河流型水牛TGF-β基因家族鉴定及其胚胎发育早期的表达分析

本研究旨在鉴定河流型水牛中转化生长因子-β （transforming growth factor-β，TGF-β）基因家族成员，分析该家族成员在胚胎发育早期的表达情况，并讨论其可能的作用。根据人类中已鉴定的TGF-β基因家族信息，通过BLASTP在河流型水牛全基因组层面鉴定TGF-β家族成员，同时对牛、山羊和小鼠的TGF-β家族信息进行鉴定，结合5个物种中的TGF-β基因家族信息构建系统进化树。根据河流型水牛胚胎发育早期4个阶段（2-细胞、8-细胞、桑椹胚和囊胚期）的RNA-seq数据分析，通过FPKM（Fragment of Per Kilobase of exon model per Million mapped reads）值计算TGF-β家族成员的表达情况。结果显示，根据人类中的33个TGF-β基因，分别在河流型水牛、牛、山羊和小鼠的基因组中鉴定出32、23、32和26个TGF-β基因，几个物种中TGF-β基因家族成员数量相近且在系统进化树中分布均匀，说明该家族在各个物种中具有分布和功能的保守性。在河流型水牛的32个TGF-β基因中，21个TGF-β基因家族成员在胚胎发育早期不表达或极低剂量表达，6个分化抑制因子低剂量表达，5个高表达的TGF-β基因均有报道过与繁殖过程相关，说明在河流型水牛的胚胎发育早期只有部分成员（5/32）参与其中行使功能，绝大多数的TGF-β基因（27/32）并没有参与其中。本研究结果为河流型水牛中TGF-β基因家族研究提供了数据基础，并为TGF-β基因家族在胚胎发育早期的功能研究提供了理论依据。     

猪TGF-β基因家族成员的鉴定、进化及表达分析

为了明确猪TGF-β基因家族的功能和进化关系,运用HMMER并结合BLAST对猪的TGF-β基因家族成员进行鉴定,运用多种生物信息学方法对序列进行分析,运用转录组数据分析TGF-β基因家族的组织表达规律,并对TGF-β基因家族进行功能富集分析。结果表明：猪TGF-β基因家族共有36个成员,编码蛋白质的氨基酸数量在153～719,相对分子质量在16.44～79.41 kDa,等电点在4.93～11.78,均为亲水性蛋白。二级结构以无规则卷曲为主,其次是α-螺旋。系统进化树分析表明TGF-β基因家族分为三大亚类,猪TGF-β基因家族成员与人和小鼠的TGF-β基因家族成员分别聚集,说明其进化关系较近。基因结构和结构域中同一类群的不同TGF-β基因家族成员具有较高的相似度。转录组数据显示大多数TGF-β基因家族成员在成年公猪和母猪27种不同组织和外周血单核细胞中均有表达,其中GDF1和TGFB2基因在成年猪所有组织中高表达。功能富集分析发现TGF-β基因家族参与众多的生物学过程和病理过程。研究结果为深入解析猪TGF-β基因家族的生物学功能奠定基础。     

