miR-93对延边黄牛垂体细胞GH分泌的影响

为了分析血液外泌体miRNA对延边黄牛垂体细胞生长激素（GH）分泌的影响,试验选择在延边黄牛和韩延牛血液外泌体中存在显著差异表达的miR-93,分析其对延边黄牛垂体细胞GH分泌的影响机制。试验首先进行延边黄牛垂体细胞的原代培养,之后将miR-93的mimics（miR-93-mi组）、mimics对照品（NC对照组）、inhibitor（miR-93-in组）、inhibitor对照品（iNC组）转染给已建立的垂体原代细胞,48 h后收集细胞,提取总mRNA和总蛋白。试验利用targetscan和RNAhybrid分析软件对miR-93的靶基因进行预测,并利用双荧光素酶报告基因系统对miR-93的靶关系进行验证;利用实时荧光定量PCR和Western blotting技术分别检测靶基因mRNA转录和蛋白的表达情况,结果表明,miR-93靶向了生长激素释放激素受体（GHRHR）的3'UTR;与NC对照组比较,miR-93-mi组的延边黄牛垂体细胞中GH mRNA转录和蛋白表达均极显著低于NC对照组（P<0.01）;miR-93-mi组的GHRH mRNA转录和蛋白表达均极显著低于NC对照组（P<0.01）,而miR-93-in组的GHRHR蛋白表达显著高于iNC对照组（P<0.05）。说明miR-93可通过调节GHRHR的表达而调控延边黄牛垂体细胞GH的分泌,进而调控延边黄牛的生长发育。     

miR-23b-3p对延边黄牛垂体细胞中生长激素分泌影响的研究

为了分析血液外胞体miRNA对延边黄牛垂体细胞中生长激素(GH)分泌的影响,试验选择在延边黄牛和韩延牛血液外胞体中存在显著差异表达的miR-23b-3p,分析其对延边黄牛垂体细胞中GH分泌的影响机制。首先进行延边黄牛垂体细胞的原代培养,然后将miR-23b-3p的mimics(miR-23b-3p-mi组)、mimics对照品(NC组)、inhibitor(miR-23b-3p-in组)、inhibitor对照品(iNC组)转染至已建立的垂体原代细胞中,48 h后收集细胞,提取总mRNA和总蛋白,利用实时荧光定量PCR(qPCR)和Western-blot技术分别检测GH mRNA转录和蛋白的表达情况;利用targetscan和RNAhybrid分析软件对miR-23b-3p的靶基因进行预测,再利用双荧光素酶报告基因系统对miR-23b-3p的靶关系进行了验证;最后利用实时荧光定量PCR和Western-blot技术分别检测miR-23b-3p靶基因的mRNA转录和蛋白表达情况。结果表明:miR-23b-3p-mi组的延边黄牛垂体细胞中GH mRNA转录和蛋白表达水平极显著低于NC组(P0.01),而miR-23b-3p-in组的延边黄牛垂体细胞中GH mRNA转录和蛋白表达水平显著高于iNC组(P0.05);miR-23b-3p靶向了垂体特异性转录因子(POU1F1)的3′UTR;miR-23b-3p-mi组的POU1F1 mRNA转录和蛋白表达水平极显著低于NC组(P0.01),而miR-23b-3p-in组的POU1F1 mRNA转录和蛋白表达水平极显著高于iNC组(P0.01)。说明miR-23b-3p可通过调节POU1F1基因的表达来调控延边黄牛垂体细胞GH的分泌,进而调控延边黄牛的生长发育。     

