大刺鳅生长激素基因克隆与表达分析

[目的]揭示生长激素(GH)是否能以旁分泌或自分泌方式对大刺鳅(Mastacembelus armatus)的生长和发育起作用,为其生长调节研究积累基础数据.[方法]采用RACE克隆大刺鳅GH基因cDNA序列,并通过实时荧光定量PCR对大刺鳅不同组织及胚胎不同发育时期GH基因的表达情况进行分析.[结果]大刺鳅GH基因cDNA序列全长815 bp,其中,5'端非编码区长33 bp,3'端非编码区长167 bp,开放阅读框(ORF)615 bp,共编码204个氨基酸,GenBank登录号MH885947;大刺鳅GH氨基酸序列的前17个氨基酸残基组成信号肽,也存在4个保守的半胱氨酸残基(69Cys、177Cys、194Cys和202Cys).大刺鳅GH蛋白分子量为23007.33 Da,理论等电点(pI)为6.90,其氨基酸组成中以亮氨酸(Leu)的含量最高(15.7%),丝氨酸(Ser)次之(14.2%),色氨酸(Trp)含量最低(0.5%).大刺鳅GH氨基酸序列与斑鳜(Siniperca scherzeri)、花鲈(Lateolabrax maculatus)和黄鳝(Monopterus albus)的同源性较高,对应的同源性分别为95.59%、95.07%和92.16%;在基于GH氨基酸序列同源性构建的系统发育进化树中,大刺鳅与同属于合鳃目的黄鳝聚为一支,亲缘关系最近.GH基因在大刺鳅不同组织中均有表达,其中以脑组织中的相对表达量最高,而肠道中的相对表达量最低;GH基因在大刺鳅胚胎各发育时期也均有表达,其中以囊胚期的相对表达量最高,而出膜期的相对表达量最低.[结论]大刺鳅GH基因具有高度的保守区域,在各组织中广泛表达,尤其在脑组织中高表达,说明GH是以自分泌或旁分泌方式对大刺鳅生长发挥重要作用,且在胚胎发育过程中对细胞分化具有促进作用.     

大刺鳅人工繁殖与胚胎发育研究

为探究大刺鳅人工繁殖和胚胎发育特性,选择人工培育的3冬龄大刺鳅作亲本,在28～29℃水温下,分2次注射绒毛膜促性腺激素、促黄体素释放激素A2和地欧酮混合物,2次注射间隔时间12 h,第2次注射后12 h开始人工授精.大刺鳅受精卵为沉性卵,具黏性,受精卵吸水膨胀后,卵径为(1.94±0.05)mm.结果显示:大刺鳅催产率为99.20％、受精率为82.77％、孵化率为77.20％、雌鱼平均怀卵量约3036粒/尾;受精卵在水温28～29℃、溶解氧5 mg/L以上、pH值7.2～7.8的条件下,胚胎发育历经受精卵、胚胎隆起、卵裂期(2细胞、4细胞、8细胞、16细胞、多细胞期、桑葚期)、囊胚期(囊胚早期、囊胚中期、囊胚晚期)、原肠胚期(原肠早期、原肠中期、原肠晚期)、神经胚期(神经胚期、胚孔封闭期)、器官形成期(肌节出现期、视泡期、尾芽期、肌肉效应期、心跳期)、出膜期等8个阶段22个时期,总历时约50.5 h,总积温约1454.4℃·h.初孵仔鱼平均全长(6.52±0.05)mm.     