香蕉UEV基因家族鉴定及其表达分析

泛素结合酶变体蛋白(Ubiquitin-conjugating E2 enzyme variant, UEV),又被称为类泛素结合酶蛋白家族。 UEV参与激素信号、DNA 损伤和非生物胁迫等多种生物学功能,但尚未见其调控香蕉(Musa acuminata)果实成熟的研究报道。本研究在香蕉中共鉴定到13个UEV基因,MaUEV基因编码区域介于471 bp(MaUEV6)—1637 bp(MaUEV8),编码氨基酸数量介于127 aa(MaUEV6)—495 aa(MaUEV8),分子量介于14212.34 Da—56209.83 Da,13个MaUEV基因的等电点均小于7。8个MaUEV基因为稳定蛋白,5个MaUEV基因为不稳定蛋白,13个MaUEV基因均为亲水性蛋白。13个MaUEV基因均由α-螺旋、β-转角、扩展链结构、无规则卷曲组成。亚细胞定位分析发现除MaUEV3定位在叶绿体、细胞质和细胞核外,其他基因都定位在细胞核。对MaUEV基因结构分析发现,除了MaUEV4没有内含子外,其余12个MaUEV基因均由内含子和外显子组成。对MaUEV基因家族在香蕉后熟过程中的表达分析发现,MaUEV9表达量在香蕉后熟过程中逐渐下降并在成熟时显著下调,MaUEV13在香蕉后熟过程中逐渐增加并在成熟时表达量显著上调,据此推测MaUEV9 和MaUEV13在香蕉后熟过程中起着不同的作用。本研究可为后续深入阐明UEV基因家族不同成员在香蕉后熟过程中的作用奠定基础。     

水牛卵母细胞体外受精与早期胚胎发育的研究

本实验通过 3种水牛卵母细胞体外成熟培养系统的比较 ,与早期胚胎发育研究结果表明 ,3组是最好的培养系统 ,卵母细胞成熟率为 5 1.9% (2 8 5 4 ) ;卵裂率为 5 2 .76 %± 9.0 8% (193 35 9) ;囊胚率 (占授精卵数 )为 2 7.2 2 %± 9.17% (10 1 35 9)、(占分裂卵数 )为 5 2 .13%± 16 .32 % (10 1 193) ;孵化囊胚率为 83.34%± 11.5 6 % (85 10 1)。该系统为含 10 %FBS的TCM - 199液中添加促性腺激素FSH、LH ,类固醇激素E2 ,表皮生长因子 (EGF)和硫醇类化合物β—巯基乙醇 (β—ME)的较完善系统。据 39批次早期胚胎体外发育至囊胚 (343枚 )所需时间 (以授精当日为 0d计算 )分析 ,5d囊胚 2枚 (0 .6 % ) ;6d囊胚 89枚 (2 5 .9% ) ;7d囊胚14 9枚 (43.4 % ) ;8d囊胚 73枚 (2 1.3% ) ;9d囊胚 2 5枚 (7.3% ) ;10d囊胚 5枚 (1.5 % )。2头经超数排卵处理的母水牛 ,授精后第5d非手术回收 3枚囊胚 ,说明受精卵在体外发育速度比在体内发育慢 ,推测试管水牛胚胎移植的适宜时间 ,应是受体母牛站立发情后第 4～ 6d     

水牛卵母细胞体外受精及其早期胚胎性别鉴定

从屠宰场收集了本地水牛卵巢380个，平均每个卵巢回收3．29枚可用卵母细胞。分别采用添加5％、10％自制发情牛血清和国产胎牛血清培养液体外成熟培养水牛卵母细胞，结果表明，发情牛血清影响牛卵母细胞体外成热的效果与胎牛血清的效果无显著差异（48．89％vs51.11％，52．22％Vs50．00％），2种浓度间亦无显著差异。在胚胎培养液中添加10％的发情牛血清，比添加5％发情牛血清的卵裂率和胚胎发育率显著升高（34．85％Vs23．58％，39．13％Vs31.48％），差异显著。通过自主设计的两对引物扩增公水牛特有的Sry基因以及公母水牛共有的水牛1．715卫星DNA序列，采用连续多重PCR方法，能够有效地对水牛早期胚胎进行性别鉴定。     

水牛卵母细胞体外受精及其早期胚胎性别鉴定

从屠宰场收集了本地水牛卵巢380个,平均每个卵巢回收3.29枚可用卵母细胞。分别采用添加5%、10%自制发情牛血清和国产胎牛血清培养液体外成熟培养水牛卵母细胞,结果表明,发情牛血清影响牛卵母细胞体外成熟的效果与胎牛血清的效果无显著差异(48.89%Vs51.11,52.22 Vs50.00),2种浓度间亦无显著差异。在胚胎培养液中分别添加10%的发情牛血清,比添加5%发情牛血清更使卵裂率和胚胎发育率显著升高(34.85 Vs23.58,39.13 Vs31.48),差异显著。通过自主设计的两对引物扩增公水牛特有的Sry基因以及公母水牛共有的水牛1.715卫星DNA序列,采用连续多重PCR方法,能够有效的对水牛早期胚胎进行性别鉴定。     

