绵羊肺腺瘤病毒内蒙毒株囊膜蛋白基医在大肠杆菌中的分段表达

为了建立原核高效表达体系，从自然感染绵羊肺腺瘤病毒内蒙毒株的肺肿瘤组织中提取基因组DNA，应用PCR技术分别扩增编码囊膜蛋白（env）基因的表面蛋白（surfaceprotein，su）和跨膜蛋白（transmembrane protein，TM）区域基因，通过T—A克隆的方法分别克隆入pGEM—TEasy载体中，然后利用设计的起始密码、终止密码以及相应酶切位点的引物，把env基因的SU区和TM区基因亚克隆到表达载体pGEX-4T～1中，分别构建SU和TM的重组表达质粒，经酶切、PCR及DNA测序鉴定后，将阳性质粒转化入大肠杆菌BL21CodonPlus中并在IPTG的诱导下表达，表达产物用SDS—PAGE分析鉴定。结果表明，该基因可以在大肠杆菌中以稳定的包涵体形式高效表达，表达的SU和TM融合蛋白表观分子质量约为68ku和46ku，表达量分别占全菌蛋白的25％和30％，并且从包涵体分离纯化得到的表达蛋白具有较高纯度，是一种理想的免疫原。     

绵羊肺腺瘤病病毒NM株衣壳蛋白基因的克隆与原核表达

为了建立原核高效表达体系,从自然感染绵羊肺腺瘤病病毒内蒙（NM）株的肺肿瘤组织中提取基因组DNA,应用PCR技术扩增编码gag基因衣壳蛋白（Capsid protein,CA）基因,构建CA蛋白的重组表达质粒pGEX-4T-1-CA,经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,将阳性质粒转化入Ecoli BL21 CodonPlus中,在IPTG的诱导下表达,表达产物用SDS-PAGE分析鉴定。结果表明,该基因可以在大肠杆菌中以可溶性和包涵体形式高效表达,表达的CA融合蛋白表观分子量约为37 Ku,表达量占全菌蛋白的20%,利用谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析柱纯化可以得到具有较高纯度的表达蛋白,是一种理想的免疫原。本研究为下一步利用重组蛋白研制绵羊肺腺瘤病病毒NM株的单克隆抗体及诊断试制盒等奠定了基础。     

内源性绵羊肺腺瘤反转录病毒的研究进展

从内源性绵羊肺腺瘤反转录病毒（enJSRV）与外源性绵羊肺腺瘤反转录病毒（exJSRV）基因组结构的比较、enJSRV与绵羊肺腺瘤病（OPA）的关系、enJSRV在羊体内的表达及其系统发育分析等方面综述了enJSRV的研究进展，旨在为早期诊断及预防OPA提出新方法，为揭示该病的分子发病机理及探索其基因治疗提供新思路。     

绵羊肺腺瘤病毒NM株囊膜基因的定向克隆与融合表达

根据绵羊肺腺瘤病毒(SJRV)NM株基因组全序列，设计了1对包含囊膜(env)基因在内的引物，并在5′端分别设计了HindⅢ和BnmHⅠ酶切位点，利用PCR技术扩增env基因，通过连接反应将其克隆于pET-30b表达载体上。序列分析表明，env基因全长1836bp，编码612个氨基酸残基；构建表达重组质粒env—pET—30b，转化大肠埃希氏菌BL21，经IPTG于37℃诱导培养，SDS—PAGE电泳分析表明，表达的env基因融合蛋白分子质量约为69ku。     

绵羊肺腺瘤病毒致瘤机制研究进展

绵羊肺腺瘤(OPA)是由绵羊肺腺瘤病毒(OPAV)引起的一种慢性、传染性绵羊肺脏肿瘤性疾病,该病对养羊业,特别是种羊的发展有重大影响,世界动物卫生组织将其列为必须通报的动物疫病。论文就近年来国内外关于OPAV致瘤机制的相关研究进行了综述,包括OPAV的转录特异性和囊膜蛋白的致瘤作用和OPAV受体等。这对深入研究OPAV的致瘤机制及确定相应的防控靶点,具有重要的理论意义和潜在的应用价值。     

绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白在大鼠体内的表达

为探讨绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白(OPAV-Env)引起肺泡Ⅱ型上皮恶变的机理,将真核表达质粒pcDNA3.1-env用体内转染试剂经尾静脉转染到幼龄大鼠体内,用RT-PCR及免疫组化法检测绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白在大鼠体内的表达,并采用SSCP法及基因克隆法结合序列分析检测H-ras基因是否发生突变.结果显示,绵羊肺腺瘤病...     

