冷冻保护剂和细胞松弛素B对猪MⅡ期卵母细胞冷冻效率的影响

为了评价冷冻保护剂和离心处理对猪MⅡ期卵母细胞冷冻效率的影响,本试验研究了2种不同冷冻保护剂(乙二醇、二甲基亚砜和蔗糖混合物,EDS;乙二醇、丙二醇和蔗糖混合物,EPS)对猪MⅡ期卵母细胞冷冻效率的影响,以及细胞松弛素B和离心极化处理对猪MⅡ期卵母细胞冷冻效率的影响。结果表明:用EPS和EDS作为猪MⅡ期卵母细胞冷冻保护剂,冻融后其成活率差异并不显著。用不同浓度CB处理猪MⅡ期卵母细胞,7.5μg/mL的处理组冻融后成活率显著高于对照组(P<0.05)。猪MⅡ期卵母细胞经7.5μg/mL CB和离心极化双重处理,冻融后成活率显著高于CB单处理组和对照组,且3组间差异显著(P<0.05)。表明CB和离心极化处理都能改善MⅡ期猪卵母细胞冷冻效率,但它们作用机制还有待于进一步研究。     

玻璃化冷冻对猪MⅡ期卵母细胞及其DNA的影响

研究旨在筛选最适合猪MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻的冷冻液,并探究玻璃化冷冻对猪MⅡ期卵母细胞DNA的影响。选取目前应用最多的7种冷冻液（分别为1、2、3、4、5、6、7组）,将MⅡ期卵母细胞随机分为8组,其中对照组直接进行孤雌激活,其余7组分别进行7种冷冻液处理后不经液氮冷冻直接于解冻液中解冻,解冻后进行孤雌激活,通过卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数的统计结果筛选出最适冷冻液;应用筛选的3种冷冻液,进行猪MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻,解冻后恢复2 h,统计卵母细胞形态正常率,孤雌激活44~48 h统计卵裂率;应用透射电子显微镜观察正常MⅡ期卵母细胞与玻璃化冷冻-复苏后的MⅡ期卵母细胞超微结构的变化;将猪MⅡ期卵母细胞随机分成对照组、冷冻液处理组和冷冻组,应用彗星电泳技术检测玻璃化冷冻对卵母细胞DNA的损伤。结果发现,与对照组相比,除5组卵裂率、1组囊胚率显著降低（P<0.05）外,其余各组卵裂率、囊胚率均差异不显著（P>0.05）;各组间囊胚细胞数均低于对照组,但差异均不显著（P>0.05）,3、6、7组卵裂率和囊胚率较高;玻璃化冷冻-解冻后,7组卵母细胞的形态正常率、卵裂率均显著低于3、6组（P<0.05）,6组卵裂率高于3组;MⅡ期卵母细胞移入预处理液中后可见明显的皱缩,移入冷冻液中迅速脱水,解冻后可见卵母细胞透明带断裂,胞质皱缩、分布不均;透射电子显微镜下,冷冻后猪MⅡ期卵母细胞透明带及细胞膜损伤,微绒毛严重损伤甚至消失,皮质颗粒排列在质膜下且数量减少,脂滴形态破坏、形成空泡,内质网与脂滴的联系损坏,线粒体肿胀、嵴不明显;彗星电泳发现,与对照组相比,冷冻液处理组头部DNA、尾部DNA和Olive尾矩值均差异不显著（P>0.05）,有彗星拖尾现象;冷冻组头部DNA损伤、尾部DNA损伤与Olive尾矩值均显著高于冷冻液处理组和对照组（P<0.05）,有明显彗星拖尾现象。结果表明,以二甲基亚砜（DMSO）和乙二醇（EG）为主要成分的冷冻液适于猪MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻;玻璃化冷冻对猪MⅡ期卵母细胞超微结构及其DNA存在一定损伤作用,其损伤机制有待进一步研究。     

3种冷冻方法对猪MⅡ期卵母细胞线粒体分布和损伤的影响

本研究旨在探讨3种冷冻方法对猪MⅡ期卵母细胞玻璃化冷冻后线粒体的分布和超微结构变化的影响.通过透射电镜、Rhodamine-123 (R-123)荧光染色和体外发育观察,结果显示,(1)无论是FDA-DAPI复染存活率,还是孤雌激活卵裂率,CLV (Cryoloop vitrification)法(72.00%,7.22％)效果最好,OPS(Open Pulled Straw)法(60.00％,4.85％)次之,straw法(42.22％,0％)最低;(2)CLV法经R-123染色后,卵母细胞线粒体的正常分布率(52.24％)要比其它2组要高(OPS,48.65％;straw,37.68%),但三者之间没有显著差异(P＞0.05);(3)透射电镜超微结构表明,冻后卵母细胞线粒体变得粗糙和模糊,有的线粒体嵴减少甚至消失.结果表明,冷冻过程中卵母细胞线粒体的分布和形态损伤严重,CLV法可提高冷冻速率,增强冻后卵母细胞的发育能力,降低冷冻造成的卵母细胞线粒体异常分布比例.     