水牛卵母细胞的体外受精及其胚胎发育的研究

本研究比较了不同来源的水牛卵母细胞的体外受精及其胚胎发育。对10头摩拉母水牛连续6周进行活体采卵,共采集292枚卵母细胞,头均回收卵母细胞4.87枚,头均A级卵数为3.07枚,从屠宰场收集74头水牛卵巢共采集559枚卵母细胞,头均回收卵母细胞和A级卵母细胞分别为7.55枚和5.20枚,均显著高于活体采集的水牛卵母细胞(P<0.01)。将收集的AB级水牛卵母细胞在相同的条件下进行体外成熟、体外受精和体外培养至囊胚。结果表明,活体采卵组和屠宰水牛卵母细胞组受精分裂率差异不显著,分别为54.81%和57.73%。屠宰水牛卵母细胞组的囊胚率则高于活体采卵组(28.78%vs21.34%,P<0.05)。利用两组的胚胎进行常规法冷冻保存,冻胚解冻后的存活率差异不显著(P>0.05)。     

家蚕金属羧肽酶基因家族的鉴定与表达分析

金属羧肽酶是昆虫消化管中参与食物消化吸收的重要酶类,并可能在昆虫变态、发育、抗病免疫等多种生命过程中发挥重要作用。利用家蚕全基因组数据库,基于同源搜索和隐马尔可夫模型搜索相结合的方法,对家蚕金属羧肽酶基因家族进行鉴定。全基因组预测家蚕的金属羧肽酶基因家族包括22个成员,推导的氨基酸序列均具有锌离子结合位点和金属羧肽酶M14的保守特征。根据其保守氨基酸序列不同,家蚕的金属羧肽酶分属于M14A、M14B和M14D 3个亚家族。通过RTPCR方法检测显示22个家蚕金属羧肽酶基因中有18个基因在家蚕不同组织和发育时期中表达,其中7个基因在家蚕5龄第3天幼虫中肠组织特异高量表达,提示金属羧肽酶在家蚕对营养物质的消化吸收中有重要作用;家蚕5龄幼虫添食感染Bm NPV后24 h内,中肠中有5个金属羧肽酶基因上调表达,表现出对病原微生物侵染的应答反应。研究结果有助于解析家蚕金属羧肽酶在蚕体对营养物质的消化和对病原物入侵应答中的功能作用。     

河流型水牛LPL基因在不同组织及泌乳期的表达水平分析

本试验旨在探究脂蛋白分解酶（lipoprotein lipase, LPL）基因在水牛不同组织及泌乳期乳腺组织的表达情况,为今后研究该基因在奶水牛泌乳方面的作用提供参考。运用生物信息学方法以GenBank中黄牛LPL基因序列为模板成功克隆了水牛LPL基因完整编码序列（CDS）,并对其序列进行分析,同时使用实时荧光定量PCR技术检测LPL在水牛不同组织和不同泌乳时期中的转录水平。结果显示,水牛LPL基因CDS序列长度为1 437bp,水牛LPL亚细胞定位于细胞外（包括细胞壁）、线粒体、内质网和空泡的比例分别为55.6%、22.2%、11.1%和11.1%,说明水牛LPL主要分布在细胞外;信号肽分析结果显示,该蛋白信号肽的切割位点位于SRGGL之间,概率为0.4029;组织表达分析结果表明,水牛LPL基因在乳腺的表达量最高（P<0.01）,其他组织的表达量从高到低依次为心、输卵管、肺、脾、肾、卵巢、大肠、淋巴、子宫、胃、肝、大脑和垂体;泌乳期表达分析结果表明,LPL在D50时的乳腺组织中表达量最高(P<0.01),推测LPL在水牛泌乳盛期起重要作用。     

