甘蔗细胞壁转化酶基因(SoCIN1)克隆及其在转基因烟草中的表达特性分析

[目的]克隆甘蔗细胞壁转化酶基因(SoCIN1)并分析其在转基因烟草植株中的表达特性,为研究CIN1基因功能提供参考.[方法]克隆SoCIN1基因,利用基因重组技术构建植物正义表达载体pBI121-SoCIN1,采用叶盘法经农杆菌EHA105介导将其转化烟草品种K346.经抗性筛选和PCR扩增验证后获得转SoCIN1基因烟草植株,采用半定量PCR检测叶片SoCIN1基因的表达量,并测定叶片可溶性糖含量、CIN活性及株高(以野生型烟草为对照).[结果]克隆获得的SoCIN1基因长度为1731 bp,与GenBank已公布的SoCIN1基因(JQ312298)核苷酸序列同源性达100%,并通过构建其植物正义表达载体转化烟草.PCR扩增鉴定结果表明,SoCIN1基因已整合至烟草基因组DNA.对F0和F1代进行转基因烟草连续筛选,获得4个转SoCIN1基因烟草株系(T-1、T-2、T-3和T-4).在4个株系的叶片中均检测到SoCIN1基因的表达,其中以在T-1株系叶片中SoCIN1基因表达量最高,其次是T-3株系,最低的是T-4株系.4个株系叶片的可溶性糖含量、CIN活性及株高均高于野生型烟草,其中CIN活性显著高于野生型烟草(P<0.05,下同),且T-1株系CIN活性高于其他3株系;T-1、T-2和T-3株系叶片可溶性糖含量分别显著高于野生型烟草39.68%、19.95%和31.15%;T-1、T-2、T-3和T-4株系的株高较野生型烟草分别提高了15.57%、2.90%、5.74%和5.22%,但仅T-1株系与野生型烟草存在极显著差异(P<0.01).[结论]转SoCIN1基因烟草叶片过表达SoCIN1基因,能提高烟草的CIN活性和可溶性糖含量,促进植株生长,由此推测该基因在甘蔗生长发育和蔗糖积累过程发挥作用.     

粘液繁殖体植物抱茎独行菜TTG1基因转化拟南芥的表型研究

[目的]将过量表达典型粘液繁殖体植物抱茎独行菜TTG1基因(LpTTG1)的转基因拟南芥株系表型与野生型和突变体进行比较,为深入研究LpTTG1基因的功能提供参考依据.[方法]在体视显微镜下,通过对拟南芥野生型、ttg1突变体及LpTTG1基因过表达转基因株系的植株表型,幼苗叶表皮毛、下胚轴和根毛以及种子形态进行观察比较.[结果]拟南芥ttg1突变体与野生型和LpTTG1过表达转基因型的幼苗在下胚轴的颜色、根毛着生方式、真叶表皮毛等方面有显著差异,但后两者表型间无显著差异.[结论]缺失TTG1基因可导致拟南芥幼苗形态发生显著变化,但此基因过量表达不一定对拟南芥形态产生影响.     

转火龙果过氧化氢酶基因烟草植株的获得及其抗旱性分析

根据前期克隆的火龙果过氧化氢酶基因(HuCAT)设计特异引物,从克隆载体PMD18T-HuCAT中扩增出特异带,将其连入植物表达载体pSH737,构建了CaMV35s启动子驱动的表达载体pSH737-HuCAT;采用农杆菌介导法转化烟草,获得37个抗性植株,经GUS组织化学染色及PCR扩增鉴定,有29个株系为转基因植株;经半定量RT-PCR及荧光定量PCR检测,筛选出高表达株系22个;以PEG-6000溶液模拟干旱胁迫条件,测定转基因烟草的抗旱相关生理指标,结果显示,转基因烟草CAT活性、SOD活性、POD活性、PRO含量和相对含水量均高于野生型烟草,MDA含量低于野生型烟草,表明转HuCAT基因可能提高了烟草的抗旱性.     

