小分子热激蛋白的研究进展

热激蛋白是生物体在遭受胁迫环境时诱导产生的一组进化上高度保守的蛋白质,有利于生物体抵御不良环境。综述了植物热激蛋白家族中小分子热激蛋白的种类、功能,并提出了小分子热激蛋白研究中存在的问题及今后的研究方向。     

小分子热激蛋白参与植物抗逆性方面的研究进展

小分子热激蛋白(sHSPs)是植物面临逆境胁迫时,被激活且表达增强的一类蛋白,属于热激蛋白的一个亚家族。sHSPs作为分子伴侣,在植物抵抗高温热害、低温冷害以及种子发育中具有重要的作用。综述了sHSPs的分类、特点和功能,重点讲述了其参与植物抗逆性方面的研究进展,对目前研究中存在的问题进行了讨论,并对今后的研究方向进行了展望。     

内质网小分子量热激蛋白的研究进展

热激可以导致热激蛋白的产生,包括产生由核基因编码的内质网小分子量热激蛋白。内质网小分子量热激蛋白是热激蛋白超家族成员,含有2个保守区域和内质网滞留序列;当植物受到内质网胁迫时,内质网小分子量热激蛋白能够保护内质网;对内质网小分子量热激蛋白与植物的耐热性、耐冷性关系进行了初步分析。     

烟草花叶病毒移动蛋白基因转化烟草及在转基因烟草中的表达

根据烟草花叶病毒蚕豆株系（TMV-B）的已知序列合成引物，经PCR扩增获得TMV-B的移动蛋白（MP）基因。该基因测序验证后，分别以正、反向克隆到植物表达载体pBI121中，并置于CaMV35S启动子控制之下，通过三亲交配及叶盘转化，将MP基因导入烟草。经卡那霉素抗性筛选，PCR扩增，Southern点杂交,Northern点杂交及Westernblot检测，获得了正义表达MP基因及反义表达MP基因的转基因烟草，分别命名为pTMP（+）烟草和pTMP（-）烟草。     

植物内质网小分子量热激蛋白的生物学功能

介绍了植物ERs HSP的结构特点、分子伴侣活性及逆境抗性等生物学功能,并展望了该领域今后的研究方向,为深入研究植物的逆境胁迫机制以及分子水平的作物育种提供了新思路。     

沙芥幼苗叶片小热激蛋白基因的克隆与表达

在对转录组和蛋白组数据联合分析的基础上,通过RT–PCR方法克隆得到沙芥幼苗叶片2个小分子热激蛋白基因PcHSP26.5和PcHSP17.8,运用生物信息学软件分析它们的核苷酸和编码蛋白,通过Real–time PCR分析其在高温、低温、NaCl、ABA和干旱复水胁迫下的表达模式。PcHSP26.5和PcHSP17.8开放阅读框分别为699 bp和462 bp,分别编码282和153个氨基酸,其中PcHSP26.5包含1个内含子。PcHSP26.5、PcHSP17.8的相对分子质量分别为26 480、17 490,理论等电点分别为6.36、5.99;均无跨膜结构与信号肽位点,属于亲水蛋白。亚细胞定位预测和进化树分析表明,PcHSP26.5主要定位于线粒体中,属于MⅡ亚族;PcHSP17.8主要定位于细胞质中,属于CⅠ亚族。实时荧光定量PCR结果表明：高温胁迫下,沙芥PcHSP26.5和PcHSP17.8基因的相对表达量均在1 h达到顶峰,之后下降;低温胁迫下,沙芥PcHSP26.5基因的相对表达量在0.5 h达到顶峰,之后下降,沙芥PcHSP17.8基因的相对表达量在0.5~12 h内低于对照,24 h时出现上升趋势;NaCl胁迫下,沙芥PcHSP26.5和PcHSP17.8基因的相对表达量分别在 1 h和3 h达到顶峰,之后下降;ABA胁迫下,沙芥PcHSP26.5和PcHSP17.8基因的相对表达量均在2 h达到顶峰,之后下降;干旱复水胁迫下,沙芥PcHSP26.5和PcHSP17.8基因的相对表达量均在干旱9 d达到顶峰,复水后下降。     

