一株丁酸梭菌的分离鉴定及其益生特性研究

本研究探索了丁酸梭菌分离株的益生特性，旨在为其在仔猪日粮中的应用提供理论依据。利用常规方法分离丁酸梭菌并进行纯培养，经生化检测和16S rRNA基因测序，对分离菌株进行鉴定；采用活菌计数法和牛津杯法研究分离株培养上清对3种致病菌的抑制作用、分离株黏附猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）的特性及其对致病菌黏附细胞的抑制作用；采用细胞计数法研究分离株对IPEC-J2生长的影响；采用ELISA检测分离株处理细胞后培养上清液中细胞因子水平。结果表明，本研究成功分离到一株丁酸梭菌。与对照组相比，丁酸梭菌培养上清对3种致病菌生长抑制效果均显著（P<0.05）；丁酸梭菌可黏附于IPEC-J2，并且黏附效果最佳的感染复数（MOI）为50，最适处理时长为3 h；丁酸梭菌对3种致病菌黏附IPEC-J2均具有显著抑制作用（P<0.05）；丁酸梭菌MOI为1、10和50时细胞生长正常、形态完好，MOI为100时IPEC-J2生长受到显著抑制，同时出现部分细胞死亡；MOI为1时细胞因子水平无差异，MOI为10、50和100时细胞因子水平均显著增高（P<0.05）。综上所述，本研究分离的一株丁酸梭菌具有较好的益生特性，为其在生产中的应用提供了理论依据。     

三株乳酸杆菌的分离鉴定与益生特性研究

本研究通过分离鉴定猪肠道内乳酸杆菌并对其益生特性进行比较分析,旨在为乳酸杆菌在仔猪饲粮中的应用提供科学依据。试验选取健康猪粪便,利用选择性培养基进行厌氧培养和单克隆纯化,共获得三株乳酸杆菌,通过生化鉴定、16Sr RNA基因序列测定和同源性分析,确定分离菌株分别为植物乳杆菌、唾液乳杆菌、嗜酸乳杆菌;采用牛津杯法、活菌计数法和细胞试验等研究三株乳酸杆菌体外抑菌活性、黏附性及竞争性黏附猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)的益生特性。结果表明:与对照组相比,三株乳酸杆菌培养上清液的抑菌圈直径(P0.01)和抑菌效果(P0.01)差异均极显著,并且以植物乳杆菌培养上清液的抗菌效果为最佳;三株乳酸杆菌均可黏附于IPEC-J2细胞,并且以植物乳杆菌黏附IPEC-J2的菌数为最多;与对照组相比,三株乳酸杆菌对大肠杆菌黏附IPEC-J2细胞均具有抑制作用(P0.01),并且以植物乳杆菌抑制黏附的效果最好。     

丁酸梭菌对肠道上皮细胞黏附及对鳗弧菌抑制的研究

本试验以鱼肠道上皮细胞为模型,以肠道的致病鳗弧菌为对照,研究了丁酸梭菌对鱼肠道上皮细胞的黏附作用及黏附对细胞的损伤和成活率的影响。结果表明∶丁酸梭菌对鱼的肠道上皮的黏附率为7.39±1.85,低于鳗弧菌的黏附率(P<0.05);对细胞的损伤率为1.02±0.35,显著低于鳗弧菌对细胞的损伤率(P<0.05);黏附后丁酸梭菌组对细胞的成活率的影响与正常对照组比较,差异不显著;当酪酸菌、鳗弧菌与肠道上皮细胞共同培养时,使鳗弧菌的黏附率下降7.03%(P<0.05)。因此,该株丁酸梭菌可以安全地黏附鱼肠道上皮细胞,并能有效抑制鳗弧菌的黏附。     

