芒果乙烯受体ETR1和ERS1基因的克隆及序列分析

[目的]克隆芒果乙烯受体ETR1和ERS1基因(MiETR1和MiERS1),并进行生物信息学分析,为研究乙烯受体在芒果成熟和衰老过程中的调控机制提供理论参考.[方法]以芒果为材料,应用RACE技术扩增MiETR1和MiERS1基因的cDNA序列,并应用生物信息学方法对其编码的氨基酸序列进行预测分析.[结果]克隆获得的MiETR1基因cDNA序列全长2570 bp,开放阅读框(ORF)2220 bp,编码739个氨基酸;MiERS1基因的cDNA序列全长2171 bp,ORF 1890 bp,编码629个氨基酸;GenBank登录号分别为KY002681和KY002682.MiETR1和MiERS1蛋白均为含跨膜结构的非分泌型疏水蛋白,属于乙烯受体ETR1家族成员,以Ser为主、Thr为辅的磷酸化修饰调控乙烯信号转导,均含有3个典型的模块,即GAF结构域、HisKA结构域和HATPase_c结构域,MiERS1蛋白较MiETR1缺少REC结构域.不同物种ETR1和ERS1蛋白的氨基酸序列具有高度保守性,MiETR1和MiERS1均与甜橙(Citrus sinensis)和克莱门柚(Cit-rus clementina)的ETR1和ERS1蛋白亲缘关系较近,但二者分别聚在两个不同的分支上,表明两个蛋白存在一定的遗传分化.[结论]乙烯受体基因在芒果成熟和衰老过程中发挥调控作用.     

木薯PYL13基因克隆及表达分析

[目的]解析木薯脱落酸(ABA)受体PYR/PYL/RCARs家族基因(MePYL13)在木薯块根采后生理性变质(PPD)过程中的功能作用,为后续探索ABA信号通路在木薯PPD中的功能及作物抗逆育种打下基础.[方法]从木薯品种SC8中克隆MePYL13基因,应用生物信息学分析方法对其编码蛋白的理化性质、亲疏水性、保守结构域及二、三级结构等进行预测,对基因上游启动子进行元件分析,通过亚细胞定位观察MePYL13蛋白在植物细胞中的定位情况,并利用实时荧光定量PCR检测MePYL13基因在木薯PPD过程中的相对表达量.[结果]克隆获得的MePYL13基因编码区(CDS)长度663 bp,编码220个氨基酸,蛋白分子量23.957kD,理论等电点(Ip)为6.74.MePYL13蛋白与巴西橡胶树(XP 021654464.1)PYL家族蛋白的氨基酸序列同源性最高,为91.55%,表明MePYL13蛋白氨基酸序列具有高度保守性.从MePYL13基因启动子鉴定获得与非生物胁迫逆境相关的响应元件,包括厌氧诱导元件(ARE,AAACCA)、光响应元件(ATCT-motif,AATCTAATCC)、干旱MYB元件(MBS,TAACTG)及ABA应答元件(ABRE,AAACAGA)和分生组织表达相关元件(CAT-box,GCCACT)等;MePYL13蛋白在木薯细胞的细胞核和细胞质上均有表达.随着PPD进程的推移,MeP YL13基因相对表达量整体上呈上升趋势,至PPD后期(48 h)其相对表达量是0h时(PPD前)的16倍,即MePYL13基因受木薯块根PPD的显著诱导.[结论]MePYL13基因是PYR/PYL/RCARs家族成员,可能在木薯块根PPD过程中发挥正向调控作用,为培育木薯PPD改良品种提供了潜在基因资源.     