水牛卵母细胞体外受精与ICSI早期胚胎发育潜能的比较

胞质内精子注射(intraeytoplasmie sperm injection,ICSI)是20世纪80年代后期发展起来的一种新型的体外受精技术.它是借助显微操作仪,将处理后的精子或生精细胞直接注入卵母细胞胞质内,从而完成受精的过程.理论上讲,只要1个精子就可以受精,这就大大降低了受精过程中对精子数量的要求.因此,该技术有巨大的现实意义与广阔的应用前景.     

河流型水牛尼里-拉菲和摩拉水牛群体遗传结构分析

为了对摩拉水牛、尼里-拉菲水牛进行合理有效的保护,研究其遗传多样性,掌握其遗传背景,试验利用15个微卫星位点对96个个体(尼里-拉菲、摩拉水牛各48头)进行遗传多样性检测。结果表明:在尼里-拉菲水牛15个微卫星位点上共检测到92个等位基因,平均等位基因为6. 133 3,平均有效等位基因为2. 942 3,平均多态信息含量(PIC)为0. 565 5,平均期望杂合度值为0. 618 4;在摩拉水牛15个微卫星位点上共检测到76个等位基因,平均等位基因为5. 133 3,平均有效等位基因为2. 545 4,平均PIC为0. 493 7,平均期望杂合度值为0. 541 3。说明摩拉水牛、尼里-拉菲水牛群体的遗传多样性比较丰富,尼里-拉菲水牛群体的遗传多样性高于摩拉水牛群体。     

美洲狼尾草HXK基因家族鉴定及表达

己糖激酶(Hexokinase, HXK)是糖酵解途径中的关键酶,在细胞信号传导和糖感知过程起重要作用。探究美洲狼尾草HXK家族基因的详细特征及功能,解析其在该物种生长发育各个环节中的调控作用,本研究基于美洲狼尾草全基因组数据对美洲狼尾草的己糖激酶基因家族展开分析,共鉴定出12个美洲狼尾草PMhxk基因,同时通过系统进化分析将其分为4个亚组。蛋白质基序分析表明PMhxk家族具有两个较为保守的motif片段,顺式作用元件分析表明PMhxk成员的启动子、增强子等调控区域有大量的胁迫响应与植物激素响应元件。PMhxk基因家族的表达分析表明,美洲狼尾草的HXK基因集中表达于抽穗期的穗组织中,部分PMhxk成员在干旱胁迫和盐胁迫中出现表达上调,且干旱胁迫更为明显。综上,本研究鉴定了美洲狼尾草HXK基因家族成员,并通过全面的转录组数据发现该家族成员具有显著的组织特异性和逆境表达差异性,为深入探讨HXK家族基因的功能提供了有价值的信息。     

河流型水牛热休克蛋白70的原核表达及其对精液抗冻性的影响

试验旨在克隆河流型水牛热休克蛋白70(heat shock protein 70,HSP70)基因的CDS区序列,构建HSP70原核表达载体,诱导表达HSP70融合蛋白,进一步研究HSP70蛋白对水牛精液抗冻性的影响。以摩拉水牛精子基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增HSP70基因CDS区序列,将PCR产物与pET30a质粒连接构建重组原核表达质粒,诱导表达HSP70融合蛋白,将获得的表达蛋白作为稀释液组分添加到水牛精液中制作冷冻精液并评定其活力。结果显示,试验成功扩增获得HSP70基因CDS区长为2 155bp的片段;SDS-PAGE及Western blotting分析显示,在70ku处出现一条明显条带,且表达产物可与相应的抗体发生反应;对添加有HSP70蛋白的水牛冷冻精液活力评定结果显示,终浓度为2、4、8mg/mL的HSP70能提高冷冻精液活力,且8mg/mL HSP70组冻精活力最高,但各组间差异均不显著(P0.05)。综上所述,本试验成功表达了水牛HSP70蛋白,获得了高纯度、有活性的HSP70融合蛋白,外源添加HSP70蛋白可提高水牛冷冻精液的活力,为进一步研究水牛HSP70蛋白的抗冻性保护机理奠定了理论基础。     