产抑菌蛋白的丁酸梭菌的筛选和鉴定及体外益生功能研究

试验旨在筛选产高效抑菌蛋白的丁酸梭菌,并研究其体外生物学特性,为其在动物生产中的应用奠定基础。采用厌氧培养法进行菌种分离,孔穴琼脂扩散法进行抑菌活性筛选,并通过形态学、生理生化特性和16S r DNA基因序列同源性分析进行菌种鉴定。选取丁酸梭菌ZJU-1进行体外抗逆性和益生功能研究,采用试剂盒进行酶活测定,顶空-气相色谱发测定挥发性脂肪酸。结果表明:从盲肠内容物中分离到6株丁酸梭菌,其中3株菌种对大肠杆菌K88、金黄色葡萄球菌ATCC25923均具有明显抑制作用。目标菌株ZJU-F1经鉴定结果为丁酸梭菌。丁酸梭菌ZJU-F1具有较好人工胃液、人工肠液、胆盐和抗生素耐受性;分泌淀粉酶和蛋白酶,活性分别达2 515.43 U/m L和93.72 U/m L;并具有分泌挥发性脂肪酸的功能,其中乙酸和丁酸的分泌量分别达2.29 g/L和1.87g/L。本试验获得的丁酸梭菌ZJU-F1具有较强的抗逆性和益生功能,作为潜在的抗生素替代物具有巨大的开发利用价值.     

益生菌大肠杆菌Nissle 1917抗逆性能、猪肠上皮细胞黏附率及抑菌效果研究

本试验旨在研究益生菌大肠杆菌Nissle 1917(Ec N)抗逆性能、猪肠上皮细胞黏附率及抑菌效果。采用体外法对Ec N进行生长曲线绘制和耐酸、耐胆盐、耐热性能的测定;以猪肠上皮细胞IPEC-J2细胞为体外细胞模型,考察了Ec N对该细胞的黏附率以及对致病菌大肠杆菌K88的黏附抑制率;同时通过蛋白质印迹法检测了Ec N对IPEC-J2细胞β-防御素-2和Toll样受体4的水平的影响。结果表明:1)Ec N对高酸、高胆盐和高温环境具有一定耐受能力。2)Ec N对IPEC-J2细胞的黏附作用以对数期最佳,黏附率达33.96%,显著高于迟缓期、稳定期和衰亡期(P0.05)。3)Ec N对致病菌大肠杆菌K88具有良好的抑制效果,黏附抑制率达87.84%。4)Ec N还能上调IPEC-J2细胞β-防御素-2和Toll样受体4水平。结果提示,益生菌Ec N具有较好的抗逆性能,能够良好地黏附猪肠上皮细胞,对致病菌大肠杆菌K88具有良好的抑制作用。     

丁酸梭菌对肉仔鸡肠道致病菌抑菌作用研究

试验旨在通过体外抑菌试验对丁酸梭菌发酵液上清的抑菌效果及抑菌机理进行探索。分别用丁酸梭菌发酵液上清、排酸及过氧化氢酶、胰蛋白酶、蛋白酶K处理后的发酵上清分别对大肠埃希氏菌、铜绿假单胞杆菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、产气荚膜梭菌进行牛津杯法体外抑菌试验。结果显示:丁酸梭菌发酵液上清对试验选取的5种肠道致病菌均有明显的抑制作用;发酵液上清经蛋白酶处理后,抑菌圈消失。表明:丁酸梭菌发酵液上清对肠道致病菌具有抑制作用,其中起到抑菌作用的为有机酸、蛋白或多肽类物质。     

肠炎沙门菌SEF14菌毛与肠上皮细胞IPEC-J2和Caco-2的体外黏附作用研究

为研究肠炎沙门菌SEF14菌毛对肠上皮细胞的黏附作用,本试验利用肠炎沙门菌50336株、突变株50336△sefA、50336△sefD以及互补株50336△sefA (pBRA)、50336△sefD (pACYCD)与肠上皮细胞系细胞(IPEC-J2和Caco-2)进行了黏附作用.结果显示:上述菌株均能与IPEC-J2、Caco-2细胞进行有效黏附,并且随时间延长黏附数量有所增多,相同时间各菌株与IPEC-J2细胞的黏附数量明显多于Caco-2细胞;但细菌和细胞共感染1和4h后,肠炎沙门菌野生株、相应的突变株和互补株与IPEC-J2和Caco-2细胞黏附的数量差别很小,未到达显著差异水平(P＞0.05).结果表明:SEF14菌毛并不特异性介导肠炎沙门菌与肠上皮细胞系IPEC-J2和Caco-2的黏附作用,或者不是介导黏附作用的主要因子.     