番茄花叶病毒移动蛋白基因转化烟草及在转基因烟草中的表达

从提纯病毒抽提基因组RNA，并通过RT－PCR扩增番茄花叶病毒（ToMV)移动蛋白（MP）基因。经克隆测序后插入植物表达载体PBI121的35S启动子下游，通过PCR及酶切筛选分别获取正、反向插入的克隆，通过三亲交配导入农杆菌，叶盘转化法转化普通烟草。卡那霉素筛选获得一系列抗性小苗，对其进行PCR检测，Southern、Northern点杂交，Western-blot检测，获得能正义、反义表达ToMV MP基因的转基因植株。     

玉米锌指蛋白基因ZmAN14过表达转基因烟草对非生物胁迫的响应

【目的】ZmAN14是玉米A20/AN1型锌指蛋白基因家族成员,该家族在水稻中广泛参与非生物胁迫应答。通过分析玉米旱21（H21）及转ZmAN14烟草在非生物胁迫下的表达情况,为玉米ZmAN14及其家族的功能和分子机制的全面解析提供新信息。【方法】通过对ZmAN14进行序列分析,发现其属于玉米A20/AN1型锌指蛋白基因家族。以玉米自交系H21为研究材料,在三叶期时对其进行非生物胁迫和ABA诱导处理,0、1、3、6、12和24 h时取整株样品,同时在玉米不同生长期取根、茎、叶、胚芽鞘、雌蕊、雄蕊、花丝、苞叶等不同组织样品,利用实时荧光定量PCR方法对ZmAN14的组织表达谱和非生物胁迫及ABA诱导的表达谱进行分析,并结合启动子区顺式作用元件分布情况进行对比分析。将ZmAN14编码序列克隆至GFP表达载体pMDC85,利用亚细胞定位技术验证ZmAN14在胞内的定位情况。将ZmAN14克隆至GAL4 DNA结合结构域载体,并转化酵母,将其涂布在缺陷培养基上观察酵母生长情况,分析其有无转录激活活性。将ZmAN14编码区与植物表达载体p1300-221连接构建超表达载体,并将其转入烟草,选择ZmAN14 mRNA 表达量高的T₂纯合体株系进行盐、干旱胁迫和ABA诱导,观察其对非生物胁迫的应答。【结果】序列分析表明,ZmAN14开放阅读框（ORF）为516 bp,编码一个171个氨基酸的蛋白,预测分子量为18.3 kD,等电点是8.28。ZmAN14具有A20和AN1结构域,属于玉米A20/AN1型锌指蛋白基因家族。实时定量荧光PCR结果表明ZmAN14在叶中大量表达,受NaCl、干旱胁迫和ABA诱导上调。ZmAN14与GFP融合蛋白定位于细胞质和细胞核中,定位结果与ZNF216 和ZmAN13类似,而ZmAN14本身并没有核定位信号,暗示ZmAN14与其他蛋白结合进入细胞核中发挥其生物学功能。ZmAN14在酵母中表达时不能在酵母缺陷培养基（SD/-Leu-His medium）上生长,因此,未发现其具有转录激活活性。将ZmAN14在烟草中过表达会增加烟草苗期对盐和干旱的抗性。【结论】ZmAN14属于玉米A20/AN1型锌指蛋白基因家族。ZmAN14主要在叶中表达,受非生物胁迫和ABA诱导,在烟草中过表达可以提高烟草苗期对盐和干旱的抗性。ZmAN14可能通过与其他蛋白的互作行使功能。相比较于其他的A20/AN1型锌指蛋白,在转基因烟草中,ZmAN14也参与非生物胁迫应答。ZmAN14与ZmAN13具有高同源性,但在盐和干旱胁迫时,二者却具有向反方向调控的功能。     

菊花脑热激蛋白70基因的克隆及表达分析

采用同源克隆结合RACE技术从菊花脑叶片中克隆菊花脑(Chrysanthemum nankingense)热激蛋白70基因(hsp70)的cDNA序列,并通过荧光定量PCR(qRT–PCR)分析菊花脑在40℃高温下热激不同时间(0、0.5、1、2、3、6 h)后叶片中hsp70基因的表达差异。结果表明,克隆的cDNA序列全长2 224 bp,与水母雪莲花、紫茎泽兰的hsp70基因在核苷酸和氨基酸水平的同源性分别为88%、98%,表明该序列为菊花脑的hsp70基因序列(GenBank登录号,KJ561911),命名为Cnhsp70。Cnhsp70基因的开放阅读框为1 944 bp,其编码的蛋白(647个氨基酸)的相对分子质量约为70 900,含有HSP70家族序列标签。qRT–PCR分析的结果表明,Cnhsp70基因的表达在热激后短时间内迅速上调,热激3 h达到最高,热激6 h时表达量迅速下调。     