大刺鳅人工繁殖与胚胎发育研究

为探究大刺鳅人工繁殖和胚胎发育特性,选择人工培育的3冬龄大刺鳅作亲本,在28～29℃水温下,分2次注射绒毛膜促性腺激素、促黄体素释放激素A2和地欧酮混合物,2次注射间隔时间12 h,第2次注射后12 h开始人工授精。大刺鳅受精卵为沉性卵,具黏性,受精卵吸水膨胀后,卵径为(1.94±0.05)mm。结果显示:大刺鳅催产率为99.20%、受精率为82.77%、孵化率为77.20%、雌鱼平均怀卵量约3036粒/尾;受精卵在水温28～29℃、溶解氧5 mg/L以上、pH值7.2～7.8的条件下,胚胎发育历经受精卵、胚胎隆起、卵裂期(2细胞、4细胞、8细胞、16细胞、多细胞期、桑葚期)、囊胚期(囊胚早期、囊胚中期、囊胚晚期)、原肠胚期(原肠早期、原肠中期、原肠晚期)、神经胚期(神经胚期、胚孔封闭期)、器官形成期(肌节出现期、视泡期、尾芽期、肌肉效应期、心跳期)、出膜期等8个阶段22个时期,总历时约50.5 h,总积温约1454.4℃·h。初孵仔鱼平均全长(6.52±0.05)mm。     

大珠母贝组织蛋白酶B基因克隆及其表达分析

【目的】分析组织蛋白酶B基因（CatB）在大珠母贝（Pinctada maxima）不同组织中的表达模式,明确CatB在大珠母贝中的功能作用,为培育生长快且抗逆性强的大珠母贝提供基础资料。【方法】利用RACE克隆大珠母贝CatB基因,利用ExPASy ProtParam、ExPASy ProtScale、NPS@SOPMA、SWISS-MODEL及SignalP 4.1等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测CatB基因在大珠母贝外套膜（套膜区、边缘膜区和中央膜区）、肝胰腺、鳃、足和闭壳肌等组织中的表达情况。【结果】大珠母贝CatB基因cDNA序列全长1365 bp,其开放阅读框（ORF）1026 bp,5'非编码区（5'-UTR）长度81 bp,3'非编码区（3'-UTR）长度258 bp,共编码341个氨基酸残基。大珠母贝CatB蛋白分子量为37.73 kD,理论等电点（pI）为6.66,脂溶性系数为67.48,不稳定指数为31.18,亲水性平均系数（GRAVY）为-0.451,为稳定的亲水性蛋白;在第89~337位氨基酸存在一个Pept-C1结构域。大珠母贝CatB蛋白二级结构以无规则卷曲为主,占51.03%,α-螺旋占26.98%,β-转角占9.09%,延伸链占12.90%;三级结构与马氏珠母贝（P.fucata martensii）CatB蛋白结构相似。大珠母贝CatB氨基酸序列与马氏珠母贝CatB氨基酸序列（ADX32985.1）的相似性高达90.91%;与长牡蛎（Crassostrea gigas,XP_011428258.1）、海湾扇贝（Argopecten irradians,ANG56311.1）、褶纹冠蚌（Cristaria plicata,AEF32260.1）的CatB氨基酸序列相似性分别为79.47%、65.38%和62.18%。CatB基因在大珠母贝外套膜的套膜区、边缘膜区和中央膜区及肝胰腺、鳃、足和闭壳肌等7个组织中均有表达,以肝胰腺中的相对表达量最高,显著高于在其他组织中的相对表达量（P<0.05）,其次是外套膜的套膜区和中央膜区。【结论】CatB基因在大珠母贝肝胰腺中高表达,其次是外套膜的套膜区和中央膜区,故推测CatB是通过参与大珠母贝的消化吸收作用而调控其生长代谢过程。     