滇陆猪Nramp1基因多态性对其在组织中表达的影响

[目的]明确自然抵抗相关巨噬细胞蛋白1基因(Nramp1)多态性对其在滇陆猪群体各组织中表达的影响,从分子遗传学角度阐述滇陆猪不同基因型个体对疫病免疫的遗传差异,为其抗病育种选育提供参考依据.[方法]采用PCR对27头滇陆猪Nramp1基因进行扩增,以DNASTAR 5.0进行序列比对分析及多态性(SNP)位点检测;同时利用实时荧光定量PCR检测Nramp1基因在滇陆猪各组织中的相对表达量,并运用SPSS 19.0分析Nramp1基因多态性对其在滇陆猪群体各组织中表达的影响.[结果]在滇陆猪Nramp1基因第5外显子、第5内含子和第6外显子上分别发现SNP1(T→C)、SNP2(A→G)和SNP3(G→A)等3个SNPs位点,都只存在2种基因型,且SNP1位点和SNP3位点在试验猪群体中属于低度多态[多态信息含量(PIC)/杂合度(He)<0.25)],SNP2位点属于中度多态(0.25肝脏>脾脏>心脏;此外,Nramp1基因在不同基因型滇陆猪群体中表现出的组织差异表达也不同,尤其是Nramp1基因在SNP2位点纯合群体肝脏中的相对表达量显著低于在杂合群体肝脏中的相对表达量,说明Nramp1基因多态性变异对其在滇陆猪组织中的表达有显著影响.[结论]Nramp1基因SNP位点变异能影响Nramp1基因在滇陆猪各组织中的表达变化,从而影响机体的免疫应答反应,其中SNP2位点可作为滇陆猪抗病育种的分子标记.     

棉花乙烯受体基因的电子克隆及生物信息学分析

[目的]电子克隆并分析棉花乙烯受体基因（Ethylene Receptor,ETR）。[方法]利用生物信息学方法,以毛果杨的ETR基因家族序列为基础,电子克隆棉花乙烯受体基因开放阅读框,并对序列进行氨基酸组成、功能域、二级结构、疏水性、信号肽及系统进化等预测分析。[结果]通过电子拼接,共获得该基因家族的2个棉花ETR基因GhETR1和GhETR2。2个基因开放阅读框长度分别为2 289 bp和2 226 bp,编码含762和741个氨基酸残基的肽链。经生物信息学分析发现,两基因分属于ETR2和ETR1亚家族。N端有典型的跨膜区,含有ETR蛋白的保守域GAF、H isKA、HATPase-c和REC。GhETR1与毛果杨XP_002315717、XP_002311669相似性较高,GhETR2与毛果杨XP_002299688、XP_002327419相似性较高。[结论]该研究结果为进一步研究棉花GhETR基因在棉纤维发育中的作用奠定了基础。     

木薯MeHSF7基因克隆及表达分析

[目的]克隆木薯热激转录因子(HSF)基因MeHSF7并分析其在抗逆响应和采后生理性变质(PPD)过程中的表达情况,为研究MeHSF7基因在响应干旱胁迫及延缓生理性变质的调控机制提供理论参考.[方法]通过同源克隆从木薯叶片克隆MeHSF7基因,对其生物信息学和组织表达特性进行分析,并明确其在干旱和脱落酸(ABA)处理下及PPD过程中的表达模式.[结果]克隆获得的MeHSF7基因开放阅读框(ORF)为1206 bp,编码401个氨基酸残基,与参考序列(Manes.02G087400.1)仅存在2个碱基差异,位于第2染色体上,含有1个内含子和2个外显子.MeHSF7蛋白理论分子量46.1 kD,理论等电点(pI)5.95,为不稳定蛋白,定位于细胞核,无跨膜区域,含有HSF蛋白的保守结构域DBD(DNA结合功能域)、HR-A Core和HR-B Core,属于HSFA亚家族,与橡胶树和麻疯树HSF蛋白的氨基酸序列同源性最高,分别为79.20%和64.95%,在系统发育进化树上与橡胶树HSF蛋白聚在同一小分支,表明二者亲缘关系较近.MeHSF7基因在不同组织中的表达量均较低,但不同组织间存在明显差异,在松散性胚性愈伤组织、分化胚组织、须根和根顶端分生组织中的表达量相对较高,在叶柄中的表达水平最低.MeHSF7基因启动子区域含有ABA响应元件(ABRE)、干旱诱导元件(MBS)和光响应元件(ACE、Box 4)等.干旱处理下,MeHSF7基因表达量随处理时间的增加整体上呈升高趋势,在处理7 d后达峰值;在ABA处理下,处理5和7 d后MeHSF7基因表达量较处理0和3 d后明显上调,尤其在处理5 d后达峰值,表明MeHSF7基因表达受干旱和ABA处理的诱导.在木薯块根的PPD过程中,MeHSF7基因表达量随暗培养时间的增加而升高,处理6、12和48 h的表达量分别是处理0 h的2.1、2.2和3.2倍.[结论]MeHSF7基因可能在转录水平通过依赖于ABA信号通路的途径响应干旱胁迫及木薯块根的氧化胁迫,可作为候选基因用于研究其在木薯抗逆和采后储存中的调控功能.     

