏杆菌荚膜血清型及毒力基因检测

为了确定12株牛源多杀性巴氏杆菌的血清型及毒力基因的携带情况,本研究采用PCR技术对12株牛源多杀性巴氏杆菌(pasteurella maltocida,Pm)进行荚膜血清型鉴定和6种毒力基因(tbp A、hgb A、hgb B、ptf A、pfh A、tox A)的检测,并对其序列进行比对分析。结果显示:12株多杀性巴氏杆菌均为荚膜血清A型;100%的荚膜血清A型Pm携带hgb A毒力基因和pfh A毒力基因;41.67%的荚膜血清A型Pm携带nan H毒力基因;58.33%的荚膜血清A型Pm携带ptf A毒力基因;而对于tbp A与tox A两种毒力基因在12株牛源荚膜血清A型Pm中均未检测到。     

我国猪群中多杀性巴氏杆菌的基因型分析

本研究旨在了解我国猪群中流行的多杀性巴氏杆菌(Pm)的主要基因型。利用荚膜基因分型、脂多糖(LPS)基因分型、多位点序列分型(MLST)对2013年12月—2017年12月4年间来源于我国各地区规模化猪场患有疑似呼吸系统疾病的病死猪肺、鼻拭子、气管、肝等样品中分离鉴定的Pm进行基因型分析,并对23种主要毒力基因进行检测。结果表明,当前在我国猪群中流行的Pm的荚膜基因型为A(48.85%)、D(42.75%)、F(2.67%),优势基因型为A和D;LPS基因型为L3(25.00%)和L6(75.00%)型,优势基因型为L6;MLST基因型为ST3(21.25%)、ST10(27.50%)、ST11(42.50%)、ST12(2.50%)、ST16(2.50%)、ST74(1.25%)及ST75(2.50%),优势基因型为ST3、ST10和ST11。如果将荚膜基因型、LPS基因型和MLST基因型组合起来看,当前在我国猪群中流行的Pm的主要基因型为荚膜:脂多糖:MLST基因型A:L3:ST3(20.00%)、A:L6:ST10(26.25%)及D:L6:ST11(42.50%)。毒力基因检测的结果发现部分毒力基因的分布表现出一定的"基因型偏好性"。结果提示,D:L6:ST11是我国猪群中流行的多杀性巴氏杆菌的主要基因型,可能与我国猪群中由多杀性巴氏杆菌导致的呼吸道疾病密切相关。     

国内部分地区多杀性巴氏杆菌荚膜血清型和基因型的研究

为了解国内部分地区不同动物多杀性巴氏杆菌(P.multicida)流行情况,本研究以36株P.multicida为研究对象,通过多重荚膜PCR、多位点序列分型(MLST)和脂多糖多重PCR(LPS-m PCR)对其荚膜型和基因型进行鉴定。采用多重荚膜PCR方法将36株细菌的荚膜血清型分为A、B和D 3种,其中禽源P.multicida主要以A为主;以LPS-m PCR方法将P.multicida分为L1、L2、L3和L6 4种LPS基因型,禽源P.multicida主要为L1型;通过MLST技术将P.multicida分为ST-129、ST-8、ST-58、ST-5、ST-13、ST-50和ST-122 7种ST型,禽源P.multicida主要为ST-129型。本研究为P.multicida的流行病学监测和基因多样性提供了技术支撑。     

牛荚膜血清A型巴氏杆菌病的分子流行病学调查

本研究针对多杀性巴氏杆菌(Pm)特异性基因kmt1,进化保守基因16S rRNA基因,以及荚膜血清型A、B、D、E和F型对应的荚膜生物合成基因hayD-hayC、bcbD、dcbF、ecbJ和fcbD,设计特异性PCR扩增引物,采用PCR方法扩增相应基因和进行序列测定,并对分离菌株进行分子鉴定和同源性分析。结果显示,来自不同地区的分离菌株均含有Pm种特异性基因kmt1、A型荚膜生物合成基因hayD-hayC和16S rRNA基因。不同地区的分离株,kmt1基因的同源性为100%;A型荚膜生物合成基因hayD-hayC同源性大于99.9%;与国外牛源分离株的hayD-hayC基因的同源性大于98%;不同地区分离株的16S rRNA基因的同源性为100%,而与英国牛源分离株Pm338的16S rRNA基因的同源性高达99.93%。这些结果表明,在我国6个省市流行的牛出血性败血症由同一来源的荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌所致,与英国牛源A型分离株Pm338具有共同的进化来源。     

牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌疫苗候选株的筛选及鉴定

为了筛选生长快、毒力强、免疫原性好、副反应小的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)灭活疫苗菌株,本试验选取6株来自不同地区致犊牛肺炎死亡的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌分离株,测定了培养基生长曲线、小鼠毒力、菌体脂多糖(LPS)含量及各菌株灭活菌苗免疫小鼠和家兔后的抗体效价,并进行了攻毒保护试验。结果显示,分离株Pm2、Pm3、Pm5生长速度较快、毒力较强、LPS含量较多,均含有与毒力和免疫相关的ptfA和fimA基因;免疫小鼠及家兔未发现明显不良反应,在二免后14d血清抗体达1∶64~1∶128,强毒攻毒后全部存活,而PBS对照组全部死亡。本试验结果表明,Pm2、Pm3、Pm5均可作为多杀性巴氏杆菌灭活菌苗的候选菌株,其中Pm3作为首选株。     

奶牛源金黄色葡萄球菌新疆流行株的耐药特性、毒力基因及分子分型

旨在了解引起奶牛乳房炎和子宫内膜炎的金黄色葡萄球菌(SA)新疆流行株的耐药性、毒力基因及其分子流行病学特征。对2014—2016年新疆地区155株SA奶牛临床分离株的耐药表型进行分析,并对耐甲氧西林SA(MRSA)进行鉴定;通过PCR技术对SA的耐药基因、毒力基因进行检测及SCCmec、MLST分子分型。结果在155株SA中检出22株MRSA,检出率为14.2%;MRSA流行株的耐药性明显高于甲氧西林敏感SA(MSSA);不同的毒力基因在MSSA和MRSA中的检出率有所差异;SCCmecⅠ为新疆地区SA主要基因型;MLST分型共检出14种ST型,分别为ST188、ST584、ST9、ST805、ST2373、ST968、ST2139、ST1、ST2700、ST903、ST2454、ST2990、ST63、STX,其中ST1和ST9检出率相对较高,在MSSA菌株中ST9型的检出率最高,MRSA菌株中ST1检出率最高。研究表明,新疆地区奶牛源SA中主要流行株为MSSA,但MRSA耐药性更强,且毒力基因分布多样,ST9为MSSA流行株的主要基因型,ST1-SCCmecⅠ为MRSA流行株的主要基因型。     

广东鹅源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定、耐药表型和耐药基因的检测及相关性分析

为了解广东地区鹅源多杀性巴氏杆菌(Pm)的流行情况、药物敏感性、耐药基因的携带情况以及耐药表型与耐药基因的相关性,本实验对2019年～2022年从广东地区采集的193份疑似感染Pm病鹅的心脏血液和肝脏组织划线接种于不同的培养基分离细菌,对分离菌纯化后采用PCR扩增分离菌的KMT1基因并测序,采用多重PCR扩增分离菌的5个荚膜基因及8个脂多糖基因,分析分离菌的荚膜分型与脂多糖(LPS)分型。结果显示分离到83株鹅源Pm,其中82株为荚膜A型,1株无法通过荚膜定型;LPS分型为L1型。采用K-B纸片扩散法检测分离菌的药物敏感性;通过PCR检测分离菌7类药物的15种耐药基因,包括β-内酰胺类(bla_CTX-M、bla_TEM、bla_OXA)、氨基糖苷类(aadA1、aph(3’)Ila)、喹诺酮类(qnrA、qnrB、qnrS)、酰胺醇类(floR)、四环素类(tetM、tetX)、大环内酯类(ermF、ereD)、磺胺类(sul1、sul3)耐药基因。采用统计学软件SPSS22中的完全随机设计两样本率的卡方检验分析分离菌的耐药...     