大刺鳅人工繁殖与胚胎发育研究

为探究大刺鳅人工繁殖和胚胎发育特性,选择人工培育的3冬龄大刺鳅作亲本,在28～29℃水温下,分2次注射绒毛膜促性腺激素、促黄体素释放激素A2和地欧酮混合物,2次注射间隔时间12 h,第2次注射后12 h开始人工授精.大刺鳅受精卵为沉性卵,具黏性,受精卵吸水膨胀后,卵径为(1.94±0.05)mm.结果显示:大刺鳅催产率为99.20％、受精率为82.77％、孵化率为77.20％、雌鱼平均怀卵量约3036粒/尾;受精卵在水温28～29℃、溶解氧5 mg/L以上、pH值7.2～7.8的条件下,胚胎发育历经受精卵、胚胎隆起、卵裂期(2细胞、4细胞、8细胞、16细胞、多细胞期、桑葚期)、囊胚期(囊胚早期、囊胚中期、囊胚晚期)、原肠胚期(原肠早期、原肠中期、原肠晚期)、神经胚期(神经胚期、胚孔封闭期)、器官形成期(肌节出现期、视泡期、尾芽期、肌肉效应期、心跳期)、出膜期等8个阶段22个时期,总历时约50.5 h,总积温约1454.4℃·h.初孵仔鱼平均全长(6.52±0.05)mm.     

大刺鳅人工繁殖与胚胎发育研究

为探究大刺鳅人工繁殖和胚胎发育特性,选择人工培育的3冬龄大刺鳅作亲本,在28～29℃水温下,分2次注射绒毛膜促性腺激素、促黄体素释放激素A2和地欧酮混合物,2次注射间隔时间12 h,第2次注射后12 h开始人工授精.大刺鳅受精卵为沉性卵,具黏性,受精卵吸水膨胀后,卵径为(1.94±0.05)mm.结果显示:大刺鳅催产率为99.20％、受精率为82.77％、孵化率为77.20％、雌鱼平均怀卵量约3036粒/尾;受精卵在水温28～29℃、溶解氧5 mg/L以上、pH值7.2～7.8的条件下,胚胎发育历经受精卵、胚胎隆起、卵裂期(2细胞、4细胞、8细胞、16细胞、多细胞期、桑葚期)、囊胚期(囊胚早期、囊胚中期、囊胚晚期)、原肠胚期(原肠早期、原肠中期、原肠晚期)、神经胚期(神经胚期、胚孔封闭期)、器官形成期(肌节出现期、视泡期、尾芽期、肌肉效应期、心跳期)、出膜期等8个阶段22个时期,总历时约50.5 h,总积温约1454.4℃·h.初孵仔鱼平均全长(6.52±0.05)mm.     

大刺鳅性腺发育的组织学研究

该文应用解剖观测和组织学的方法研究了大刺鳅的性腺发育特征。结果表明:大刺鳅生殖细胞划分为5个时相,卵巢和精巢发育划分为Ⅰ~Ⅵ期。雌鱼群体的GSI值变幅为1.05%~7.21%,属于多次分批产卵类型,繁殖高峰期为5月;雄鱼群体GSI值波动在0.09%~0.39%,与雌鱼发育同步。产卵和排精后,卵巢和精巢都恢复到Ⅱ期进行越冬,次年3月份重新发育至性成熟。     

花斑副沙鳅七种同工酶的组织特异性表达

采用聚丙烯酰胺垂直梯度凝胶电泳方法,对花斑副沙鳅(Parabotia fasciata Dabry)的鰓、心、肝胰脏、肠、肾、肌肉、眼、脑8种组织中的过氧化氢酶(CAT)、酯酶(EST)、乳酸脱氢酶(LDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和醇脱氢酶(ADH)进行了分析。结果表明,花斑副沙鳅的7种同工酶表达具有明显的组织特异性,8种组织中检测出3种CAT同工酶、8种EST同工酶、4种LDH同工酶、8种MDH同工酶、10种POD同工酶、10种SOD同工酶、10种ADH同工酶表达。其中,CAT-3、EST-7仅在肝胰脏表达,LDH-4、SOD-9、ADH-3仅在肾表达。     