玻璃化冷冻对小鼠GV期卵母细胞发育能力的影响

试验首次采用OPS法玻璃化冷冻小鼠GV期卵母细胞(不带卵丘细胞,下同),同时尝试用EDFS30对小鼠卵巢进行细管法玻璃化冷冻,以研究GV期卵母细胞冷冻后的发育潜力。首先,利用MEM培养和MEM-腔前卵泡培养新鲜GV期卵母细胞,并把较好的培养方式用于冷冻后培养试验。2种培养方式培养24h后新鲜GV期卵母细胞成熟率无显著性差异;OPS法冷冻的GV期卵母细胞解冻后成熟率及体外受精后卵裂率与对照组差异不显著(P>0.05)。细管法冷冻卵巢组织的GV期卵母细胞成熟率极显著低于对照组(P<0.01),其受精后未获得受精卵。结果表明:OPS法可有效地冷冻保存小鼠GV期卵母细胞,而细管法冷冻小鼠卵巢对GV期卵母细胞损伤较大。     

哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究进展

综述了近年来关于哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究进展,并对这项技术的发展前景进行展望。重点讨论了影响哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存的几种因素,包括冷冻保护剂的种类和浓度、冷冻方法和卵母细胞所处的发育阶段等,以及冷冻过程中细胞膜、微丝、微管、皮质颗粒、纺锤体和线粒体等出现的损伤。目前,玻璃化冷冻法存在的最主要问题是冷冻过程中造成超微结构不可逆转的损伤影响胚胎发育,亟待解决。     

哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究进展

综述了近年来关于哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存的研究进展,并对这项技术的发展前景进行展望.重点讨论了影响哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻保存的几种因素,包括冷冻保护剂的种类和浓度、冷冻方法和卵母细胞所处的发育阶段等,以及冷冻过程中细胞膜、微丝、微管、皮质颗粒、纺锤体和线粒体等出现的损伤.目前,玻璃化冷冻法存在的最主要问题是冷冻过程中造成超微结构不可逆转的损伤影响胚胎发育,亟待解决.     

家兔卵母细胞玻璃化冷冻试验

本试验采用玻璃化冷冻保存方法,对162个成熟的家兔卵母细胞进行冷冻,解冻后体外受精。卵裂率为37%、桑椹胚率为26%、囊胚率为17%,试验结果与对照组比较差异较大。说明家兔卵母细胞的玻璃化冷冻效果一般,仍需进一步研究。     

玻璃化冷冻对猪卵母细胞超微结构的影响

本研究以GV期和MII期卵母细胞作为试验材料,通过透射电镜方法观察卵母细胞冷冻前后的超微结构变化,结果发现,透射电镜下观察卵母细胞发现,GV期卵母细胞与透明带连接紧密,微绒毛伸入透明带中,皮质区分布大量的线粒体。脂滴分为两种,一种为灰色脂滴,一种为深色脂滴。MII期卵母细胞排出第一极体,质膜下分布大量的皮质颗粒。微绒毛缩短成矮柱状,线粒体常聚集存在,卵周隙出现。冻后GV期卵母细胞微绒毛消失,线粒体肿胀,线粒体内有囊泡样结构,包围脂滴的内质网不完整,胞质内溶解为絮状,未见高尔基体。冻后MII期卵母细胞透明带损伤、微绒毛、细胞膜损伤甚至消失、极少量皮质颗粒分布于皮质区。脂滴部分溶解,相互连接,脂滴周围伴随大量肿胀呈圆形的线粒体,嵴不明显,内呈囊泡样,未见到高尔基复合体结构。     

玻璃化冷冻对小鼠卵母细胞超微结构的影响

以小鼠卵母细胞作为试验材料,通过透射电镜方法观察玻璃化冷冻对卵母细胞超微结构的影响,初步探讨玻璃化冷冻损伤机理。结果发现:暴露组卵母细胞除有少量线粒体受到损伤,变得粗糙模糊外,其它无明显变化;冷冻组卵母细胞冻融后有不同程度的结构损伤,主要表现为胞质中的中间纤维解体,微绒毛变短甚至缺失,线粒体粗糙模糊,胞质外围皮质颗粒数量减少,透明带变得模糊不清、有的地方甚至已经破裂,细胞基质出现大量空泡,并形成有线粒体-空泡复合体。结果提示,玻璃化冷冻会对卵母细胞超微结构产生一定的损伤,这主要是由于玻璃化冷冻过程中机械损伤造成的。     