miR-1468对延边黄牛垂体细胞生长激素分泌影响的研究

为研究血液外胞体中miRNA对延边黄牛垂体细胞中生长激素(GH)分泌的影响,本研究选择在延边黄牛和韩延牛血液外胞体中显著差异表达的miR-1468,利用实时定量PCR(qPCR)和Western blot技术,研究了miR-1468对延边黄牛垂体细胞中GH分泌水平的影响及miR-1468与靶基因之间的调控机制。结果显示,miR-1468水平的增加能显著抑制延边黄牛垂体细胞中GH mRNA和蛋白的表达(P0.01),反之降低miR-1468水平能显著提高GH mRNA(P0.05)和蛋白(P0.01)的表达。生物信息学分析和双荧光素酶报告基因系统结果显示,miR-1468靶向了环磷腺苷效应元件结合蛋白1(CREB1)的3′UTR;miR-1468水平的增加能够显著抑制CREB1 mRNA和蛋白的表达(P0.01),反之降低miR-1468水平能显著提高CREB1 mRNA和蛋白的表达(P0.01)。本研究表明,miR-1468可通过调节CREB1基因的表达而调控垂体细胞GH的分泌,该结果将为研究外胞体miRNA调控动物生长发育机制提供理论依据。     

miR-10b对牛卵巢颗粒细胞凋亡的影响

颗粒细胞是卵巢中必需的体细胞,在卵泡发育过程中起重要作用。为探究miR-10b对牛卵巢颗粒细胞凋亡的影响,本实验中2个处理组分别转染miR-10b模拟物(miR-10b mimics)和miRNA模拟物(mimics NC),转染48h后,通过Quantitativereal-timePCR(qRT-PCR)检测内源miR-10b表达量,明确miR-10b mimics转染成功。利用qRT-PCR和Western Blot检测凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax表达量的变化;利用流式细胞术检测颗粒细胞凋亡率。结果显示:与mimics NC组相比,miR-10b mimics组Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平显著降低,Bax和Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平显著升高;同时miR-10b mimics组的细胞凋亡率较mimics NC组显著升高。结果表明,miR-10b可促进牛卵巢颗粒细胞凋亡。     

miR-145a-3p通过靶向ATG14调控布鲁氏菌诱导的RAW264.7自噬

【目的】 探究miR-145a-3p对布鲁氏菌诱导的巨噬细胞（RAW264.7）自噬及其对布鲁氏菌胞内生存的影响。【方法】 首先合成自噬相关miRNA miR-145a-3p的模拟物（miR-145a-3p mimics）和抑制剂（miR-145a-3p inhibitor）及对照模拟物（NC mimics）,转染至GFP-RFP-RAW264.7细胞中,然后用布鲁氏菌侵染该细胞24 h,通过激光共聚焦显微镜观察miR-145a-3p对自噬的影响;运用TargetScan、miRBase等生物信息学软件预测miR-145a-3p的靶蛋白;通过构建PmirGLO-ATG14-3'UTR和PmirGLO-ATG14-3'UTR-mutation重组质粒,用SacⅠ和KpnⅠ进行双酶切鉴定,并利用双荧光素酶报告系统验证miR-145a-3p与自噬相关基因（autophagy-related gene 14,ATG14）的靶向关系;将RAW264.7细胞培养至60%汇合时,分别转染miR-145a-3p mimics、miR-145a-3p inhibitor和NC mimics,转染7 h后用布鲁氏菌侵染,添加PBS作为未感染对照,培养24 h收集细胞,利用实时荧光定量PCR、Western blotting检测miR-145a-3p对ATG14 mRNA和蛋白表达的调控作用;最后通过布鲁氏菌侵染已转染miR-145a-3p的巨噬细胞,进行菌落计数,验证miR-145a-3p对布鲁氏菌胞内生存的影响。【结果】 miR-145a-3p mimics促进布鲁氏菌诱导的细胞自噬,miR-145a-3p inhibitor抑制布鲁氏菌诱导的细胞自噬;软件预测结果表明,miR-145a-3p靶基因为自噬相关蛋白ATG14-3'UTR;双酶切结果显示,重组质粒PmirGLO-ATG14-3'UTR和PmirGLO-ATG14-3'UTR-mutation构建成功;双荧光素酶报告基因系统验证miR-145a-3p mimics与ATG14-3'UTR互相作用时,与NC mimics组相比,miR-145a-3p mimics组荧光值极显著降低（P<0.01）。与NC mimics组相比,未感染布鲁氏菌时,miR-145a-3p mimics组ATG14 mRNA水平极显著降低（P<0.01）、ATG14蛋白的表达水平显著降低（P<0.05）,miR-145a-3p inhibitor组ATG14 mRNA水平极显著上调（P<0.01）;布鲁氏菌感染后,miR-145a-3p mimics+Bru组ATG14 mRNA水平极显著提高（P<0.01）,且miR-145a-3p mimics+Bru组ATG14 mRNA的水平显著高于NC mimics+Bru组（P<0.05）。miR-145a-3p mimics促进ATG14蛋白的表达水平。miR-145a-3p的过表达导致布鲁氏菌的胞内生存数量显著降低（P<0.05）。【结论】 miR-145a-3p在布鲁氏菌感染细胞后高表达,miR-145a-3p通过靶向ATG14促进自噬,抑制布鲁氏菌复制。     