水牛波形蛋白基因克隆及其表达分析

[目的]克隆水牛波形蛋白(VIM)基因,并明确VIM基因在水牛成熟卵母细胞(MII期)和早期胚胎(2-细胞阶段)中的表达情况,为研究VIM在卵母细胞成熟及附植前胚胎发育中的作用机理打下基础.[方法]根据GenBank上已公布的水牛VIM基因mRNA序列设计引物,采用RT-PCR克隆水牛VIM基因,利用在线软件程序对克隆获得的水牛VIM基因进行生物信息学分析,同时以细胞免疫荧光试验检测VIM在水牛成熟卵母细胞(MII期)及早期胚胎(2-细胞阶段)中的表达情况.[结果]水牛VIM基因长度为1469 bp,其编码区长度1401 bp,编码466个氨基酸.水牛VIM基因序列与人类、黑猩猩、食蟹猴、家犬、马和牛的VIM基因序列具有高度的同源性,分别为93%、93%、93%、94%、94%和99%;基于VIM基因序列构建的系统发育进化树也显示水牛与牛的亲缘关系最近.水牛VIM的分子量为53.73 kD,理论等电点(pI)5.05,主要在线粒体中表达,稳定性差(不稳定系数53.65),具有较强的亲水性,无跨膜结构,不属于分泌型蛋白,其蛋白结构以α-螺旋为主.VIM在水牛成熟卵母细胞(MII期)及早期胚胎(2-细胞阶段)中均有表达,且在成熟卵母细胞中的表达量明显高于早期胚胎.[结论]水牛VIM基因编码序列具有较高的保守性,且在水牛成熟卵母细胞(MII期)中的表达量明显高于早期胚胎(2-细胞阶段).     

硬骨鱼类性别调控对大刺鳅性逆转的启示

鱼类的性别控制受遗传性别决定和环境性别决定两种机制的影响,对水产养殖具有重要意义。与其他脊椎动物相比,鱼类在性别分化和性腺发育方面可塑性强。硬骨鱼类雌雄个体的大小和生长速度存在显著的两性差异,培育和养殖体型大、生长速度快的单性群体有利于提高经济效益。大刺鳅是一种具有高营养价值和经济价值的淡水养殖鱼类,雄性个体比雌性生长速度更快、体型更大,因此培育全雄大刺鳅的经济效益更高。野生大刺鳅雌雄比例约为1∶1,但在人工养殖条件下易出现高雌性率的现象。目前尚不清楚何种因素引起大刺鳅的雌性化,也未见成功诱导大刺鳅生理雌鱼发生性逆转的报道,这极大制约了大刺鳅养殖产业的发展和经济效益的提高。目前关于大刺鳅的研究主要集中在形态学、生理学、繁殖生物学和遗传多样性等方面,关于大刺鳅性别决定与性别分化的研究较为薄弱,需从其他硬骨鱼类的性别决定机制、性别调控方式和性别控制育种技术中发掘思路。基于硬骨鱼类的性别决定机制,综述了硬骨鱼类性别控制的几种方式,主要包括遗传因素调控（如性染色体、常染色体上的性别决定基因）和环境因素调控（如温度、外源激素、饵料等）。旨在为解析人工养殖大刺鳅高雌化的原因及潜在作用机制提供思路,...     

狮头鹅AR基因克隆和组织表达

本研究旨在克隆鹅雄激素受体基因（Androgen receptor,AR）,并了解其在不同组织中的表达情况.以狮头鹅为试验材料,采集下丘脑和睾丸组织样品,提取RNA逆转录后进行AR基因克隆,并用RACE扩增其cDNA全长序列,其它同采用实时荧光定量PCR的方法检测AR基因在各个组织中的表达情况.结果克隆获得AR基因全长cDNA序列,共得到4个转录本.通过氨基酸序列同源进行分析,发现狮头鹅AR基因在禽类和哺乳类动物中同源性较高,说明该基因在禽类和哺乳类进化保守.荧光定量PCR结果显示AR基因在狮头鹅12个组织中均有表达量,其中在腿肌、胸肌和睾丸表达量较高,表明AR基因可能参与调控狮头鹅公鹅的肌肉生长与繁殖.     