玻璃化冷冻山羊卵母细胞效果研究

为了提高玻璃化冷冻保存山羊卵母细胞的效果,试验用不含Ca2+的玻璃化冷冻液1[30%乙二醇(EG)]、玻璃化冷冻液2[27.5%EG+2.5%二甲基亚砜(DMSO)]和玻璃化冷冻液3(25%EG+5%DMSO)研究抗冻保护剂DMSO和EG的不同浓度配比对山羊卵母细胞形态正常率、孤雌激活率、体外受精卵裂率及胚胎发育能力的影响。结果表明:山羊卵母细胞经玻璃化冷冻液1,2,3处理后细胞形态正常率(97.1%、97.3%、97.3%)与对照组(100%)相比有所降低,但差异不显著(P>0.05),且对卵母细胞均不产生具有化学毒性作用的孤雌激活;山羊卵母细胞经3种玻璃化冷冻液冷冻保存后,玻璃化冷冻液2冷冻保存卵母细胞的囊胚率(13.8%)显著高于玻璃化冷冻液1(5.7%)和玻璃化冷冻液3(5.1%)(P<0.05)。说明采用玻璃化冷冻液2冷冻保存山羊卵母细胞可获得较为理想的效果。     

玻璃化冷冻对哺乳动物卵母细胞Ca2+的影响机制

卵母细胞冷冻保存是胚胎生物技术(如体外受精、胞浆内单精子注射、体细胞克隆)的重要组成部分,对优良种畜和濒危动物种质资源保存,加速家畜品种改良进程都具有重要意义。与常规冷冻法相比,玻璃化冷冻具有操作简单、降温速率快、耗时短、冷冻效率高等优点,被越来越广泛地应用于家畜卵母细胞的冷冻保存。然而,与新鲜卵母细胞相比,玻璃化冷冻卵母细胞的受精率及发育能力仍不理想,这严重影响了玻璃化冷冻卵母细胞的应用潜力。玻璃化冷冻会引起卵母细胞Ca²⁺浓度升高及钙振荡模式异常,导致其透明带硬化、受精信号紊乱等问题。综合前人研究进展,作者分析了玻璃化冷冻对胞内Ca²⁺浓度、钙振荡模式的影响和作用机制,并指出胞外Ca²⁺内流和胞内钙库Ca²⁺释放是导致冷冻卵母细胞胞内Ca²⁺浓度升高的主要原因,1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)Ⅰ型受体分布异常和线粒体损伤可能是导致冷冻卵母细胞钙振荡模式异常的重要原因,以期为正向调控冷冻卵母细胞Ca²⁺浓度及钙振荡模式提供技术参考,从而进一步提高玻璃化冷冻卵母细胞的受精和后续的发育能力。     

不同冷冻载体对牛未成熟卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响

为了研究不同冷冻载体制备方法及其对牛未成熟卵母细胞发育能力的影响,以牛未成熟卵母细胞为实验材料,分别探究开放式拉长细管(OPS,open pulled straw)和玻璃微管(GMP,glass micropipette)的制备方法,并以OPS、GMP和冷冻叶片为冷冻载体玻璃化冷冻牛未成熟卵母细胞,解冻后经体外成熟培养和体外受精,统计形态正常率、成熟率、卵裂率及囊胚率。结果显示:以简易小酒精灯为热源,以细管为原材料可以制备出适用的OPS冷冻载体;以酒精喷灯为热源,以细玻璃管为原材料可以制备出适用的GMP冷冻载体。OPS和GMP组形态正常率分别为(74.3%±1.8)%和(72.5%±2.6)%;无显著差异(P0.05),上述二组均显著低于冷冻叶片组(82.1%±1.3)%,P0.05,但三组间成熟率、卵裂率和囊胚率均无显著差异(P0.05)。研究表明,分别以简易小酒精灯和酒精喷灯为热源,以细管和细玻璃管为原材料可以成功制备出OPS和GMP载体;以OPS、GMP和冷冻叶片为冷冻载体均可成功地玻璃化冷冻牛未成熟卵母细胞。     

GMP玻璃化冷冻水牛GV期和MⅡ期卵母细胞

采用玻璃微细管法(Glass micropipette vitrification,GMP)冷冻了水牛GV期和MⅡ期卵母细胞。结果显示,GV期冻后卵母细胞的形态正常率,孤雌激活后的发育潜力均明显低于未冷冻组(P<0.05)。在进一步探讨不同发育阶段的水牛卵母细胞冷冻保存效果中发现,GV期卵母细胞的形态正常率,体外成熟后的孤雌激活分裂率和8-细胞率显著低于MⅡ期(P<0.05)。结果表明,水牛GV期卵母细胞冷冻的效果比MⅡ期差。     