丁酸梭菌对致病菌和有益菌的体外作用效果研究

试验研究了丁酸梭菌在体外对致病菌的抑制作用和对有益菌的增殖作用。将丁酸梭菌分别与大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌、乳酸杆菌、双歧杆菌按不同的比例混合后进行培养,并与菌种单独培养进行比较。结果表明:培养36～48 h,联合培养组大肠杆菌、沙门氏菌、产气荚膜梭菌菌数均显著低于单独培养组;菌数比例为(1～100)∶1至100∶1时,丁酸梭菌对沙门氏菌均有较强的抑菌作用;菌数比例为100∶1时,丁酸梭菌对大肠杆菌和产气荚膜梭菌抑菌作用较强;菌数比例为10∶1时,丁酸梭菌对乳酸杆菌和双歧杆菌的增殖效果最好。联合培养8 h后,菌数比例为10∶1时,丁酸梭菌对双歧杆菌有显著的增殖效果。     

黏附与聚集、抗肿瘤及抗菌特性乳杆菌的筛选

为获得具有高黏附与聚集、抗肿瘤及抗菌特性的益生乳杆菌,本研究以10株经16s r DNA鉴定的乳杆菌为候选菌,以结肠癌HT-29细胞为体外模型研究其黏附能力和抗肿瘤特性及其黏附能力与自聚集能力的相关性。将乳杆菌与致病性大肠埃希氏菌、鸡白痢沙门氏菌及金黄色葡萄球菌分别共孵育,探究了乳杆菌的共聚集能力与抗菌能力。结果显示:有6株乳杆菌的自聚集能力在20%以上;4株乳杆菌粘附内化HT-29细胞的内化率超过5%,经荧光显微镜观察,菌株Lac.99对HT-29细胞具有最强的黏附特性;菌株Lac.117和Lac.56对HT-29细胞的生长具有较好的抑制作用;4株乳杆菌对指示致病菌具有较强的拮抗作用,其中Lac.117菌株作用最强。综上所述,候选菌株中Lac.56在黏附、抗菌和抗肿瘤方面均表现出良好的益生特性,本实验为进一步研究和开发具有潜在应用价值的益生菌制剂提供了依据。     

富马酸与肉桂醛联用调节产肠毒素型大肠杆菌诱导猪肠上皮细胞氧化应激的分子机制

本试验旨在研究富马酸（FA）与肉桂醛（CA）联用调节产肠毒素型大肠杆菌（ETEC）K88诱导猪肠上皮细胞IPEC-J2氧化应激的分子机制。试验选用IPEC-J2细胞建立氧化损伤模型,用不同浓度FA和CA处理IPEC-J2细胞12和24 h,并用CCK-8法检测细胞活力,确定最佳处理浓度和时间;以最佳处理浓度的FA和CA预处理细胞,ETEC K88感染细胞3、6、12和24 h,检测其活菌黏附率,采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测细胞因子含量和抗氧化指标,并用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)测定热休克蛋白70(Hsp70)和核因子-κB(NF-κB)信号通路相关基因mRNA相对表达量。结果表明：1) FA和CA的最佳处理浓度分别为1.00 mg/mL和1.00μL/mL,最适培养时间为12 h。2）添加FA和CA可有效抑制ETEC K88黏附IPEC-J2细胞,当ETEC K88感染细胞3 h时其黏附率显著下降（P<0.05）,6、12和24 h时极显著下降（P<0.01）。3）添加FA和CA可极显著降低ETEC K88感染细胞中促炎性细胞因子白细胞介素-8(IL-8...     