2株广西猪源H9N2亚型流感病毒遗传进化及生物学特性分析

[目的]明确广西猪源H9N2亚型流感病毒的遗传特征及分子生物学特性(抗原性、耐药性和致病性),为广西猪源H9N2亚型流感病毒的防控提供科学依据.[方法]以分离自广西百色地区的2株猪源H9N2亚型流感病毒(SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株)为研究对象,运用RT-PCR扩增其全基因组的8个基因片段(HA、NA、NP、M、NS、PB1、PB2和PA基因),经克隆测序后进行核苷酸序列及氨基酸位点分析.[结果]2株广西猪源H9N2亚型流感病毒的核苷酸序列开放阅读框(ORF)分别是PB2:2280 bp、PB1:2274 bp、PA:2151 bp、HA:1683 bp、NP:1497 bp、NA:1410 bp、M:982 bp和NS:838 bp.2株广西猪源H9N2亚型流感病毒全基因组仅M基因核苷酸序列与猪源H9N2亚型流感病毒的相似性较高,而HA、NA、NP、NS、PA、PB2和PB1基因核苷酸序列均与禽源H9N2亚型流感病毒的相似性较高,在基因型分类上属于G57基因型,为我国广泛流行的H9N2亚型基因型.2株广西猪源H9N2亚型流感病毒的HA蛋白发生R180Q、T213A、D216E、M224L、N285S和V287T突变,NA蛋白抗原决定簇S331V、W403S和Q431K也发生突变;NA蛋白在N2亚型的耐药性关键位点119E、151D、292R、276E和294N位点未发生突变,但在NA蛋白抗原区存在S331V、K367E和Q432K突变,且M2氨基酸位点发生S31N突变.2株广西猪源H9N2亚型流感病毒HA蛋白连接HA1和HA2的氨基酸均为RSSR↓GLF;HA蛋白存在1个因P315S突变而新增的潜在糖基化位点(NCS);NA蛋白未缺失NA潜在糖基化位点,也未出现NA蛋白颈部杆状结构63~65 aa缺失现象,在NA潜在糖基化位点中69、86、146、200和234 aa处非常保守,但发生W402S突变.[结论]从广西百色分离获得的2株猪源H9N2亚型流感病毒(SW/GX/P2/2011株和SW/GX/P3/2011株)虽为低致病力毒株,但在流感病毒基因重组过程中发挥重要作用,且其致病性有增强趋势,已对金刚烷胺类药物产生耐药性.因此,应加强广西地区哺乳动物H9N2亚型流感病毒的监控,并警惕其跨种间传播.     