两株牛源荚膜A群脂多糖3型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

用北京、山东两奶牛场疑似牛出败的病死牛组织感染小鼠,小鼠死亡后取组织染色镜检、接种血清TSA和麦康凯培养基,分离到2株疑似多杀性巴氏杆菌,命名为Pm1和Pm2。经细菌培养特性及形态检验、多杀性巴氏杆菌种特异性PCR、荚膜A、B血清群特异性PCR、脂多糖基因分型PCR、荚膜A群透明脂酸抑制试验鉴定其为荚膜血清A群、脂多糖3型多杀性巴氏杆菌。将Pm1和Pm2回归小鼠证明有强毒力。本试验为国内荚膜A群多杀性巴氏杆菌的流行病学研究增添了一些新数据。     

奶牛临床型乳房炎MRSA新疆流行株耐药基因的检测及MLST分型研究

为了解新疆地区奶牛临床型乳房炎MRSA流行株耐药表型、耐药基因分布及分子分型特征,采用纸片扩散法检测了临床分离的71株金黄色葡萄球菌的耐药表型,并对MRSA进行判定;应用多重PCR方法对MRSA流行株进行耐药基因的检测及MLST分型。结果显示,71株金黄色葡萄球菌中共检出13株MRSA,检出率为18.3%。13株MRSA流行株均检出mecA和linA耐药基因,检出率为100.0%;7株检出tetm耐药基因,检出率为53.8%;4株检出msrB耐药基因,检出率为30.8%;4株检出AacA-Da耐药基因,检出率为30.8%;MLST分型结果发现,13株MRSA可分为6种ST型,分别为ST188、ST9、ST63、ST2700、ST968、ST2373,其中ST9型流行较为广泛。本研究为新疆地区奶牛MRSA流行株的耐药特性及分子特征提供了理论基础,为兽医临床合理用药提供了科学依据。     

甘肃部分地区奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌的细菌多位点序列分型与毒力检测

为研究甘肃地区牛源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的耐药情况、基因型总体结构特征及毒力因子的分布情况,从甘肃省东、中和西部3个地区的3个县市采集41头罹患临床型乳房炎奶牛的93份乳样,采用鉴别培养基分离纯化细菌。采用K-B法对分离株进行耐药性分析,常规PCR方法检测mecA抗性基因和14种常见毒力基因以及多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)。结果显示,93份乳样中分离出28株金黄色葡萄球菌;分离株有不同程度的耐药且多为多重耐药(16株),多重耐药菌株占57.14%,未发现耐万古霉素菌株(VRSA),万古霉素敏感率为100%;28株分离菌中共检出mecA阳性11株,检出率为39.3%;共获得9个已知ST型;有12种毒力基因不同程度被检出,其中nuc、spa和coa检出率为100%,hlb、set1、clfA、FnBPA和seb阳性检出率均大于50%,sak、seg、PVL和sea的检出率依次为28.6%、7.9%、14.3%和21.4%,而FnBPB、hla基因未检出。研究结果可为甘肃省牛源金黄色葡萄球菌的耐药性评价、溯源分析和治疗提供参考依据。     

一株致兔结膜炎多杀性巴氏杆菌的分子分型及毒力基因分布

为明确致兔结膜炎多杀性巴氏杆菌分离株FJPM001的分子分型和毒力基因分布,本试验对分离菌FJPM001进行荚膜分子分型、菌体分子分型和多位点序列分型并对该菌的毒力基因分布进行检测。结果显示,该菌的荚膜为A型,菌体为L3型,确定其血清型为A:L3。多位点序列分型结果显示该菌的序列型为ST12,并携带omp A、omp H、oma87、hgb B、ptf A、tad D和pm HAS 7种毒力基因。本研究分析了致兔结膜炎多杀性巴氏杆菌的分子分型和毒力基因分布,为进一步研究该菌的致病机理奠定基础。     