丁酸梭菌对产肠毒素大肠杆菌刺激猪肠道上皮细胞炎症反应的抑制效果

本试验旨在通过丁酸梭菌(CB)、产肠毒素大肠杆菌(ETEC)和猪肠道上皮细胞(IPEC-J2细胞)共培养细胞模型,探讨CB对ETEC产黏附基因、产肠毒素基因以及ETEC刺激IPEC-J2细胞炎症相关因子表达的影响。试验设5组,分别为对照组、ETEC组、ETEC+CB 106组、ETEC+CB 107组、ETEC+CB 108组。ETEC组在IPEC-J2细胞培养液中加入1×108CFU/mL的ETEC,ETEC+CB 106组、ETEC+CB 107组、ETEC+CB 108组在IPEC-J2细胞培养液中加入1×108CFU/mL ETEC的同时分别加入1×106、1×107和1×108CFU/mL CB,对照组IPEC-J2细胞培养液中不添加ETEC和CB,37℃培养2 h后用显微镜观察细胞形态并收集细胞。采用实时定量PCR分析ETEC产黏附基因FaeG与肠毒素基因estA、estB及IPEC-J2细胞中促炎性因子白细胞介素(IL)-1β、IL-2、IL-6、IL-8与抗炎性因子IL-10 mRNA的相对表达水平。结果显示:CB可有效抑制ETEC诱导的IPEC-J2细胞损伤脱落。与ETEC组对比,不同浓度CB干预后显著抑制了ETEC产黏附基因FaeG与肠毒素基因estA、estB的表达(P0.05),且CB浓度为1×108CFU/mL时效果最明显。与对照组相比,ETEC组IPEC-J2细胞中促炎性因子IL-1β、IL-2、IL-6和IL-8 mRNA的相对表达水平显著升高(P0.05),抗炎性因子IL-10 mRNA的相对表达水平显著降低(P0.05)。而添加不同浓度CB干预后,IPEC-J2细胞中IL-1β、IL-2、IL-6和IL-8 mRNA的相对表达水平较ETEC组显著降低(P0.05),IL-10 mRNA的相对表达水平则较ETEC组显著升高(P0.05),其中CB浓度为1×108CFU/mL时对IL-1β、IL-6和IL-8表达的抑制效果最强,浓度为1×107CFU/mL时对IL-2表达的抑制效果最强。以上结果表明,CB可降低ETEC黏附基因和产肠毒素基因表达,抑制ETEC诱导的猪肠道上皮细胞的炎症反应,降低ETEC对猪肠道上皮细胞的损伤作用。     

兼具抑菌与抗氧化活性的丁酸梭菌的分离筛选

本试验使用形态学鉴定、16S rRNA等分子生物学鉴定方法,结合丁酸梭菌（Clostridium butyricum,C.butyricum）产丁酸、产气等特性,旨在从健康动物粪便、瘤胃液和窖泥等样本中分离筛选具有益生潜力的C.butyricum,并通过产酸能力、抑菌性能、产酶活力、抗氧化能力和体外发酵生物量比较,最终得到2株兼具抑菌和抗氧化活性的C. butyricum。结果表明：本试验筛选分离的8株C. butyricum均能在体外产乙酸、丁酸,其培养上清液均能抑制沙门氏菌ATCC 14028、沙门氏菌CVCC 519和产气荚膜梭菌CVCC 2030的生长。通过进一步评估筛选得到C. butyricum XMC 312和C. butyricum SWY 13,该2株菌能分泌纤维素酶,分别达10.24 U/mL和16.90 U/mL,同时可以清除DPPH自由基,相当于0.125 g/L维生素C的清除力。本试验获得的C.butyricum具备良好的益生性能,用于饲料微生态制剂的开发制备,具有强大的市场前景。     