河流型水牛热休克蛋白70的原核表达及其对精液抗冻性的影响

试验旨在克隆河流型水牛热休克蛋白70（heat shock protein 70,HSP70）基因的CDS区序列,构建HSP70原核表达载体,诱导表达HSP70融合蛋白,进一步研究HSP70蛋白对水牛精液抗冻性的影响。以摩拉水牛精子基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增HSP70基因CDS区序列,将PCR产物与pET30a质粒连接构建重组原核表达质粒,诱导表达HSP70融合蛋白,将获得的表达蛋白作为稀释液组分添加到水牛精液中制作冷冻精液并评定其活力。结果显示,试验成功扩增获得HSP70基因CDS区长为2 155 bp的片段;SDS-PAGE及Western blotting分析显示,在70 ku处出现一条明显条带,且表达产物可与相应的抗体发生反应;对添加有HSP70蛋白的水牛冷冻精液活力评定结果显示,终浓度为2、4、8 mg/mL的HSP70能提高冷冻精液活力,且8 mg/mL HSP70组冻精活力最高,但各组间差异均不显著（P>0.05）。综上所述,本试验成功表达了水牛HSP70蛋白,获得了高纯度、有活性的HSP70融合蛋白,外源添加HSP70蛋白可提高水牛冷冻精液的活力,为进一步研究水牛HSP70蛋白的抗冻性保护机理奠定了理论基础。     

物候节律对河流型水牛精液质量影响的分析

对摩拉水牛和尼里水牛2006—2014年不同季节和节气的射精量、原精活力、精子密度、解冻活力进行测定、记录和统计分析。结果:河流型水牛春季的射精量、精子密度、原精活力和冷冻精液解冻活力平均分别为(4.80±2.063)m L(n=2 216)、(57.61±14.727)%(n=2 209)、(7.79±4.165)亿/m L(n=2 213)和(36.00±2.581)%(n=1 413);夏季的射精量、精子密度、原精活力和冷冻精液解冻活力平均分别为(53.28±2.311)m L(n=2 392)、(60.32±10.515)%(n=2 379)、(8.26±4.250)亿/m L(n=2 389)和(35.99±2.506)%(n=1 823);秋季的射精量、精子密度、原精活力和冷冻精液解冻活力平均分别为(5.28±2.161)m L(n=1 977)、(61.15±16.462)%(n=1 965)、(8.28±4.212)亿/m L(n=1 977)和(36.56±9.897)%(n=1 517);冬季的射精量、精子密度、原精活力和冷冻精液解冻活力平均分别为(5.02±2.019)m L(n=2 350)、(57.11±18.910)%(n=2 337)、(7.68±3.901)亿/m L(n=2 344)和(36.21±2.615)%(n=1 476)。     

河流型与沼泽型水牛FSHR基因密码子偏好性分析

为了确定河流型与沼泽型水牛促卵泡素受体(FSHR)基因密码子的使用模式,试验采用PCR产物直接测序法对9头河流型水牛、15头沼泽型水牛、6头大额牛和6头中甸牦牛的FSHR基因编码区序列进行了群体变异检测和单倍型划分,并结合已发表的普通牛、野牛、山羊、绵羊、人和黑猩猩的同源序列,对河流型与沼泽型水牛FSHR基因密码子使用的偏好性及与其他物种的差异进行了探讨。结果表明:两类水牛FSHR基因的密码子使用特征较为相似,河流型与沼泽型水牛分别有28个和27个偏好使用的密码子,对于编码Pro的4个密码子CCC、CCA、CCU和CCG而言,河流型水牛偏好使用CCC和CCA,而沼泽型水牛偏好使用CCC。水牛与其他物种共同偏好使用的密码子有20种,均偏好使用以G/C结尾的密码子。基于密码子的同义密码子相对使用度(RSCU)构建的聚类树显示河流型水牛与沼泽型水牛先聚为一类,再与大额牛、牦牛聚为一类,普通牛与山羊、绵羊和野牛聚为一类,人和黑猩猩聚为一类,揭示聚为一类的物种间在密码子使用上的偏好性较相似。     