miR-145-5p靶向IGF1R介导AKT通路抑制猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化

旨在探讨miR-145-5p对猪骨骼肌卫星细胞增殖和分化的影响。本研究采用qRT-PCR检测miR-145-5p的组织表达谱和发育性表达规律;选用1 d晋汾白猪趾长伸肌进行骨骼肌卫星细胞的分离与培养,分别转染miR-145-5p模拟物(mimics)及其对照组(mimics NC),miR-145-5p抑制剂(inhibitor)及其对照组(inhibitor NC),每个处理3个重复,利用qRT-PCR、EdU和CCK-8方法检测增殖相关基因表达量、EdU阳性细胞数和细胞增殖活性;待猪骨骼肌卫星细胞分化后利用qRT-PCR、Western blot和免疫荧光染色方法探究分化相关基因mRNA和蛋白水平及肌管形成情况;采用双荧光素酶试验、qRT-PCR和Western blot探究miR-145-5p对下游IGF1R和AKT通路的影响。结果显示,miR-145-5p基因在肝和肺中表达量最高,心和皮下脂肪中次之(P<0.05);随着日龄的增加,miR-145-5p在猪背最长肌中的表达量持续升高(P<0.05)。在猪骨骼肌卫星细胞体外培养过程中,转染miR-145-5p mimi...     

miR-374b及其靶基因Myf6调控成肌细胞增殖分化的研究

本实验旨在研究miR-374b及其靶基因Myf6调控肌细胞增殖分化的作用机制。首先采集70日龄胎羊,培养成肌细胞并诱导分化成肌管,通过荧光定量PCR测定诱导分化时期(0、24、72、120 h)miR-374b、Myf6基因以及成肌细胞增殖标志基因MyoD和分化标志基因MyoG、MyHC在mRNA水平的表达量;通过转染miR-374b过表达载体(mimics)及抑制载体(inhibitor),研究各基因在细胞中mRNA水平的表达规律;采用蛋白免疫印迹技术检测Myf6基因在细胞中蛋白水平表达变化规律。结果表明:细胞在分化第72、120小时出现大量肌管,诱导分化成功;miR-374b的表达趋势为先上升后下降,细胞增殖标志基因MyoD在细胞增殖期(0 h)表达量较高;分化标志基因MyHC、MyoG及Myf6基因在细胞增殖期表达量较低,进入分化阶段后表达量极显著上调;转染miR-374b过表达载体(mimics)后,miR-374b表达量极显著高于阴性对照组,而Myf6基因、MyHC基因表达量极显著低于阴性对照组;Myf6基因蛋白表达量极显著低于阴性对照组;转染miR-374b抑制载体(inhibitor)后,miR-374b表达量极显著低于阴性对照组,而Myf6、MyHC、MyoD基因表达量极显著高于阴性对照组;Myf6基因蛋白表达量极显著高于阴性对照组;MyoG基因表达量显著低于阴性对照组。上述结果表明,miR-374b可能通过靶向Myf6基因抑制绵羊成肌细胞分化。     