圈养非人灵长类乳酸杆菌的分离筛选和功能鉴定

乳酸杆菌对于动物的肠道健康有着非常重要的作用。为研究圈养非人灵长类动物肠道乳酸杆菌,无菌采集不同品种的表观健康的圈养灵长类动物新鲜粪便,进行乳酸杆菌的分离培养及纯化,并通过耐酸耐胆盐试验、细胞黏附试验和对大肠杆菌抑菌试验,对其进行生物学特性研究。结果显示:共分离得到17株乳酸杆菌,有3株菌Lac5-2、Lac5-4、Lac6-2在pH 3.0和胆盐浓度0.5%时表现出良好耐酸耐胆盐性能,且无耐药性。其中菌株Lac6-2黏附性及对大肠杆菌的黏附抑制性均较好,黏附率为16.2%(MOI=100),黏附抑制率为85.5%(MOI=10)。经16S r DNA测序,Lac5-2、Lac5-4、Lac6-2均为罗伊氏乳酸杆菌。最终确定菌株Lac6-2为候选优势益生菌株。该研究为利用乳酸杆菌防治圈养野生动物消化道疾病提供基础。     

不同氧需求特性菌株在模拟肠道厌氧条件下的增殖

文章旨在研究丁酸梭菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌3种典型的不同氧需求特性益生菌在模拟肠道条件下的增殖情况,为益生菌在动物生理条件下的应用提供试验依据。将冻存的丁酸梭菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌活化后,初始菌数分别为104、106、106 cfu/ml,接种至相应的培养基中,维持pH值,置于厌氧培养箱中进行培养,每隔特定时间测定一次菌数,直至菌数不再变化时停止检测,作菌株生长曲线。试验结果表明:枯草芽孢杆菌维持在106数量级,几乎不能生长繁殖;地衣芽孢杆菌由106数量级增殖到108数量级,在培养20 h时接近增殖高峰;丁酸梭菌由104数量级迅速增殖到108数量级,在培养12 h时接近增殖高峰。由试验可以得出:丁酸梭菌更适合动物肠道厌氧环境,可在动物肠道迅速大量增殖代谢,最大限度发挥益生作用。     

丁酸梭菌的生物学功能及其在家禽生产中应用的研究进展

丁酸梭菌作为一种益生菌,存在于人和动物肠道内,具有安全、耐高温、耐胃酸、耐胆盐等生物学特性。丁酸梭菌可提高动物生长和生产性能,调节肠道微生态平衡,增强动物免疫功能,改善畜禽产品品质和风味等。丁酸梭菌凭借其良好的益生特性,现已广泛应用于农业、畜牧、医药、食品化工等领域。文章重点阐述丁酸梭菌的生物学功能及其在家禽生产中的应用研究进展,以期为丁酸梭菌更好地应用于家禽养殖提供参考。     

一株小反刍兽疫病毒的分离鉴定与生长曲线测定

将含高滴度小反刍兽疫病毒的新鲜病料研磨后接种VERO DS细胞系进行病毒分离,出现细胞病变后连续传代,取3代以上培养物,进行RT-PCR和间接免疫荧光试验及生长曲线测定。生长曲线测定分别以0.01和0.1 MOI接种VERO DS细胞,每隔12h测定病毒滴度,连续培养168h,绘制病毒生长曲线,分析生长特性。结果显示,病料接种细胞72h后,出现细胞病变,经RT-PCR和间接免疫荧光试验鉴定为小反刍兽疫病毒?;生长特性研究显示,0.01和0.1 MOI两种病毒接种量,病毒滴度最高均为106 TCID50左右,但峰值出现时间和下降速度存在差异,0.01 MOI接种量出现峰值晚,但是维持高滴度时间较长。本文成功分离一株小反刍兽疫病毒,并对两种接毒量的生长特性差异进行了初步分析,为探索该病毒培养方法和收毒时间提供了借鉴。     