一个抗旱/抗寒基因过表达载体构建及转基因植株的筛选鉴定

[目的]进一步研究LWT1基因在调控低温和干旱应答中的功能,构建拟南芥LWT1基因过表达载体,获得相应的转基因株系.[方法]以野生型拟南芥的cDNA为模板,利用PCR扩增LWT1基因全长,将该基因连接到pART27载体上.将获得的重组载体转化至农杆菌菌株GV3101,通过浸花转化法将LWT1重组载体转化到拟南芥野生型植株中,利用转基因筛选与遗传鉴定获得LWT1转基因阳性植株.[结果]LWT1基因CDS全长990 bp,PCR电泳结果一致,测序比对结果正确.通过抗性筛选和分子鉴定获得转基因植株.[结论]LWT1过表达载体构建成功并获得相应的转基因株系,为进一步研究该基因的分子机制奠定基础.     

我国野生燕山葡萄VyUSP1基因抗逆功能的初步验证

研究我国野生葡萄燕山葡萄(Vitis yeshanesis‘Yanshan’)VyUSP1基因在转基因烟草不同逆境下的表达情况，选择从供试材料中克隆所获得的VyUSP1基因，利用重组法构建其载体，并用农杆菌介质为导体转化转基因烟草植株，获得USP转基因烟草植株，然后对转基因烟草植株进行不同逆境处理，并对该基因进行初步的功能研究。结果表明，在不同的逆境条件下，USP转基因烟草均具有一定的抗干旱能力，但是不具备抗寒能力。较高浓度NaCl、甘露醇、PEG-6000以及低温处理会抑制转基因烟草种子的萌发。而在不同浓度NaCl、甘露醇处理下，转基因烟草植株幼苗均比野生型(WT)植株幼苗的表现要好；不同浓度PEG-6000处理对转基因烟草幼苗生长的影响并不明显；但在低温处理条件下，转基因烟草植株幼苗全部死亡。植物在受到外界胁迫时VyUSP1基因的表达会上调，蛋白活性被激活之后，有助于提高植物的抗逆性，增强其环境的适应性，因此USP对逆境胁迫存在一定的抗性。     

AtNHX1提高烟草耐盐性的研究

[目的]探讨利用AtNHX1基因提高烟草耐盐性的效果。[方法]利用农杆菌侵染的方法对烟草的叶盘进行遗传转化,将拟南芥的液泡膜Na＋/H＋逆向转运蛋白基因AtNHX1成功地转入了烟草中,对获得的28株潮霉素抗性转基因植株中的6株进行了Southern检测,并用200mmol/LNaCl对转基因植株进行盐分胁迫与耐盐性鉴定。[结果]分子检测表明,AtNHX1已经整合到烟草的基因组中,并得到了表达。在盐分胁迫下,各转基因株系具有较高的光合速率和PSⅡ活性,光合速度和Fv/Fm值均显著高于野生型对照,株系T1、T5的SOD酶活分别是野生型的1.8和2.1倍,各转基因株系GR活性也均显著高于野生型,而MDA含量则低于野生型。[结论]转At-NHX1基因的各株系的耐盐性较野生型对照有了较大程度的提高。     

转拟南芥P5CS1基因羽衣甘蓝的抗寒性

为提高羽衣甘蓝的抗寒性,本试验将拟南芥△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS1)基因经农杆菌介导转入羽衣甘蓝植株中,检测转基因株系在4℃低温胁迫下P5CS1 mRNA表达量、幼苗脯氨酸含量、可溶性糖含量、相对电导率、叶绿素荧光参数(Fv/Fm)和植株存活率。结果显示,在4℃低温胁迫下,转基因植株的P5CS1基因的mRNA过量表达,脯氨酸含量、可溶性糖含量、Fv/Fm和植株存活率均显著高于野生型对照(P0.05),但丙二醛含量和相对电导率均显著低于野生型对照(P0.05)。表明拟南芥P5CS1基因在羽衣甘蓝中的表达明显改善了转基因植株的抗寒性。     

干旱胁迫对转拟南芥Atpsy基因生菜的影响

干旱胁迫处理转拟南芥Atpsy基因的T1代生菜和野生型生菜,测定各转基因株系与野生型生菜的各项生理生化指标、目的基因的表达量和类胡萝卜素的含量。结果显示:正常情况下,转基因株系与野生型植株的各项生理指标之间没有明显的差异,随胁迫程度加深,转基因株系在发芽率、发芽指数和净光合速率的下降幅度方面小于野生型;同等胁迫强度下,转基因株系的脯氨酸、可溶性糖含量和超氧化物歧化酶活性高于野生型植株;转基因株系植物体内丙二醛的快速积累程度和叶绿素降解速率小于野生型对照组。干旱胁迫处理下,转基因株系Atpsy基因的表达量和类胡萝卜素的含量均有所提高。     