miR-196a降调RCC2对睾丸支持细胞增殖的促进作用

为探究miR-196a对猪未成熟支持细胞增殖的影响及其机制,将miR-196a的激活剂(mimics)、抑制剂(inhibitor)及miR-ShNC转染至支持细胞,MTS方法检测细胞活力。发现miR-196a mimics能促进支持细胞的增殖,miR-196a inhibitor抑制细胞增殖;使用Targetscan软件预测miR-196a靶基因为RCC2 (regulator of chromosome condensation 2),将miR-196a的mimics及inhibitor转染支持细胞后使用RT-qPCR和Western blot法检测RCC2的表达,结果显示miR-196a下调RCC2的表达,RCC2是miR-196a的靶基因;使用RCC2的siRNA与miR-196a inhibitor共转染支持细胞,MTS方法观察支持细胞活力,发现干扰RCC2基因后,可促进支持细胞的增殖。本研究表明miR-196a通过下调RCC2促进支持细胞的增殖,为后续探索miR-196a在猪睾丸支持细胞发挥的作用提供一定的试验基础和理论依据。     

肉牛DKK3基因3'UTR双荧光素酶报告质粒构建及与miR-25的靶向验证

实验旨在鉴定miR-25与肉牛DKK3基因之间的靶向关系，为开展miR-25调控肉牛肌内脂肪生成的分子机制研究奠定基础。利用生物信息学分析软件TargetScan预测miR-25的潜在靶基因及结合位点，然后PCR扩增包含miR-25结合位点的肉牛DKK3基因3’非编码区（3’UTR）片段，构建DKK33’UTR野生型、突变型及删除型双荧光素酶报告基因质粒，并分别与miR-25 mimics和mimics NC共转染牛肾细胞（MDBK），检测双荧光素酶活性；此外，miR-25 mimics、mimics NC、miR-25 inhibitor、inhibitor NC分别转染MDBK细胞，荧光定量PCR和Western blot检测DKK3表达量。结果表明：TargetScan软件预测到miR-25具有包括DKK3在内的共944个潜在靶基因，且与DKK3结合的靶位点位于DKK3基因3’UTR的25～32 bp处；构建的3种质粒经双酶切后释放出大小约321 bp的条带，测序结果与预期一致，表明质粒构建成功；miR-25mimics可显著降低DKK3野生型质粒的双荧光素酶活性；过表达miR-...     

miR-137-3p靶向MAX基因对前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的影响

【目的】研究miR-137-3p在前脂肪细胞(3T3-L1)分化过程中的功能及作用机制。【方法】收集诱导分化第0、2、4、6和8天的3T3-L1细胞,利用实时荧光定量PCR检测miR-137-3p相对表达量;将miR-137-3p的模拟物(mimics)、抑制物(inhibitor)和阴性对照(NC)分别转染3T3-L1细胞并诱导成脂分化,油红O染色观察脂滴形成情况,利用实时荧光定量PCR检测成脂标志基因CAAT增强子结合蛋白α(C/EBPα)、C/EBPβ、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)和脂肪酸结合蛋白4(FABP4)相对表达量,用Western blotting检测C/EBPβ、PPARγ和FABP4蛋白表达水平;利用TargetScan在线网站预测miR-137-3p的靶基因,比对候选靶基因3′-UTR区与miR-137-3p结合位点在不同物种间的序列保守性。分别将miR-137-3p mimics、NC与3′-UTR-WT和3′-UTR-Mut载体共转染HEK293T细胞,利用双荧光素酶报告试验检测miR-137-3p与MYC相关因子X(MAX)基因的靶向关系。将s...     