女贞子多糖对IPEC-J2细胞活力的影响

为了筛选女贞子多糖对IPEC-J2细胞活力影响的最佳剂量,并对其毒性进行评价,试验首先采用细胞计数法和MTT法绘制IPEC-J2细胞7 d的生长曲线,然后用梯度浓度的女贞子多糖刺激IPEC-J2细胞24 h,用MTT法检测细胞活力。结果表明:细胞生长稳定,生长曲线第4～7天为明显的对数生长期;0.1～10 mg/mL的女贞子多糖对IPEC-J2细胞活力有明显促进作用,其中1 mg/mL的女贞子多糖效果最好(P0.01)。说明女贞子多糖对IPEC-J2细胞活力有促进作用,且安全范围广。     

丁酸梭菌的筛选、鉴定及生物学功能分析

本试验从鸡的新鲜粪便和盲肠内容物中分离到4株形态与丁酸梭菌相似的菌株，经过生理生化鉴定和16S rDNA序列分析鉴定出3株丁酸梭菌，分别命名为C1-001、C1-002和C1-003|研究3株菌的生物学特性发现：其均对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和宋内志贺氏菌等肠内致病菌有抑菌作用，C1-001抑菌性能最优|均能产丁酸、乙酸以及可促进饲料消化吸收的α-淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶，除了脂肪酶外，C1-001产酸及产酶效果最显著|均可耐受人工肠液和人工胃液至少2.5 h，C1-001耐受性最优。 [关键词] 丁酸梭菌|筛选|鉴定|生物学功能     

不同功能性寡糖对细菌增殖与黏附性影响

本试验旨在研究不同功能性寡糖对乳酸杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌增殖的影响及大肠杆菌、沙门氏菌对猪空肠上皮细胞(IPEC-J2)黏附性的影响。试验用8种功能性寡糖以0.25%的添加量分别增殖干酪乳杆菌、植物乳杆菌、大肠杆菌和沙门氏菌,测定其对增殖的影响;并以IPEC-J2作为体外模型,通过菌落计数的方法,研究不同功能性寡糖对大肠杆菌、沙门氏菌黏附IPEC-J2的影响。结果表明:1) 8种功能性寡糖对细菌的增殖作用有差异,果寡糖对有益菌的增殖效果最显著,且对有害菌增殖效果最低并有一定抑制生长的趋势。2) 8种功能性寡糖均能显著降低大肠杆菌和沙门氏菌对IPEC-J2的黏附性(P<0.05),其中甘露寡糖对沙门氏菌的黏附抑制作用最好,果寡糖则对大肠杆菌黏附抑制作用最明显。由此可见,在本试验条件下,功能性寡糖不仅能够促进有益菌大量增殖,而且对有害菌增殖也有一定促进作用,且不同功能性寡糖对细菌的促进作用差异显著; 8种功能性寡糖能够显著抑制大肠杆菌、沙门氏菌对肠道上皮细胞黏附的作用。     

蓝狐源约氏乳杆菌菌株ZJBF004分离鉴定与体外益生潜能的评价

为获得犬科动物源乳酸菌并对其益生潜能进行评价,本研究通过测定生长曲线、产酸能力、对低pH和高胆盐环境的耐受性、在体外模拟胃肠道溶液中的存活能力、抑菌能力、抗生素抗性、对蓝狐小肠上皮原代细胞的黏附能力及抗氧化性评价了菌株ZJBF004的益生特性。结果表明:利用固体乳酸细菌培养基从蓝狐的肠道内容物中分离到1株优势乳酸菌,将其命名为菌株ZJBF004,经菌落菌体形态、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析鉴定其为约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)。菌株ZJBF004产酸能力较强且在37℃培养时能迅速进入对数生长期;在pH=5的培养基中耐受6 h时仍能保持较好的生长情况,在胆盐浓度为3 g/L的条件下至少可耐受6 h,且存活率高于70%,在人工模拟胃液和肠液中耐受3 h时存活率高于90%;对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌具有良好的抑菌效果;对蓝狐小肠上皮原代细胞的黏附能力为(18.67±3.12)个/细胞;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除率为28.50%,表明菌株ZJBF004具有一定的抗氧化活性。由此可见,新分离的蓝狐源约氏乳杆菌菌株ZJBF004具有优良的体外益生性能,可作为潜在犬科动物用益生菌进一步研究。