光诱导和组成型启动子控制柠檬酸合酶基因过量表达对转基因烟草耐铝性影响的比较

分别用光诱导型启动子(PrbcS)和组成型启动子(CaMV 35S)驱动柠檬酸合酶基因(cs)在转基因烟草中过量表达,比较转基因烟草中柠檬酸的含量和分泌量及其铝耐受性的变化.结果表明:诱导型转基因株系的CS酶活性是野生型的2.3～2.4倍,组成型转基因株系的酶活性是野生型的1.6～2倍;在30 μmol·L-1铝胁迫下,诱导型转基因植株的根相对伸长量是野生型的2.8～2.9倍,组成型的根相对伸长量是野生型的2～2.3倍;在无铝或300 μmo1·L-1铝胁迫下,转基因烟草叶片和根中柠檬酸含量均高于野生型,其中诱导型转基因植株叶片中柠檬酸含量高于组成型转基因植株,转基因烟草柠檬酸的分泌量分别是野生型的1.8～2.0倍和3.0～3.3倍;在有铝胁迫的珍珠岩基质上培养时,转基因烟草的生长情况好于野生型.这些结果证明,与CaMV 35S相比,采用PrbcS启动子控制cs基因的过量表达可更有效地增加转基因烟草中CS的酶活性及叶片中柠檬酸的合成量,同时也能更有效地提高转基因烟草柠檬酸的分泌量,从而增强其对铝毒害的抵御能力.     

棉花抗枯萎病相关GhB301基因对烟草的遗传转化及功能分析

[目的]ERF是乙烯信号传导途径中的重要转录因子,在植物与病原菌互作中发挥着重要的调控作用.棉花抗枯萎病相关GhB301基因是从棉花中获得的ERF-B3亚组基因,探索该基因在烟草异位表达后的功能,为进一步研究其在棉花抗枯萎病中的功能奠定基础.[方法]以pPZP35S表达载体为基础,构建GhB301的过表达载体;采用农杆菌介导法转化烟草并获得转基因植株.[结果]经卡那霉素筛选、PCR和RT-PCR检测,获得3株转基因阳性植株;qPCR分析显示,转基因阳性植株中部分病程相关蛋白基因的表达量较野生型明显升高.[结论]棉花抗枯萎病相关基因GhB301在烟草中异位表达后可能会通过增强部分病程相关蛋白基因的表达来提高植株抗病性.     

甜杨PsG6PDH基因超表达对提高烟草抗寒冻性的影响

【目的】研究甜杨葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(PsG6PDH)基因超表达对烟草抗寒冻性的影响,为烟草的抗寒冻育种提供理论依据。【方法】构建甜杨PsG6PDH基因的植物表达载体pBGⅠ,采用叶盘转化法转化烟草,对转化烟草植株低温驯化后的形态、生理生化指标进行测定与分析。【结果】PCR检测及Southern杂交结果显示,甜杨PsG6PDH基因已整合到转基因烟草的基因组中。低温试验表明,未经冷驯化的对照烟草较转基因烟草早出现萎蔫,恢复正常生长也较晚;经过冷驯化在接近0℃处理24h的对照烟草叶片基本萎蔫,而转基因烟草仍然正常。在0℃及更低温度胁迫下,转基因烟草的相对电导率一直保持在35%左右,而对照烟草的相对电导率则从35%上升到90%;随着胁迫时间的延长,转基因烟草的SOD、POD活性升高,而MDA含量下降。【结论】甜杨PsG6PDH基因能够提高植物的抗寒冻性,可以作为改良植物抗寒冻性的新的外源基因。     