春尺蠖热激蛋白AcinHsp70基因的克隆、分子特性与表达分析

【目的】克隆春尺蠖热激蛋白Hsp70基因,分析其理化性质与表达情况,探究该基因在春尺蠖应对外界不利环境中的作用。【方法】基于前期所测转录组数据(春尺蠖幼虫不同低温胁迫),克隆获取Hsp70基因,命名为AcinHsp70(GenBank登录号：OP750249);利用生物信息分析软件对Hsp70基因的理化性质进行分析;采用qPCR技术检测AcinHsp70基因在不同温度(-10、-5、0、5和25℃)胁迫中回温与不回温及4℃不同时间处理下的表达谱。【结果】春尺蠖AcinHsp70基因完整CDS序列全长1899 bp,编码633个氨基酸,蛋白质预测分子量为69.91 kDa,预测等电点为5.51。在N端均不含信号肽且无跨膜区。磷酸位点检测分别发现丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸位点24、26和8个;未发现糖基化位点。该蛋白的平均亲水性为-0.507,预测不稳定系数为33.19,故该蛋白属于亲水稳定蛋白,亚细胞定位结果显示,其主要位于细胞质。序列一致性比对与系统进化树分析结果显示,春尺蠖与庆网蛱蝶(Melitaea cinxia)亲缘关系最近,序列一致性达92.91%。基因表达结果显示,不同温度(...     

辣椒中辣椒素生物合成途径基因Kas克隆及表达研究

3-氧酰基[酰基载体蛋白]还原酶(3-oxoacyl-[acyl-carrier-protein]synthase,Kas)在辣椒素生物合成途径中起着重要作用,但其全长DNA序列仍未见报道.以辣椒益都红基因组为模板,根据同源性设计特异引物PCR扩增得到辣椒Kas基因DNA序列(GenBank登录号:HQ229922)....     

辣椒NBS-LRR类型抗病基因同源序列的克隆及分析

为研究辣椒NBS-LRR类抗病基因的结构和功能特点,运用前人根据NBS-LRR类抗病基因保守结构域(P-Loop和GLPL)设计的简并引物,以辣椒PBC631B的基因组DNA为模板进行PCR扩增,共获得17个具有完整开放阅读框的辣椒抗病基因同源序列(CaRGA01～CaRGA17)。多重序列比对显示这些序列都含有NBS-LRR类基因的6个保守结构域(P-loop、RNBS-A-nonTIR或RNBS-A-TIR、Kinase-2、RNBS-B、RNBS-C和GLPL)。与已知6个抗病基因(Gpa2、L6、M、N、Prf和RPM1)构建系统进化树,发现这17个序列被分为TIR-NBS-LRR和nonTIR-NBS-LRR2组,进一步划分为4个亚组(CaRGAⅠ～CaRGAⅣ)。其中,CaRGA01和CaRGA13分别与来自番茄Solanum lycop-ersicum抗细菌性斑点病基因Bs4和番茄Solanum sp.VFNT抗线虫基因Mi-1.4相似性最高,分别为90%和91%,推测这2个序列可能是相关抗病基因的一部分或与相关抗病基因属于同一家族。这些结果将为研究辣椒抗病相关基因提供理论依据。     