奶牛乳腺上皮细胞中Bta-miR-877靶基因的初步验证

利用高通量测序的方法筛选出在高脂奶牛和低脂奶牛中差异表达的miR-877和其预测的靶基因。通过生物信息学方法预测出edn1、ptgis可能是miR-877的靶基因,之后通过荧光定量检测miR-877以及其靶基因的表达量。结果显示,转染miR-877mimics组miR-877的相对表达量显著高于转染miR-877inhibitor组;靶基因的相对表达量,转染miR-877mimics组的edn1、ptgis基因表达水平均显著低于转染miR-877inhibitor组(P<0.01)。经GraphPad Prism6分析显示,edn1、ptgis基因的相对表达量与miR-877的表达量呈负相关,初步验证edn、ptgis是miR-877的靶基因。本试验为深入了解miR-877在乳脂质代谢调节中的作用提供依据,从而为生产实践提供一定的理论基础。     

miR-130b靶向PPARγ抑制家兔前体脂肪细胞分化

旨在探究miR-130b是否可通过靶向PPARγ抑制家兔前体脂肪细胞的分化。采集初生新西兰仔兔肾周脂肪细胞进行原代培养,鸡尾酒法诱导分化后,用RT-qPCR分别测定前体脂肪细胞分化第0、第2、第6、第10天miR-130b表达量及PPARγ(Peroxisome Proliferators-Activated Receptorγ,PPARγ)和C/EBPα(CCAAT/enhancer binding proteinα,C/EBPα)mRNA的表达量,生物信息学软件鉴定miR-130b的同源性,预测miR-130b的靶基因;前体脂肪细胞转染miR-130bmimic和miR-130binhibitor后,检测miR-130b、PPARγ和C/EBPα的表达差异,用油红O染色鉴定前体脂肪细胞分化程度。结果表明:1)在前体脂肪细胞分化过程中,miR-130b、PPARγ和C/EBPα表达量存在差异;分化第8天时,油红染色发现大量橘红色脂滴;生物信息学软件预测PPARγ可作为miR-130b的靶基因,且miR-130b在哺乳动物中具有较高的同源性。2)过表达miR-130b后,mimic组PPARγ和C/EBPα的表达量极显著低于NC组(P0.01)。3)抑制表达miR-130b后,inhibitor组PPARγ的表达量极显著高于inhibitor NC组(P0.01),inhibitor组C/EBPα表达量显著高于inhibitor NC组(P0.05)。4)油红O染色显示分化程度:inhibitor组NC组mimic组。综上所述,miR-130b在家兔前体脂肪细胞分化过程中差异表达,且可通过靶向PPARγ抑制前体脂肪细胞分化。     

奶牛乳腺上皮细胞中miR-224靶基因的初步验证

利用生物信息学方法预测出miR-224可能的靶基因为ACADM、ACAT1、ALDH2和LPL,然后用实时荧光定量法检测了miR-224与其靶基因在奶牛乳腺上皮细胞中的表达量。结果显示:(1)miR-224的相对表达量。转染shNc组表达量低于转染mimics组而高于inhibitor组。(2)靶基因荧光定量结果表明,ACADM、ALDH2和LPL基因转染shNc组表达量低于转染inhibitor组而高于mimics组。(3)经SPSS22.0相关性分析表明:在乳腺上皮细胞中,ACADM、ALDH2和LPL基因的表达量与miR-224的表达量呈显著负相关,ACAT1基因与miR-224没有显著联系。初步验证说明,ACADM、ALDH2和LPL基因可能是miR-224的靶基因,为进一步探索miR-224在奶牛乳牛乳腺上皮细胞发挥的作用提供了一定的理论依据和研究基础。     

miR-218-5p调控安哥拉兔毛囊毛乳头细胞增殖的研究

本文旨在探讨miRNA-218-5p对兔毛乳头细胞毛囊发育相关基因的影响,为研究家兔毛囊发育中的作用机制提供理论依据。用酶消化法分离兔毛乳头细胞,用MSCM培养基培养毛乳头细胞。将培养的毛乳头细胞分为4组,分别转染miR-218-5p mimics、miR-218-5p mimics NC、miR-218-5p inhibitor、miR-218-5pinhibitorNC。培养48h后,收集细胞。使用RNA提取试剂盒提取各组RNA,使用RT-qPCR检测各组miR-218-5p的mRNA表达水平和毛囊生长发育相关基因表达水平。使用CCK-8检测各组细胞增殖情况。结果发现,在兔DPCs(Dermal Papilla Cells)中过表达miR-218-5p能够显著上调毛囊生长发育相关基因如CCND1、CTNNB1、LEF1的mRNA表达水平,显著下调TGF-β1、BMP4的mRNA表达水平;敲减miR-218-5p能够显著下调毛囊生长发育相关基因如CCND1、CTNNB1、LEF1的mRNA表达水平,显著上调TGF-β1、BMP4的mRNA表达水平。过表达miR-218-5p后,极显著...     