牛卵母细胞的玻璃化冷冻研究

本试验通过牛卵母细胞玻璃化冷冻过程中采用载体、冷冻时卵母细胞所带颗粒细胞层数和其成熟培养时间这3个方面对牛卵母细胞的玻璃化冷冻进行了探讨。(1)不同载体的对比:玻璃OPS管和塑料OPS管冷冻效果较好。玻璃OPS管冷冻卵母细胞,解冻后形态正常率、体外受精后卵裂率和囊胚率分别为91.2%、41.3%和14.52%。塑料OPS管冷冻卵母细胞,解冻后形态正常率、体外受精后卵裂率和囊胚率分别为89.09%、40.90%和14.54%。(2)保留2￣3层颗粒细胞的卵母细胞玻璃化冷冻的冷冻效果较好,其冷冻解冻后形态正常率、体外受精后卵裂率和囊胚率分别为90.79%、40.13%和15.13%。(3)体外成熟培养22h的卵母细胞冷冻效果较好,其冷冻解冻后形态正常率、体外受精后卵裂率和囊胚率分别为94.14%、41.80%和15.23%。     

玻璃化冷冻保存小鼠生发泡期卵母细胞的研究

试验探讨了卵母细胞形态、基础液等因素对小鼠生发泡期卵母细胞冷冻效果的影响,目的在于筛选适合超低温冷冻保存小鼠卵母细胞的冷冻程序。通过这一途径可望建立卵母细胞种子库,并为体外受精、卵核移植和体细胞的克隆研究与应用提供。试验材料。试验结果：①COC组、DO组卵裂率分别是23.17％、30．96％。差异不显著0P〉0．05）。两者都与对照组（60.00％）差异显著（P〈0.01）。②用DMEM（31.25％）和DPBS液（30．28％）作为玻璃化冷冻液的基础液效果差异不显著（P＞0.05）。     

紫杉醇预处理对猪体外成熟卵母细胞玻璃化冷冻的影响

为了提高猪成熟卵母细胞细胞玻璃化冷冻效果.本试验拟添加紫杉醇,比较其对冷冻环冷冻效果的影响.结果显示使用1.0μmolL~(-1)紫杉醇预处理卵母细胞,冷冻后其形态完整率(89.93%)和FDA染色存活率(83.33%)都显著高于未处理组的79.12%和70.97%(P＜0.05),继续提高紫杉醇浓度则表现为对卵母细胞的毒副作用.在不同预处理时间上,预处理30 min组冷冻后卵母细胞形态完整率和FDA染色存活率最高,分别达到90.21%和84.13%.预处理浓度1.0μmol·L~(-1),30 min是比较合适的处理方法;紫杉醇、细胞松弛素B(CB)或两者联合添加能显著提高猪成熟卵母细胞的玻璃化冷冻的效果(P＜0.05),但两者之间没有显著差异(P＞0.05).     

绵羊卵母细胞的玻璃化冷冻保存

玻璃化法是近几年才建立起来的一种细胞、胚胎及卵母细胞的冷冻保存技术。Nekagata和Shaw分别于1989年和1991年用此化法冷冻保存小鼠成熟卵母细胞,取得理想结果。本实验对玻璃化法冷冻保存绵羊卵巢内卵母细胞作了尝试。1 材料与方法从屠宰后东北细毛羊取出卵巢,用注射器从直径2～6mm的卵泡中抽取卵丘—卵母细胞复合体,选择正常的用成熟培养液(M199+10%FCS)洗2次后,转入VS_1(20.5%(w/v)二甲基亚砜,     

细胞松弛素B对牛GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果的影响

本试验通过玻璃化冷冻前不同浓度细胞松弛素B(cytochalasin-B,CB)预处理来分析CB对牛GV期卵母细胞固体表面玻璃化(SSV)冷冻后发育潜力的影响。试验结果表明,玻璃化冷冻后,CB处理组和未处理组之间卵母细胞成熟率差异不显著(P>0.05),但均显著低于体外培养组。说明试验中所用CB浓度 (2.5、7.5、15、20和30 μg/mL)对牛GV期卵母细胞玻璃化冷冻效果的改善作用不明显。     

玻璃化冷冻对家畜卵母细胞细胞生物学性状影响的研究进展

卵母细胞玻璃化冷冻技术在保存母畜生育力、加速育种过程中发挥重要作用。相较于新鲜卵母细胞,玻璃化冷冻会造成卵母细胞细胞核混乱无序、成熟率降低、细胞质分布变化、脂质结构变化和高活性氧水平、细胞器线粒体分布异常、氧化系统和抗氧化系统异常以及膜电位降低、微管微丝排列混乱、纺锤体结构损坏以及使重要蛋白变化和一些分子发生改变。本文从细胞生物学角度探讨玻璃化冷冻对卵母细胞造成的细胞核紊乱、线粒体膜电位降低、皮质颗粒缺失等损伤,为高效玻璃化冷冻液和冷冻程序的开发、改善玻璃化冷冻卵母细胞后续发育潜力提供参考。