水牛热休克蛋白70基因克隆及其表达分析

【目的】克隆水牛热休克蛋白70基因（HSP70）并进行生物信息学分析,同时明确HSP70基因在水牛成熟卵母细胞（MII期）和2-细胞期胚胎中的表达情况,为研究HSP70在水牛卵母细胞成熟及着床前早期胚胎发育中的作用机理提供理论依据。【方法】根据NCBI已公布的水牛HSP70基因mRNA预测序列（MH814759.1）设计引物,通过RTPCR克隆水牛HSP70基因,运用DNAStar、MEGA 7.0、TMHMM 2.0及SignalP 4.1 Server等在线软件进行生物信息学分析;同时采用细胞免疫荧光分析HSP70在水牛成熟卵母细胞及2-细胞期胚胎中的表达情况。【结果】水牛HSP70基因编码区（CDS）长度为1926 bp,共编码641个氨基酸残基。克隆获得的水牛HSP70基因序列与NCBI已公布水牛HSP70基因mRNA预测序列（MH814759.1）的相似性高达97.7%;与牛、家犬、山羊、小鼠、绵羊和大鼠的HSP70基因序列具有较高的相似性,其中与牛的相似性高达99.1%。基于HSP70基因核苷酸序列相似性构建的系统发育进化树也显示,水牛与牛的亲缘关系最近。水牛HSP70分子量为70.27 kD,分子式为C₃₀₈₈H₄₉₆₇N_8670972S₁₅,理论等电点（pI）为5.67,不稳定系数为32.84,属于稳定蛋白;不存在跨膜结构及信号肽,主要定位于细胞质（60.9%）、细胞核（30.4%）及线粒体（8.7%）,其亲水性较强;水牛HSP70蛋白结构以α-螺旋和β-折叠为主。HSP70在水牛成熟卵母细胞及2-细胞期胚胎中均有表达,且主要集中在细胞质。【结论】水牛HSP70基因在进化过程中具有高度的保守性,在水牛成熟卵母细胞和着床前早期胚胎中均有表达,且主要集中在细胞质,属于结构型HSP70。     

甘蔗细胞壁转化酶基因(SoCIN1)克隆及其在转基因烟草中的表达特性分析

[目的]克隆甘蔗细胞壁转化酶基因(SoCIN1)并分析其在转基因烟草植株中的表达特性,为研究CIN1基因功能提供参考.[方法]克隆SoCIN1基因,利用基因重组技术构建植物正义表达载体pBI121-SoCIN1,采用叶盘法经农杆菌EHA105介导将其转化烟草品种K346.经抗性筛选和PCR扩增验证后获得转SoCIN1基因烟草植株,采用半定量PCR检测叶片SoCIN1基因的表达量,并测定叶片可溶性糖含量、CIN活性及株高(以野生型烟草为对照).[结果]克隆获得的SoCIN1基因长度为1731 bp,与GenBank已公布的SoCIN1基因(JQ312298)核苷酸序列同源性达100%,并通过构建其植物正义表达载体转化烟草.PCR扩增鉴定结果表明,SoCIN1基因已整合至烟草基因组DNA.对F0和F1代进行转基因烟草连续筛选,获得4个转SoCIN1基因烟草株系(T-1、T-2、T-3和T-4).在4个株系的叶片中均检测到SoCIN1基因的表达,其中以在T-1株系叶片中SoCIN1基因表达量最高,其次是T-3株系,最低的是T-4株系.4个株系叶片的可溶性糖含量、CIN活性及株高均高于野生型烟草,其中CIN活性显著高于野生型烟草(P<0.05,下同),且T-1株系CIN活性高于其他3株系;T-1、T-2和T-3株系叶片可溶性糖含量分别显著高于野生型烟草39.68%、19.95%和31.15%;T-1、T-2、T-3和T-4株系的株高较野生型烟草分别提高了15.57%、2.90%、5.74%和5.22%,但仅T-1株系与野生型烟草存在极显著差异(P<0.01).[结论]转SoCIN1基因烟草叶片过表达SoCIN1基因,能提高烟草的CIN活性和可溶性糖含量,促进植株生长,由此推测该基因在甘蔗生长发育和蔗糖积累过程发挥作用.     

辣椒Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶序列的克隆及分析

[目的]从辣椒基因组中克隆Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶序列,分析其家族特性及进化关系.[方法]根据Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶保守区域设计简并引物,通过PCR扩增、回收、克隆、测序得到的目的基因序列.[结果]克隆从辣椒基因组14条逆转录转座子逆转录酶序列,序列大小均为340 bp左右.生物信息学分析表明,序列长度变化范围为310 ～345 bp,同源性范围为60.2;～99.1;.这些核苷酸序列具有较高的异质性,主要表现为终止密码子突变.聚类分析可将所得序列分为5大类,基于逆转录酶序列进行的不同物种进化树分析显示,第Ⅳ、Ⅴ类序列与荸荠、潘那利番茄等组成一大类,可能是逆转录转座子横向传递的结果.[结论]辣椒Ty3-gypsy逆转录转座子逆转录酶序列具有普遍性、异质性等特点,与荸荠、潘那利番茄等物种的同类型逆转座子可能有相同的起源.     