山麻鸭SHH基因克隆和组织表达

本研究旨在克隆鸭SHH基因了解其组织表达情况,以山麻鸭为试验材料,采集下丘脑、垂体和卵巢组织样品,提取RNA逆转录后进行SHH基因克隆,并采用实时荧光定量PCR方法检测其表达水平.本试验克隆获得山麻鸭SHH基因cDNA序列878 bp,包含了5′UTR 113 bp和编码序列765 bp,编码255个氨基酸.氨基酸序列同源性比对发现,山麻鸭SHH基因与其他禽类的同源性较高,在物种间的保守性高.山麻鸭SHH基因在下丘脑表达量显著高于垂体和各级卵泡组织(P0.01);而在大黄卵泡中表达极显著低于大白卵泡和小黄卵泡(P0.01).本研究克隆获得SHH基因部分序列并检测其组织表达规律,为后续功能研究打下基础.     

波纹龙虾性腺抑制激素(GIH)基因克隆、表达及其对光周期的响应

为探讨波纹龙虾Panulirus homarus性腺抑制激素(gonad-inhibiting hormone, GIH)基因(PhGIH)的时空表达及其对不同光周期的响应,采用RACE技术克隆获得波纹龙虾眼柄组织GIH全长cDNA序列,通过卵巢颜色与形态、石蜡组织切片和性腺发育指数,比较不同光周期(12L∶12D、13L∶11D和14L∶10D)对波纹龙虾卵巢发育的影响,采用qPCR技术检测波纹龙虾不同卵巢发育时期(增殖期、发育期和成熟期)、不同组织GIH的表达情况及其对光周期的表达响应。结果表明:波纹龙虾GIH的cDNA序列全长为1 206 bp,开放阅读框(ORF)为354 bp,编码117个氨基酸,预测该蛋白质包括39个氨基酸组成的信号肽和78个氨基酸组成的成熟肽,具有高血糖激素家族(CHH家族)Ⅱ型肽激素的典型特征;同源性分析显示,波纹龙虾GIH氨基酸序列与非洲龙虾Jasus lalandii的一致性最高,为56.76%;系统进化分析显示,波纹龙虾GIH与非洲龙虾亲缘关系最近;qPCR结果显示,波纹龙虾GIH在各组织中广泛表达,其中眼柄中表达量最高(P<0.01),GIH在眼柄中的表达量随卵巢成熟而下降;光周期试验显示,采用14L∶10D光周期处理92 d时能更好地促进卵巢发育,波纹龙虾性腺发育指数(GSI)显著升高(P<0.05),其眼柄GIH表达量显著下降(P<0.05),石蜡组织切片观察显示,此时的卵巢为橘红色,以成熟卵母细胞为主。研究表明,波纹龙虾GIH基因可能在波纹龙虾卵巢发育过程中起着重要作用,14L∶10D光周期处理对卵巢发育促进效果最明显。     

大刺鳅模拟种群生存力分析及最小可存活种群估算

利用漩涡模型(Vortex 10.3.7.0)对大刺鳅种群的生存力进行了分析。结果发现:当环境容纳量为100尾、初始尾数为20尾时,在10种不同情景下,大刺鳅种群在100年内的内禀增长率r为4.8429～5.0412,周限增长率λ为129.8331～154.6608,平均世代时间为7.11～7.21年,平均现存种群数量为55.55～90.49尾,平均种群数量为28.82～90.16尾,遗传多样性为0.6346～0.7778,灭绝概率为0.0037～0.4818,平均首次灭绝时间为25.5～51.8年;在情景1、2和3下,当环境容纳量为300尾时,大刺鳅种群的MVP分别为117、50和33尾;在情景4～10下,当环境容纳量为100尾时,其MVP为39～11尾。结合历史文献和实际调查结果认为,在自然情况下0～1年龄组大刺鳅种群的死亡率接近70%,性成熟雌鳅的生殖率接近35%;在此情景下,设定环境容纳量为300尾、初始尾数为50尾,则该种群的灭绝概率为0.0549。