木薯SCARECROW-LIKE(SCL)基因克隆、生物信息学及非生物胁迫下表达分析

[目的]克隆木薯SCARECROW-LIKE(MeSCL)基因,对其进行生物信息学分析,并检测其在非生物胁迫下的表达情况,为深入研究木薯MeSCL基因响应非生物胁迫的调控机制提供理论参考.[方法]以木薯品种D346为材料,采用RT-PCR克隆MeSCL基因编码区(CDS)序列,并利用生物信息学分析软件进行序列特征分析,采用实时荧光定量PCR检测其在干旱、盐、氧化和低温胁迫下木薯叶片中的表达情况.[结果]克隆获得的MeSCL基因编码区(CDS)序列全长1655 bp,与参考序列(GenBank登录号LOC110627921)仅存在2个碱基的差异,开放阅读框(ORF)的长度为1560 bp,编码519个氨基酸,编码蛋白分子量为57.84 kD,等电点(pI)为6.08,脂肪系数为80.46%,总平均亲水性指数为-0.195,为亲水性蛋白,含有1个信号肽、6个从内部到外部的跨膜螺旋区和5个从外部到内部的跨膜螺旋区,定位于细胞核和内质网中,属于GRAS蛋白家族成员,具有该家族的保守结构域.MeSCL蛋白三级结构模型显示,该蛋白含有14个典型的α螺旋、10个β-折叠和36个β-转角.MeSCL蛋白与橡树HbSCL蛋白的相似性最高,为90.80%,与蓖麻RcSCR、胡杨PeSCL、毛果杨PtSCR、可可树TcSCR和哥伦比亚锦葵HuSCL蛋白的相似性在80.00%左右.MeSCL基因受干旱、盐、氧化和低温胁迫诱导表达量整体呈升高趋势,但在不同处理时间的表达量存在明显差异,其中,干旱和氧化胁迫下,MeSCL基因均在处理24 h时表达量最高,分别是对照的6.05和11.17倍,而盐和低温胁迫下,MeSCL基因均在处理6 h时表达量最高,分别是对照的11.76和3.80倍.[结论]MeSCL基因参与木薯植株的非生物胁迫响应,正向调控其抗非生物胁迫能力.     

木薯NOX基因家族成员的生物信息学及其表达分析

[目的]搜索鉴定木薯还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)基因家族成员,分析其生物学信息及在不同组织和非生物胁迫下的表达模式,为深入研究该家族基因对木薯块根发育的调控机理及提高木薯抗逆性提供理论参考.[方法]从JGI数据库下载木薯的基因组序列,由pfam数据库下载4个NOX蛋白结构域相关的HMM文件,通过HMMER程序筛选NOX基因家族成员,利用生物信息学分析软件对该家族蛋白的理化性质、氨基酸序列和结构特征进行分析.基于GEO数据库的转录组测序(RNA-Seq)数据,对木薯NOX基因家族成员在不同组织和干旱胁迫下的表达模式进行分析.[结果]从木薯基因组中共鉴定到15个NOX基因家族成员,包括9个NOX基因和6个FRO基因(NOX祖先基因).FRO基因的外显子数(6~9个)明显少于NOX基因的外显子数(11~14个),且FRO基因的内含子序列较NOX基因短,NOX基因的第一个外显子相对保守.15个NOX基因家族成员分布在木薯的9条染色体和1个结构支架上,且均被定位在染色体末端,除6号染色体有4个基因、8号和14号染色体有2个基因外,其他染色体均只有1个基因.木薯NOX蛋白的分子量和氨基酸数明显高于FRO蛋白,而理论等电点(pI)差异不明显.FRO蛋白含6~9个保守跨膜结构域,而NOX蛋白均只含4个跨膜螺旋区,且均位于第350~750位氨基酸残基.木薯NOX家族蛋白有10个保守结构域,其中Motif1和Motif8存在于所有的NOX和FRO蛋白中,Motif6为NOX蛋白所特有,Motif3只独立存在于FRO蛋白中.NOX蛋白均具有典型的保守结构域和相似的蛋白质结构,其脱氢酶结构域明显折叠成催化域裂缝结构,且C末端氨基酸极度保守.由RNA-Seq数据的基因表达谱可知,NOX基因家族成员在不同木薯叶片、中静脉、叶柄、茎、侧芽、茎尖分生组织、根尖分生组织、易碎胚性愈伤组织、胚性愈伤组织(OES)和贮藏根中均有表达,但呈不同的表达模式,其中,Manes.14G042600和Manes.S089900在储藏根中高表达,Manes.06G128700和Manes.09G172500在须根和根尖分生组织中高表达.在木薯品种KU50和新选048的叶片中,Manes.14G042600基因在干旱胁迫下呈上调表达,推测NOX基因在特定组织及响应非生物胁迫过程中扮演重要角色.[结论]木薯NOX基因家族成员具有保守基因结构,其编码蛋白具有保守的功能域,尤其是C端氨基酸序列;NOX基因表达具有组织特异性,部分成员的表达受非生物胁迫的影响.FRO蛋白和NOX蛋白具有较明显的共进化关系.     