Cloning and characterization of CaGID1s and CaGAI in Capsicum annuum L.

Fruit set and development are affected by many phytohormones,including gibberellin.Little is known regarding molecular mechanism underlying gibberellin mediated fruit set and development especially in Capsicum.Three gibberellin receptors,CaGID1b.1,CaGID1b.2 and CaGID1c,and a DELLA protein,CaGAl,have been identified in Capsicum annuum L.During the fruit development,the expression level of CaGIDIc was low,and the expression fold change is mild.However,CaGID1b.1 and CaGID1b.2 were relatively higher and more acute,which indicates that CaGID1b.1 and CaGID1b.2 may play an important role in fruit pericarp,placenta and seed.Ectopic expressions of CaGID1b.1,CaGID1b.2 and CaGID1c in Arabidopsis double mutant gid1a gid1c increased plant height,among which CaGID1b.2 had the most significant effect;CaGAl reduced plant height in double mutant rga-24/gai-t6,having a similar function to AtGID1 and AtGA1 in stem elongation.Yeast two-hybrid(Y2H)and bimoiecuiar fluorescence complementation(BiFC)assays indicated that CaGID1b.1and CaGID1b.2 interact with CaGAl in a GA-dependent manner,while CaGID1c interacts with CaGAl in a GA-independent manner.Our study reveals the key elements during gibberellin signaling in Capsicum and supports the critical importance of gibberellin for Capsicum fruit set and development.     

辣椒抗病基因同源序列的克隆与分析

 【目的】利用同源序列法分离辣椒抗病基因同源序列。【方法】根据已知植物抗病基因的NBS-LRR保守结构域设计简并引物,以辣椒品系PR205基因组DNA为模板对抗病基因同源序列进行扩增。【结果】获得了25个抗病基因同源序列（resistance gene analogs,RGAs）,聚类分析将其分为7个不同的类别。由其核酸序列推导的氨基酸序列与Mi-1.2、prf、Hero、I2C-1、RPM1基因相应区域的同源性为27.4%～98.2%。其中RGA-p20与Mi-1.2 基因的核苷酸和氨基酸序列相似性均达到99%,确认RGA-p20为抗根结线虫基因的一部分,即辣椒中也含有与Mi基因同源的根结线虫抗性基因。【结论】本研究在辣椒品系PR205中获得了抗病基因同源序列,为辣椒抗病基因的克隆奠定了基础。     

紫茎泽兰细胞质小热激蛋白HSP17.7基因的cDNA克隆与表达

利用RT-PCR和RACE-PCR技术,从热激处理的紫茎泽兰叶片总RNA中扩增出了细胞质小分子量热激蛋白(sHSP)全长683 bp的cDNA基因序列。在GeneBank上的登录号是EF105483。通过半定量分析,HSP17.7基因编码的热激蛋白在常温下有表达,且叶、茎中的表达量比根中的高;在热激(40℃)和冷处理(4℃)的情况下,根、茎、叶中的表达量均有增加。为研究基因在温度胁迫下的功能,将HSP17.7基因在大肠杆菌中表达。在细胞致死温度(50℃)下,HSP17.7能够改善细胞死亡的现象;4℃条件下,也得到相同结果。这些结果表明,HSP17.7可能在紫茎泽兰耐温度胁迫中发挥作用。     

辣椒素生物合成途径基因pal克隆及原核表达分析

以辣椒品种"益都红"胎座RNA反转录的cDNA为模板,根据pal基因保守序列设计引物,PCR扩增得到1条全长2157bp的目的片段。该基因包含有完整的开放阅读框架,编码718个氨基酸,预测的分子质量为73ku。与多种植物PAL的氨基酸序列有一定的同源性,其中与同科同属植物朝天椒的同源性最高。应用分子克隆的方法成功地构建了pET-32a-pal重组表达质粒,优化得到诱导表达的最佳条件为:IPTG0.3mmol·L-1,温度28℃,时间6h,经SDS-PAGE检测6×His-PAL在E.coli中得到了高效表达,重组蛋白分子质量约为93ku。因此,该基因的克隆与原核表达为深入研究辣椒PAL的基因结构、生物活性、表达调控机制以及辣椒素的生物合成机制奠定了重要基础。