应用微卫星DNA标记鉴别沼泽型水牛与河流型水牛的杂交个体

为了探索应用DNA标记鉴定沼泽型水牛与河流型水牛杂种后代的技术方法并分析中国水牛资源状况,以采自18个本地沼泽型水牛群体、2个引进河流型水牛品种及1个杂交水牛群体的共992份样本为试验材料,检测这些样本在30个微卫星座位上的基因型。结果显示,2种类型水牛间具有显著的遗传差异,30个标记的平均分化指数（FST）为（0.310&#177;0.193）。利用个体多座位联合基因型数据,多变量对应分析（multivariate correspondence analysis）和基于模型的贝叶斯聚类（model-based Bayesian clustering）2种统计方法都能够灵敏地区分出纯种个体及杂种后代。此外,基于上述统计方法的群体遗传混合分析表明中国水牛总体上具有纯正的沼泽型水牛血统。本研究为今后开展中国沼泽型水牛的品种资源评价、制定保种决策提供了技术依据。     

河流型与沼泽型水牛杂交后代产犊间隔的分析

[目的]探讨杂交奶水牛的配妊情期及产犊间隔,了解杂种水牛的一般繁殖特性.[方法]分析了云南省大理州家畜繁育指导站奶水牛场2000年2月至2013年1月记录的摩×本,尼×本及摩×尼×本三元杂种水牛共计160头次母牛的初配配妊次数,二胎及以后配妊次数,产犊间隔等.[结果]显示:二胎及以后的配妊配妊次数高于初配配妊次数,平均为2.12次;产犊间隔摩×本F1为456.18±11.12 d,摩×本F2为421.88±15.13 d,摩×尼×本三元杂为434.86±17.74 d.[结论]杂种奶水牛的产犊间隔和配妊所需的发情期均高于普通牛.     

杧果PEPC基因家族全基因组鉴定及表达分析

PEPC家族蛋白在植物光合碳同化过程中起到重要作用,同时具有多种非光合生物学功能,目前杧果中尚未报道。本研究对杧果MiPEPCs进行了全基因组鉴定,并分析了它们在不同组织（包括成熟叶片、成熟树皮、种子、根、花、果肉和果皮）和两个品种（高糖品种‘台农1号’和低糖品种‘热农1号’）中的表达情况。结果获得4个杧果MiPEPC基因家族成员,其理化特征较为相似,且所有MiPEPCs蛋白亚细胞定位预测均存在与细胞质中。基因组定位发现杧果MiPEPCs分布于4条不同的染色体。联合拟南芥,水稻,菠萝的PEPCs进行系统进化分析显示可分为2个亚组,MiPEPCs分布在第I（PTPC）和II亚族（BTPC）。杧果植物型MiPEPCs和细菌型MiPEPCs分离时间早于单子叶植物和双子叶植物的分离时间,两者蛋白序列差异大,但仍具有一定的保守性。顺式作用元件分析显示,MiPEPCs含有数量较多的光响应元件和激素响应元件。转录组表达分析结合qPCR实验验证发现,MiPEPCs在不同杧果组织中的表达具有偏好性,可能参与杧果的多个生物学过程（包含光合和非光合过程）,并初步推测MiPEPC1、MiPEPC3可能与杧果果实成熟过程。本研究为进一步探究MiPEPC家族在杧果中的生物学功能奠定了基础。