茶树CsCBF1基因表达载体的构建及其转基因烟草的抗寒性分析

【目的】通过转基因烟草验证茶树CsCBF1基因抗寒性功能,为发掘、筛选茶树重要功能基因提供理论依据。【方法】 利用根癌农杆菌介导法将构建的表达载体pBI121-CsCBF1导入烟草,通过PCR、RT-PCR和GUS活性染色鉴定外源CsCBF1基因是否导入并整合到烟草基因组上转录表达。然后将转pBI121-CsCBF1型、转pBI121型和野生型烟草分别置于25,4和0 ℃下处理48 h后,检测其膜质通透性、丙二醛（MDA）含量和叶绿素荧光参数Fv/Fm,并将0 ℃处理3 d的转pBI121-CsCBF1型和野生型烟草置于25 ℃下培养1周后观测恢复表型和统计死亡率。【结果】 成功构建表达载体pBI121-CsCBF1,PCR、RT-PCR和GUS活性染色证明,CsCBF1已整合到烟草基因组中并转录表达。25 ℃处理下,转pBI121-CsCBF1型、转pBI121型和野生型烟草的膜质通透性、丙二醛含量和Fv/Fm均无显著差异,而在4和0 ℃处理下,转pBI121-CsCBF1型烟草的膜质通透性和丙二醛含量均显著低于转pBI121型和野生型烟草,但Fv/Fm显著高于转pBI121型和野生型烟草。生长恢复试验中,转pBI121-CsCBF1型的存活率为66.7％,而野生型仅为23.3％。【结论】 茶树CsCBF1基因能够显著增强非低温驯化植物烟草的抗寒性,说明茶树CsCBF1基因存在于细胞抗寒的分子调控途径中,从而提高植物细胞的低温防御能力。     

一个烟草糖基转移酶启动子在转基因烟草植株中的表达分析（摘要）

[目的]研究从烟草中克隆的1个受水杨酸和茉莉酸甲酯诱导表达的新的糖基转移酶基因（sm-Ngt）启动子部分缺失片段在烟草中的表达。[方法]以转sm-Ngt5个不同长度的5’端缺失的启动子与Gus基因融合植物表达载体的T1代转基因植株为材料,用茉莉酸甲酯（MeJA）和水杨酸（SA）处理16h后分别进行GUS组织化学染色和荧光定量法测定GUS酶活性,分析水杨酸和茉莉酸甲酯对sm-Ngt5个不同长度的5’端缺失的启动子表达的影响。[结果]在5个不同缺失片段启动子的转基因T1代生长30d的植株中,转-220～0bp片段的GUS染色最少,转-524～0bp及-468～0bp片段的染色最深。在没有MeJA和SA诱导处理时,-524～0bp和-468～0bp2个启动子片段启动的GUS活性最高,远高于-1150～0、-800～0、-220～0bp片段的活性,并且不是由于基因拷贝数而引起的（Southern杂交结果）;-800～0bp启动子片段启动的GUS活性受到MeJA和SA双重诱导,-1150～0bp启动子片段启动的GUS活性受到MeJA的诱导。[结论]在sm-Ngt启动子的-524～-220bp存在提高启动子活性调控元件,-1150～-524bp存在抑制启动子活性的序列,并且存在MeJA和SA双重诱导启动子活性调控元件。     

转獐茅AlNHX基因烟草的耐盐生理研究

[目的]研究从禾本科盐生植物獐茅中分离的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因AlNHX在盐胁迫下的功能和表达。[方法]转化AlNHX的烟草经过抗生素和PCR筛选后,用不同浓度的NaCl处理30 d,测定其单株干重、相对电导率、细胞渗透压以及K+/Na+比。[结果]在不同浓度NaCl处理下,转基因烟草的相对干重和细胞渗透压均高于对照烟草。在300 mmol/L NaCl处理下,转基因烟草的相对电导率明显低于对照。K+、Na+含量测定表明在盐胁迫下转基因烟草的根部和叶片均维持一个相对较高的K+/Na+水平。[结论]AlNHX是一个有效的耐盐基因,可进一步应用于单子叶农作物的基因改良研究。     