miR-181a和miR-181d-5p对猪前体脂肪细胞成脂分化调控的研究

【目的】 探究miR-181a和miR-181d-5p在荣昌猪原代前体脂肪细胞分化中的作用及机制。【方法】 通过比对种子序列差异分析miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠不同物种间的序列保守性；实时荧光定量PCR检测miR-181a和miR-181d-5p在猪肌肉和背部皮下脂肪组织中表达；利用miRandn和TargetScan在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p的靶基因，并进行GO和KEGG富集分析；使用RNAhybrid在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合自由能。取7日龄雄性荣昌猪背部皮下脂肪组织分离原代前体脂肪细胞。分别设计miR-181a和miR-181d-5p的靶基因野生型和突变型载体，并与对应的miRNA共转染前体脂肪细胞，进行双荧光素酶报告基因试验验证miRNA与靶基因的靶标关系，测定miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合情况。构建miR-181a和miR-181d-5p的模拟物（miR-181a mimics、miR-181d-5p mimics）、抑制物（miR-181a inhibitor、miR-181d-5p inhibitor）、阴性对照（NC）及其靶基因的干扰siRNA （Gene-siRNA），转染细胞6 h后进行诱导分化。6 d后，分别对不同处理的细胞通过实时荧光定量PCR检测基因表达情况，油红O染色鉴定甘油三酯生成情况。【结果】 保守性分析结果表明，miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠间具有高度序列保守性；miR-181a与miR-181d-5p在猪不同组织中定量结果显示，miR-181a与miR-181d-5p在猪脂肪组织中特异性高表达；靶基因预测结果表明，miR-181a与miR-181d-5p的靶基因分别为线粒体甘油3-磷酸脱氢酶（GPD2）和环腺苷酸反应元件（CREB1）；GO和KEGG功能富集分析发现，miR-181a和miR-181d-5p的靶基因可以抑制甘油三酯生成，调节脂肪细胞分化，且miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的自由结合能均<－87.8 kJ/mol；双荧光素酶报告基因试验结果表明，转染miR-181a与miR-181d-5p的mimics可以极显著抑制靶基因3'-UTR野生型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性（P<0.01），但不影响靶基因突变型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性。诱导分化结果表明，与未分化脂肪细胞（0 d）相比，miR-181a表达量在分化的第4天显著升高（P<0.05），到第6天达到极显著差异（P<0.01）；miR-181d-5p及GPD2和CREB1基因表达量在分化的第4、6天均极显著升高（P<0.01）。miR-181a和miR-181d-5p的细胞转染试验均得到相似结果，与NC组相比，mimics组miR-181a与miR-181d-5p的表达量均极显著上升（P<0.01），inhibitor组miR-181a与miR-181d-5p表达量均极显著下降（P<0.01）；mimics和siRNA组的GPD2与CREB1基因表达量均极显著下降（P<0.01），inhibitor组GPD2与CREB1基因表达量均极显著上升（P<0.01）；mimics和siRNA组PPARγ和C/EBPα基因的相对表达量均显著或极显著上升（P<0.05；P<0.01），inhibitor组PPARγ和C/EBPα基因的表达量均显著下降（P<0.05）；油红O染色结果表明，与NC组相比，mimics和siRNA组细胞脂滴数目增加，inhibitor组细胞脂滴数目减少。【结论】 miR-181a和miR-181d-5p可以分别靶向结合GPD2和CREB1基因3'-UTR区域序列，降低GPD2和CREB1基因的表达，促进猪前体脂肪细胞成脂分化。     