耐盐小偃麦乙烯受体基因TtETR1克隆及表达特性分析

【目的】克隆耐盐小偃麦的乙烯受体基因TtETR1,并进行表达特性分析,为TtETR1基因的功能分析和小麦耐盐遗传育种提供理论参考。【方法】以耐盐八倍体小偃麦为材料,根据小偃麦转录组数据筛选盐胁迫响应关键基因TtETR1,利用同源克隆技术获得其cDNA序列,利用生物信息学软件进行分析,并通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其在盐胁迫下的表达特性。【结果】TtETR1基因的开放阅读框（ORF）长度为2310 bp,编码769个氨基酸残基,其上游2000 bp启动子包含茉莉酸甲酯与脱落酸信号响应、干旱和厌氧诱导、分生组织表达等作用元件。TtETR1蛋白分子质量为85.76 kD,理论等电点（pI）为6.22,为含跨膜结构的分泌型蛋白,定位于细胞质膜上,二级结构主要由α-螺旋和无规卷曲构成,含有REC＿ETR-like、HATPase＿ETR2＿ERS2-EIN4-like、cGMP磷酸二酯酶-腺苷酸环化酶-FhlA(GAF)、组氨酸激酶（HisKA）等结构域,具有丝氨酸为主、苏氨酸为辅的乙烯信号转导进行磷酸化修饰与调控的位点。盐胁迫下TtETR1基因在根中的相对表达量最高,分别是茎和...     

木薯AGPase基因家族的生物信息学及其表达分析

[目的]搜索鉴定木薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)的基因家族成员,并分析其生物学信息及不同组织和非生物胁迫下的表达情况,为木薯AGPase基因的功能挖掘及淀粉性状遗传改良提供理论依据.[方法]从木薯基因组数据库(Phytozome)下载木薯全基因组序列,从中筛选含NTP_transferase(Pfam编号PF00483)保守结构域序列的AGPase基因家族成员,利用生物信息学方法对其结构特征及编码蛋白序列进行分析.基于NCBI转录组测序(RNA-seq)数据,对木薯AGPase基因家族成员在不同组织及冷害和干旱胁迫下的表达模式进行分析.[结果]从木薯全基因组序列中共鉴定出9个AGPase基因家族成员,包含6个AGPase大亚基(LS)基因和3个小亚基(SS)基因.6个LS基因在长度和编码氨基酸数目上差异明显,但3个SS基因间的差异不明显.LS基因外显子数目为8~15个,SS基因外显子数目均为9个.9个木薯AGPase基因家族成员分布于8条染色体和1个scalefold中,未在染色体上发现串联成簇分布现象.木薯AGPase基因家族启动子区域含有多个干旱响应元件、光响应元件、激素响应元件及多种除干旱外的其他非生物胁迫响应元件.9个AGPase基因家族成员在不同木薯组织间的表达模式具有组织特异性.经冷害胁迫后,除MeAGL1.3基因外,其余8个基因表达量均极显著(P<0.01,下同)或显著(P<0.05,下同)下调;经干旱胁迫后,MeAGL1.4、MeAGS1.1、MeAGS1.2和MeAGS2基因表达量极显著或显著下调,MeAGL1.3基因的表达量显著上调,其余基因与对照无显著差异(P>0.05).[结论]木薯AGPase基因家族成员具有保守的基因结构和功能结构域,其表达具有组织特异性,大多数成员表达水平受冷害和干旱胁迫调控.