表达绵羊肺腺瘤病毒跨膜蛋白HepG2细胞系的建立

为深入研究绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)与绵羊肺腺瘤病(OPA)发病关系,本研究采用PCR方法从pGEX-4T-1-TM重组质粒中扩增编码JSRV跨膜蛋白(TM)的基因序列,并引入标签多肽HA序列和限制性内切酶位点,将其重组至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建了重组质粒pcDNA-TM-HA.通过转染HepG2细胞并用G418筛选,对稳定表达TM的阳性细胞进行纯化,获得了稳定表达JSRV tm基因的HepG2细胞系.间接免疫荧光及western blot检测结果表明,重组蛋白TM-HA在HepG2细胞中得到正确表达.JSRV TM蛋白稳定表达细胞系的建立为进一步研究该蛋白与JSRV诱导OPA发病关系提供了重要的实验平台.     

绵羊肺腺瘤病毒NM株囊膜蛋白的二级结构及其B细胞抗原表位预测

利用生物信息学预测绵羊肺腺瘤病毒(OPAV)NM株囊膜蛋白优势抗原表位,为寻找用于绵羊肺腺瘤病诊断和预防的候选抗原表位提供参考。参照OPAV-NM株env基因序列(登录号:JQ837489),应用Gamier-Robson方法、SOPMA方法和网络服务器PSIPRED、Predictprotein预测OPAV-NM株囊膜蛋白的二级结构。用Kyte-Doolittle方法预测蛋白质的疏水区和亲水区,用Emini方法预测蛋白质表面可能性,以Jamson-Wolf方法预测蛋白的抗原指数,利用Bcepred、IEDB、ABCpred网络服务器预测囊膜蛋白的抗原性,然后综合评价囊膜蛋白的B细胞抗原表位。结果表明,囊膜蛋白(ENV)二级结构丰富,α螺旋和β折叠所占比例相对较多,也具有多处转角及无规则卷曲区域,提示OPAV-NM囊膜蛋白具有较多的优势抗原表位区段。这些优势抗原表位分别为第52～76,101～110,118～165,182～196,201～215,281～305,309～332,335～356,461～476,530～574位氨基酸,其中第461～476位和第530～574位的部分氨基酸序列位于胞外区,且第530～574区段位于en-OPAV和ex-OPAV的囊膜氨基酸序列的差异区,该段氨基酸序列对绵羊肺腺瘤病毒疫苗和诊断方法的研究有重要意义。     

人工感染绵羊肺腺瘤病毒内蒙株羔羊的临床病理学研究

试验旨在探讨试验性感染绵羊肺腺瘤病毒内蒙株（jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV-NM）对羊的淋巴细胞亚群、淋巴细胞凋亡、血气指标的影响。用含JSRV-NM株的病毒悬液1 mL气管内接种1日龄羔羊,对人工感染羊进行了临床症状观察、血液学检查、病理生理学的系统病理学研究。在不同时段用流式细胞仪检测外周血中淋巴细胞及其亚群的动态变化及淋巴细胞凋亡情况。同时,对血液做血气分析和血清酶的检测。人工感染羔羊均出现了一些轻微的绵羊肺腺瘤病（sheep pulmonary adenomatosis,SPA）临床症状。SPA攻毒组感染JSRV-NM株后前60 d,外周血中CD4+、CD8+ T细胞保持较高水平;到感染后90 d呈现下降趋势。对淋巴细胞凋亡检测的结果显示,在感染JSRV-NM株前60 d,凋亡细胞都保持较高水平;而感染第90天后,晚期细胞凋亡显著低于对照组。血气分析结果显示,阴离子隙（AnGap）、细胞外液碱剩余（BE(ecf)）、氯离子浓度（Cl-）、氧分压p（O2）、实际碳酸氢根（HCO3act）、标准碳酸氢根（HCO3std）、二氧化碳总量（TCO2）、氧饱和度（O2SAT）、氧含量（O2CT） 9项在不同时期与对照组存在显著差异。接毒羔羊尚未发生SPA的典型症状,但试验羔羊的病情已经出现,处于SPA疾病的早期表现;病羊在感染JSRV-NM病毒株后,在一定时期内,血液中CD4+ T淋巴细胞和CD8+ T淋巴细胞的变化是SPA病羊在疾病过程中细胞免疫和淋巴细胞受损的重要表现之一;外周血淋巴细胞会呈现不同程度的凋亡,JSRV-NM株诱导机体免疫细胞凋亡是一种重要的临床表现;本试验结果初步证明,血气分析方法在临床诊断绵羊肺腺瘤病时有一定的参考价值。     