miR-16a对牛肌卫星细胞增殖和分化的影响

为了探究miR-16a对牛肌卫星细胞增殖和分化的影响,试验通过NCBI和Ensembl数据库分析整合miR-16a的位置及信息,用miR-16a mimics转染牛肌卫星细胞,将牛肌卫星细胞分为试验组(miR-16a mimics)和对照组(NC),采用实时荧光定量PCR扩增、Western-blot检测和EdU细胞增殖试验对转染处理后的牛肌卫星细胞的增殖和分化两个时期进行研究。结果表明：miR-16a位于牛12号染色体的反义链上,并由前体bta-miR-16a的5′端加工生成成熟的miR-16a。在增殖期,与对照组比较,试验组增殖标志因子Pax7 mRNA和其蛋白相对表达量显著或极显著下调(P<0.05或P<0.01),EdU标记指数显著降低(P<0.05)。在分化期,与对照组比较,试验组分化标志因子MyoG mRNA相对表达量极显著下调(P<0.01)。说明miR-16a对牛肌卫星细胞的增殖和分化均存在抑制作用。     

miR-27a-3p对绵羊皮肤黑色素细胞中Scf表达的影响

目的:旨在研究miR-27a-3p对黑色素细胞中Scf(stem cell factor)表达的影响,从而明确miR-27a-3p对黑色素生成的影响。方法:将miR-27a-3p mimic(模拟物)、(抑制物)及各自对应的阴性参照物(mimic NC(negative control),inhibitor N C)分别转染绵羊皮肤黑色素细胞,荧光定量PCR和Western Blot测定转染48h后绵羊黑色素细胞中的Scf mRNA和蛋白的表达量。结果:与对照组相比,转染mimic的黑色素细胞中,Scf mRNA和蛋白的表达量都极显著地减少(p0.01),而转染miR-27a-3p inhibitor的黑色素细胞中,Scf mRNA和蛋白的表达量极显著增多(p0.01)。结论:miR-27a-3p抑制绵羊皮肤黑色素细胞中Scf的表达。     