转群体感应淬灭基因attM烟草抗青枯病的研究

自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)克隆获得attM基因。采用叶盘转化法,农杆菌介导转化烟草,经过卡那霉素抗性筛选获得抗性愈伤组织,对其分化产生的植物株系进行PCR、PCR-Southern和荧光定量PCR及GUS染色检测分析。结果表明:attM基因被成功插入烟草基因组DNA中。在转基因株系中均能够表达,相对表达量最大可达125.8,最小为31.0。以野生型烟草和转pBI121空载体的烟草为对照,分别进行了离体及活体检测试验,结果表明:转attM基因烟草植株对茄科雷尔氏菌引起的青枯病抗性显著。1×107～1×108CFU.mL-1的青枯菌接种离体叶片,野生型烟草和转pBI121空载体的烟草的中毒面积与接种面积比值为15～25,转基因植株的比值低于3;青枯菌3×106CFU.mL-1伤根接种盆栽烟草植株14d,野生株和转空载体烟草均青枯死亡,病情指数为100,转基因植株病情指数为31.25。     

紫花苜蓿MsCOL1基因植物表达载体的构建及拟南芥转化

[目的]构建紫花苜蓿MsCOL1基因植物的表达载体。[方法]根据紫花苜蓿CONSTANS类似基因MsCOL1基因(登录号:DQ661682)序列,设计含有酶切位点的一对特异性引物,以紫花苜蓿cDNA为模板,获得MsCOL1基因完整编码区DNA序列,并将目的片段插入表达载体pBI121的相应位置,构建植物表达载体35S∷MsCOL1,再利用农杆菌介导方法将35S∷MsCOL1转化到拟南芥中。[结果]分析测序结果显示,所获得克隆为插入目的片段的阳性克隆。经RT-PCR检测,证明转基因植株中MsCOL1基因能够顺利表达。[结论]该方法成功构建植物表达载体35S∷MsCOL1,并获得了转基因拟南芥植株。     

低温对转CBF3基因烟草叶绿体超微结构和生理特性的影响

[目的]探明低温胁迫下转拟南芥CBF3基因烟草幼苗抗寒性相关生理指标和叶绿体超微结构的变化规律。[方法]4℃低温胁迫8 h后,测定转基因烟草幼苗叶片内超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性和丙二醛（MDA）含量,同时对叶绿体的超微结构进行观察。[结果]低温胁迫转基因烟草幼苗叶片内SOD、POD活性和MDA含量与未转基因烟草之间存在极显著差异（P〈0.01）。透射电镜观察结果表明,低温胁迫转基因烟草叶绿体结构基本是完整的,未转基因烟草叶绿体由杆状变成圆球形,数量有所增加,出现聚集现象,基粒片层混乱。[结论]叶绿体的超微结构和生理指标变化结果表明,转基因烟草对低温具有更好的适应能力。     

过量表达紫茎泽兰类黄酮-3’羟化酶基因对转基因烟草POD、PAL活性的影响

紫茎泽兰具有强烈的化感作用,可抑制周围其他植物生长。类黄酮3’-羟化酶（F3’H）属于细胞色素P450（CYP）单加氧酶,具有催化多种依赖NADPH或NADH的底物氧化反应的功能,在植物化感作用中行使一定的功能。利用转F3’H基因的烟草为实验材料,分别测定转F3’H基因植株、转pBI121空载体植株和野生型植株的过氧化物酶（POD）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性,结果表明,转F3’H基因植株的POD活性分别是野生型植株和转空载体植株的3.8倍和2.0倍,而PAL活性则相应为4.0倍和2.0倍。由此推断F3’H基因在抵御伤害方面具有重要作用。     

白色打孔地膜在膜下烤烟上的应用

[目的]解决膜下烤烟人工开孔破膜费工耗时和破膜不及时导致烟苗素质差、高温高湿蒸死烟苗、烟苗成活率低的问题。[方法]开展了不同开孔位置及大小的白膜对膜下烤烟影响的试验。[结果]中低海拔烟区移栽膜下烤烟使用烟苗正上方中间开孔2 cm白色地膜,移栽至掏苗前14∶00可降低膜内温度4~12℃,烟苗成活率提高11.5百分点,烟株早生快发,减轻病害,大田生育期提早5 d,减少人工破膜开口用工7.5个/hm~2,产量和产值比对照分别提高418.35 kg/hm~2、4 165.65元/hm~2,经济效益明显。[结论]中低海拔烟区膜下烤烟移栽使用相邻2株烟苗中间开孔2 cm白色地膜是可行的。