75株蛋鸡源沙门菌的MLST分型与耐药性分析

旨在掌握2017年7月至2019年5月期间云南地区蛋鸡源沙门菌血清型、药物敏感性及毒力基因携带等基本情况。无菌采集发病鸡肝组织，共分离到沙门菌75株，对分离株进行MLST分型、药物敏感性及相关耐药基因和毒力基因检测。结果显示，MLST鉴定到ST78序列型鸡伤寒沙门菌54株(72.00%)、ST92序列型鸡白痢沙门菌21株(28.00%)；分离株对青霉素的耐药率为100%，对其它抗生素的耐药率分别为: 四环素26.67%、强力霉素26.67%、复方新诺明22.67%、阿莫西林18.67%、氨苄西林16.00%、恩诺沙星14.67%、链霉素8.00%、环丙沙星2.67%、庆大霉素1.33%，共存在7种耐药谱型，28.00%的菌株表现为多重耐药，且集中于鸡伤寒沙门菌；耐药基因tetA、sul2和blaTEM的检出率分别为26.67%、10.67%和8.00%；毒力基因mogA、mgtC、bcfA、araB、stn和spvC的检出率均高达100%，而spvB的检出率为 89.33%。结果表明，鸡伤寒沙门菌和鸡白痢沙门菌为云南地区蛋鸡源沙门菌主要流行血清型，多重耐药情况严重，耐药基因与毒力基因检出率较高。     

鸽源ST443肺炎克雷伯菌的分离鉴定和生物学特性分析

为查明引起江苏省某养殖场赛鸽肺炎的病原及其生物学特性,本试验从患有呼吸道疾病的赛鸽肺组织中分离到1株肺炎克雷伯菌,通过形态学、生化鉴定、PCR扩增和16S rRNA基因测序对分离菌株进行鉴定,并采用多位点序列分型(MLST)、毒力基因检测、荚膜血清型分型、wzi基因测序、致病性分析、生物被膜形成能力测定、耐药基因检测、药敏试验和中药体外抑菌试验对分离菌株的生物学特性进行分析。结果显示,分离菌株为革兰阴性杆菌,显微镜下可见两端钝圆、杆状菌体,生化鉴定、khe基因PCR扩增和16S rRNA基因进化发育树分析确定其为肺炎克雷伯菌;MLST分型为ST443型;该菌株携带fimH、uge和wabG三种毒力基因;wzi基因测序鉴定分离菌株荚膜血清型为K16型;该菌株人工感染健康雏鸡可导致雏鸡多个器官出现不同程度的病变,半数致死量(LD₅₀)为4.68×10⁹ CFU/mL;分离菌株具有中等生物被膜形成能力,携带bla_SHV、bla_TEM、tetM和sul1四种耐药基因,对头孢曲松、头孢美唑、丁胺卡那、复方新诺...     

牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌疫苗候选株的筛选及鉴定

为了筛选生长快、毒力强、免疫原性好、副反应小的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida，Pm）灭活疫苗菌株，本试验选取6株来自不同地区致犊牛肺炎死亡的牛源荚膜A型多杀性巴氏杆菌分离株，测定了培养基生长曲线、小鼠毒力、菌体脂多糖（LPS）含量及各菌株灭活菌苗免疫小鼠和家兔后的抗体效价，并进行了攻毒保护试验。结果显示，分离株Pm2、Pm3、Pm5生长速度较快、毒力较强、LPS含量较多，均含有与毒力和免疫相关的ptfA和fimA基因；免疫小鼠及家兔未发现明显不良反应，在二免后14 d血清抗体达1：64~1：128，强毒攻毒后全部存活，而PBS对照组全部死亡。本试验结果表明，Pm2、Pm3、Pm5均可作为多杀性巴氏杆菌灭活菌苗的候选菌株，其中Pm3作为首选株。     