绵羊肺腺瘤病毒真核表达质粒pcDNA3.1(+)/exJSRV-env引起体内和体外细胞发生的转化

本试验旨在进一步全面研究绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)囊膜蛋白ENV的功能。使用本试验室已构建好的真核表达质粒pcDNA3.1(+)/exJSRV-env转染NIH3T3细胞,并将此NIH3T3细胞接种到裸鼠体内;重组质粒经尾静脉注射到幼龄BALB/c小鼠体内。结果显示,真核表达质粒pcDNA3.1(+)/exJSRV-env引起NIH3T3细胞发生转化,转染细胞接触抑制性消失,并形成大量的转化灶;pcDNA3.1(+)/exJSRV-env转染的NIH3T3细胞接种裸鼠使裸鼠致瘤,即引起NIH3T3细胞发生癌变。JSRVenv基因在小鼠体内表达,肝脏细胞出现大面积弥散性坏死,脾脏白髓严重坏死,心肌细胞明显颗粒样变性,肺间质细胞增生,肾小管上皮细胞轻度颗粒样变性。结果表明,绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白可以引起鼠NIH3T3细胞发生转化和癌变,使小鼠各脏器出现不同程度的病变。本试验为进一步探索JSRV ENV的致瘤机制奠定基础。     

绵羊肺腺瘤病毒NM株前病毒gag基因的克隆与序列分析

参照GenBank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)的全基因序列，设计合成3对引物，对JSRVNM株的gag基因分3段进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳分析，分别呈3条531、888和949 bp的特异条带，将其分别克隆人pMD-18T载体中，进行序列测定并拼接序列，得到完整的gag基因序列。分析结果表明，与南非代表株(基因序列号NC-001494)的gag基因序列比较，核苷酸同源性为89．0%，推导出的氨基酸同源性为90％。与美国代表株(基因序列号AF105220)的gag基因序列比较，核苷酸同源性为86．3％，氨基酸同源性为87％。     

绵羊肺腺瘤病毒检测方法的研究进展

绵羊肺腺瘤（OPA）是由β-反转录病毒属绵羊肺腺瘤病毒（JSRV）引起的一种肿瘤性传染病,该病潜伏期长,经呼吸道传播,冬季圈养种羊发病率高,目前无治疗措施,病死率为100%。OPA的持续存在对种羊生产形成了潜在威胁并造成较大经济损失,严重危害养羊业健康发展。所以,对OPA的早期精确诊断是防制本病的前提,尤其是在出入境检验检疫过程中对进出口羊的JSRV检测尤为重要。随着分子生物学技术的不断发展,JSRV分子生物学检测方法也得到不断的创新和改进。作者就近年来针对检测JSRV的聚合酶链式反应（PCR）、核酸探针杂交技术、酶联免疫吸附试验（ELISA）、环介导等温扩增技术（LAMP）等方法的研究概况作一综述,为寻找快速准确并适用于出入境检疫的JSRV检测方法和进一步发展研究新型JSRV检测方法提供参考。     

绵羊肺腺瘤病毒衣壳蛋白杂交瘤细胞系的建立

为了制备特异性的抗绵羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV) 内蒙株衣壳蛋白(CA)的单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞系,以原核表达CA蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠,经4次免疫后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞经杂交瘤技术进行融合,同时以表达蛋白作为包被抗原进行特异性ELISA检测,共筛选到6株阳性杂交瘤细胞株。经过3次亚克隆后,最终得到了5株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株;再利用CA真核表达蛋白以间接免疫荧光法,对此5株杂交瘤细胞进行进一步的特异性鉴定。结果显示,有3株具有特异性强荧光反应,也能检测到目的基因的表达产物。本试验获得了3株稳定分泌抗JSRV-NM株CA蛋白McAb的杂交瘤细胞系,为建立检测病原的特异性诊断方法、分析JSRV-NM株CA蛋白的功能及鉴定B细胞抗原表位等奠定基础。     