miR-140-5p对前脂肪细胞3T3-L1成脂分化的机制研究

【目的】研究miR-140-5p在前脂肪细胞（3T3-L1）成脂分化过程中的功能及其作用机制。【方法】待3T3-L1细胞汇合度达100%时诱导其成脂分化，收集分化第―1（诱导分化前1 d）、0、1、2、3、5、7天的细胞，用实时荧光定量PCR检测miR-140-5p相对表达量；将miR-140-5p mimics、NC转染3T3-L1细胞并诱导成脂分化，油红O染色观察脂滴形成情况，实时荧光定量PCR检测成脂标志基因CAAT增强子结合蛋白β（C/EBPβ）、CAAT增强子结合蛋白δ（C/EBPδ）与过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）相对表达量；利用miRandn和TargetScan在线网站预测miR-140-5p的靶基因；通过对比序列差异分析P300/CBP相关因子（PCAF）的3'-UTR序列中与miR-140-5p的结合位点序列在小鼠、人等不同物种间的序列保守性。将miR-140-5p mimics、inhibitor、NC转染3T3-L1细胞并诱导成脂分化，实时荧光定量PCR检测miR-140-5p、PCAF相对表达量，Western blotting检测PCAF蛋白水平；将PEGFP-N1-PCAF、PEGFP-N1转染3T3-L1细胞，油红O染色观察脂滴形成情况，实时荧光定量PCR检测PCAF、C/EBPδ、PPARγ基因相对表达量，Western blotting检测C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ蛋白表达水平。将3条PCAF siRNA（siRNA1、siRNA2、siRNA3）、siRNA NC转染3T3-L1细胞，Western blotting法检测PCAF蛋白水平，筛选最佳PCAF siRNA。将最佳PCAF siRNA和siRNA NC转染3T3-L1细胞，油红O染色观察脂滴形成情况，实时荧光定量PCR检测PCAF、C/EBPβ、C/EBPδ与PPARγ基因相对表达量，Western blotting检测C/EBPβ、PPARγ蛋白表达水平。分别将miR-140-5p mimics、NC与PGL0-PCAF 3'-UTR载体和PGLO空载体共转染293T细胞，用双荧光素酶报告试验检测miR-140-5p与PCAF的靶向关系。【结果】在诱导3T3-L1细胞成脂分化过程中，与诱导分化前1 d相比，在细胞成脂分化第1、2天时miR-140-5p相对表达量极显著升高（P＜0.01），在分化第3天时显著升高（P＜0.05）。与NC组相比，miR-140-5p mimics组脂滴数量明显增加，miR-140-5p mimics组成脂标志基因C/EBPδ与PPARγ相对表达量均极显著升高（P＜0.01）。靶基因预测结果表明，miR-140-5p与PCAF存在预期结合位点；保守性分析结果表明，靶基因PCAF结合位点序列在不同物种间具有高度保守性。与NC组相比，mimics组miR-140-5p和PCAF相对表达量均极显著升高（P＜0.01），inhibitor组miR-140-5p极显著降低（P＜0.01）、PCAF显著降低（P＜0.05），PCAF蛋白表达量显著升高（P＜0.05）。与PEGFP-N1组相比，PEGFP-N1-PCAF组脂滴数量增多，PCAF、PPARγ基因相对表达量和C/EBPβ、C/EBPδ蛋白水平极显著升高（P＜0.01），PPARγ蛋白水平显著升高（P＜0.05）。PCAF siRNA1、siRNA2与siRNA3均极显著抑制PCAF蛋白的表达（P＜0.01），siRNA3的效果最显著，因此选择siRNA3进行后续试验。与NC组相比，PCAF siRNA3组3T3-L1细胞中脂滴数量较少，PCAF、C/EBPβ、C/EBPδ、PPARγ基因相对表达量和C/EBPβ蛋白水平均极显著下降（P＜0.01）。双荧光素酶报告试验结果显示，miR-140-5p与PCAF基因之间无靶标关系。【结论】内源性miR-140-5p在3T3-L1细胞分化过程中表达升高，miR-140-5p可能通过间接上调PCAF基因表达促进3T3-L1细胞成脂分化。     

miR-17-3p靶向KCTD15调控延边黄牛前体脂肪细胞分化

旨在探究miR-17-3p是否可以通过靶向KCTD15调节延边黄牛前体脂肪细胞的分化。本研究使用生物信息学软件鉴定miR-17-3p的同源性，预测miR-17-3p的靶基因；通过在延边黄牛的前体脂肪细胞中转染miR-17-3p mimic或miR-17-3p inhibitor及阴性对照实现细胞内miR-17-3p过表达或抑制表达；采用双荧光素酶报告基因检测系统确定miR-17-3p与KCTD15的靶标关系；使用qRT-PCR和Western blot技术在mRNA和蛋白水平上检测miR-17-3p对KCTD15基因以及脂代谢标志基因PPARγ和C/EBPα表达水平的影响。结果表明，生物信息学软件预测KCTD15可作为miR-17-3p的靶基因，且miR-17-3p在哺乳动物中具有较高的同源性；转染miR-17-3p mimic后脂代谢标志基因PPARγ和C/EBPα的mRNA和蛋白表达量显著或极显著高于转染NC-mimic的对照组（P<0.05或P<0.01）；抑制miR-17-3p的表达后，PPARγ和C/EBPα的表达量则显著或极显著低于对照组（P<0.05或P<0.01）；双荧光素酶报告基因验证分析显示，过表达miR-17-3p极显著抑制了含有KCTD15 3'UTR片段的载体的荧光活性（P<0.01）；过表达miR-17-3p也会显著或极显著抑制候选靶基因KCTD15 mRNA和蛋白质的表达量（P<0.05或P<0.01）；而抑制miR-17-3p的表达则会显著提高靶基因KCTD15的mRNA和蛋白质的表达量（P<0.05）。这些结果说明，miR-17-3p可能通过抑制KCTD15的表达促进延边黄牛前体脂肪细胞分化。