不同动物源多杀性巴氏杆菌荚膜分子分型及其致病性研究

为了确定西南民族大学动物医学实验室分离的鸭源、猪源、牛源和山羊源多杀性巴氏杆菌(Pm),即Q1、Z1、N1、Y1株的荚膜血清型及其致病性,试验采用PCR方法对分离的这4株不同动物源多杀性巴氏杆菌的种属和荚膜血清型进行鉴定,对目的基因测序分析,并用Balb/c小鼠对分离菌的致病性进行研究。结果表明:4株菌均为多杀性巴氏杆菌;鸭源Q1株为荚膜血清A型、猪源Z1株和牛源N1株为荚膜血清B型、山羊源Y1株为荚膜血清D型;对目的基因测序后与GenBank上已公布的相应荚膜血清型比对,同源性为98%～100%;不同动物源多杀性巴氏杆菌对Balb/c小鼠的致病性研究显示,猪源荚膜血清B型多杀性巴氏杆菌对Balb/c小鼠有较强的致病力。     

一株单核细胞增生李斯特菌分离株的分子分型鉴定及其生物学特性

从上海某羊养殖场获得了一株单核细胞增生李斯特菌分离株CMG47。为了确定该单核细胞增生李斯特菌分离株的分子分型,了解其生物学特性,本研究通过多重PCR对该菌株进行谱系和血清型分析,利用多位点序列分型(MLST)方法鉴定其分子分型。采用PCR方法对主要毒力基因进行检测,并通过体外观察和荧光定量PCR对菌株溶脂溶血特性进行分析。将菌株通过腹腔注射ICR小鼠和静脉注射斑马鱼,测定其毒力。研究结果表明该分离株属于谱系Ⅰ,1/2b血清型;序列分型为ST619;携带prfA、inlA、inlB、plcA、plcB、mpl、actA、hly等主要毒力因子;体外无明显溶脂活性,溶血活性较弱;小鼠和斑马鱼试验均显示,该分离株属于强毒株,与强毒参考株EGDe的毒力相当(P0.05)。该分离株的谱系/血清型为引起李斯特菌病的主要型别,拥有整套主要毒力因子,为单增李斯特菌强毒株。本研究为李斯特菌病散发病例的流行和传播特征分析提供了分子生物学基础,对建立健全李斯特菌监测体系和风险评估意义重大。     

猪源沙门氏菌毒力基因检测及脉冲场凝胶电泳分型研究

为了解上海及周边地区猪源沙门氏菌的血清型分布、毒力基因及分子分型情况,我们对21株临床分离到的猪源沙门氏菌用沙门氏菌属诊断血清鉴定血清型;采用多重聚合酶链式反应,检测17个主要的毒力基因;应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术进行分子分型,探寻21株沙门氏菌之间的亲缘关系。结果显示,21株沙门氏菌中,19株血清型为7∶c∶5,1株为4∶i∶2,1株未鉴定出;21株沙门氏菌的17个毒力基因中检出16个,菌株之间无差别;经PFGE后,每个菌株产生13~18条电泳条带,用Bionumerics软件进行聚类分析表明,21株猪源沙门菌相似度在77%~100%,可分为2种不同的基因型,其中A型有19株、B型2株,亲缘关系较近。本次实验分离的沙门氏菌血清型以7∶c∶5为主,含有16个主要的毒力基因,A型为优势基因型。     

反刍动物源产气荚膜梭菌新疆流行株的分离鉴定及分型研究

为了弄清反刍动物源产气荚膜梭菌新疆流行株的生物学特性和分子特征,本研究从新疆不同地区规模化养殖场和屠宰场采集158份牛羊临床病料,进行产气荚膜梭菌的分离培养;通过形态学、生化特性、16S rRNA序列分析对产气荚膜梭菌分离株进行鉴定;利用多重PCR技术扩增产气荚膜梭菌α、β、ε、ι、β2基因,将测序结果与NCBI数据库比对进行新疆流行株的基因分型。结果从158份临床病料中共分离出产气荚膜梭菌67株,形态学、生化和16S rRNA序列分析鉴定结果均为产气荚膜梭菌。毒素基因检测表明,其中α基因检出率为100.00%(67/67),ε基因检出率为17.91%(12/67),β2基因检出率为37.31%(25/67),β、ι基因未检出。毒素基因分型可将产气荚膜梭菌新疆流行株分为A、D型,其中A型占82.09%(55/67),D型占17.91%(12/67),提示产气荚膜梭菌新疆流行株优势型别为A型。本研究为产气荚膜梭菌流行病学研究和防控提供科学依据。