绵羊肺腺瘤病毒受体透明质酸酶-2的原核表达及纯化

为建立绵羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)受体透明质酸酶-2(Hyal-2)的原核高效表达体系,本试验设计了扩增JSRV受体Hyal-2基因的特异性引物,应用PCR技术扩增出Hyal-2全长基因,将该基因定向重组于原核表达载体pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1-Hyal-2重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,逐步优化条件至稳定表达,经Western blotting检测融合蛋白成功表达后,通过亲和层析法对融合蛋白进行纯化。结果表明,Hyal-2基因正确地插入到原核表达载体pGEX-4T-1中;经诱导含重组质粒pGEX-4T-1-Hyal-2的表达菌高效表达了带GST标签的目的蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白分子质量为80 ku,与预期大小一致,经Western blotting验证为带GST标签的融合蛋白;通过谷胱甘肽亲和层析法获得纯化的目的蛋白。本试验结果为进一步制备Hyal-2蛋白的多克隆抗体及深入研究其功能奠定基础。     

内源性绵羊肺腺瘤病毒env基因的克隆及序列分析

参照GenBank上已发表的内源性绵羊肺腺瘤病毒env基因与5′长末端重复序列保守区序列设计引物,应用PCR技术成功扩增出内源性绵羊肺腺瘤env基因与5′长末端重复序列,将纯化的扩增片段连接pMD18-T克隆载体进行测序获得目的基因序列。应用MEGA4.1、DNASTAR进行序列分析,分析结果表明,内源性env基因具有完整的开放阅读框,内源性env基因序列与内源性绵羊肺腺瘤(AF153615.1)基因同源性高达99.7%,与外源性绵羊肺腺瘤(M80216.1)基因的同源性仅为90.6%;由内源性env基因推导的氨基酸在NCBI进行BLAST比较:与AF153615.1的氨基酸同源性高达100%。内源性env基因编码表达的蛋白具有亲水性。这些结果为研究5′长末端序列对内源性env基因调控等问题提供了重要参考。     

鸡IL-18 cDNA的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

运用RT—PCR方法，从经脂多糖(LPS)诱导的鸡马立克氏病成淋巴细胞样细胞系MIDCC-MSBI总RNA中扩增得到了鸡白细胞介素18(Chicken interleukin-18，ChIL-18)成熟蛋白基因的cDNA，并将其克隆到pMD18-T载体上。DNA序列测定表明，克隆得到的ChIL-18cDNA与国外报道的完全一致，包括终止密码子在内其编码区的长度为510bp，编码169个氨基酸残基的蛋白质。将ChIL-18成熟肽段编码区定向克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游，构建成原核表达质粒pGEX—ChIL18。该质粒的BL21(DE3)DysS转化菌在IPTG的诱导下可高效表达GST—ChIL18基因融合蛋白，表达量约占菌体总蛋白的32％。     

小尾寒羊CIB1基因全长cDNA克隆及原核表达

本研究旨在克隆小尾寒羊钙粘和蛋白1(Calcium and integrin binding protein 1,CIB1)基因cDNA全长,并在原核载体中表达.参照已发表的CIB1基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物,采用RT-PCR法,从小尾寒羊睾丸组织中扩增获得CIB1基因全长cDNA.将其克隆到pMD19-T载体,并进行测序分析.将该基因编码区重组于融合表达质粒pET32a中,构建了重组原核表达载体(pET32a-CIB1).将其转化到BL21(DE3)pLysS宿主菌中,用IPTG进行诱导表达.结果表明,克隆的CIB1基因cDNA与GenBank上登录的牛、猪、猕猴、人、小鼠、大鼠、黑猩猩等动物该基因序列的同源性达90%以上,编码氨基酸的同源性在93%以上,并且该序列包含有完整的开放阅读框,大小为576 bp.实现了高效特异性融合表达,表达产物的分子质量约为38 ku.本研究结果为进一步研究CIB1蛋白功能打下良好的基础.