微小牛蜱Bm91基因的克隆及其真核表达载体的构建

参照GenBank中收录的微小牛蜱Bm91基因的核苷酸序列,设计了1对特异性引物,从我国微小牛蜱半饱血雌性成蜱肠道和唾液腺研磨物中提取总RNA,利用M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit合成双链cDNA,并采用PCR技术扩增获得的Bm91基因,将其克隆到pGEM-T Easy载体中并进行PCR、酶切和测序分析鉴定.结果表明:所克隆的Bm91基因序列与GenBank上收录的Bm91基因序列的同源性达97.1%,而且该片段含有完整的开放阅读框;将该基因从克隆载体上用EcoRⅠ单酶切消化并亚克隆到巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pP1C9K的EcoRⅠ酶切位点,再次进行PCR、酶切和测序分析鉴定,结果表明成功构建并获得了微小牛蜱Bm91基因的重组真核表达载体pP1C9K-Bm91.     

新疆南疆微小牛蜱Bm86/Bm91双基因原核表达载体的构建

为构建微小牛蜱Bm86和Bm91双基因原核表达载体,以新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室获得的Bm86和Bm91克隆基因阳性菌或质粒DNA为模板,参照GenBank登录的微小牛蜱Bm86和Bm91基因序列和所用载体序列,设计可以扩增Bm86和Bm91基因完整阅读框架的引物,然后对新疆南疆微小牛蜱Bm86和Bm91基因进行PCR扩增、纯化、酶切后连接,构建双基因重组质粒pET-32a-Bm并鉴定。结果显示,成功构建Bm86和Bm91双基因重组质粒pET-32a-Bm,经测序鉴定和初始获得的Bm86和Bm91基因序列一致,未发生变异。     

新疆南疆地区微小牛蜱Bm86基因克隆及鉴定

为了克隆及鉴定新疆南疆地区微小牛蜱Bm86基因,参照Gen Bank登录的微小牛蜱Bm86基因序列,设计了可以扩增Bm86基因完整阅读框架的引物,对微小牛蜱进行总RNA提取、RT-PCR、克隆、测序、序列分析。结果表明,获得的Bm86基因长1 953 bp,与Gen Bank中登录号为M29321、HQ014398的微小牛蜱Bm86基因核苷酸同源性分别为99%、97%,且为一个完整的开放阅读框架。本研究获得的微小牛蜱Bm86基因,为获得基因工程疫苗的候选抗原及中国抗微小牛蜱疫苗制备奠定了基础。     

贵州微小牛蜱的检测与防制研究

微小牛蜱在贵州某些奶牛场、人工草场、养牛专业户及农户的牛群中存在,严重危害牛群的健康.对贵州微小牛蜱的危害、流行情况、监测及防制进行了探索,可为进一步开展微小牛蜱的防治研究提供参考依据.     

微小牛蜱饱血雌蜱高毒力绿僵菌菌株的筛选及应用

为筛选微小牛蜱的高毒力菌株,采用浸渍法测定了8株绿僵菌对微小牛蜱饱血雌蜱的存活指数.结果显示,菌株MaAT.4对微小牛蜱饱血雌蜱的毒力最强,其孢子悬浮液推荐杀蜱浓度为1×10~8个·mL~(-1).     

高原牦牛SRY基因的克隆与原核表达

为从分子水平了解牦牛的性别形成机制,对高原牦牛SRY(Sex-determining region on the Y chromosome,SRY)基因的编码区进行了克隆表达。以雄性高原牦牛血液为材料,从基因组DNA中扩增SRY基因编码区(单外显子)序列,将其克隆至pGEM-Teasy载体并测序;将牦牛SRY基因编码区连接至pET-28a(+)载体,构建表达载体pET-28a/SRY;把表达载体pET-28a/SRY转入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中,在合适的条件下诱导表达;对表达产物进行Western-blot检测。结果表明:牦牛SRY基因(GenBank:EU547257)编码区长687 bp,编码229个氨基酸;成功构建了表达载体pET-28a/SRY,并且SRY蛋白得到了大量表达;Western-blot进一步验证了其表达成功。     

弓形虫MAPK1基因的克隆与原核表达

为获取具有生物学活性的弓形虫MAPK1蛋白,根据Gen Bank中编码MAPK1的已知序列设计并合成1对引物,用NCoⅠ和HindⅢ双酶切后,连接到同样双酶切的原核表达载体PET-28a上,构建重组表达质粒PET-28a-MAPK1并转化至E.coli BL21感受态,用IPTG诱导表达,表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,纯化后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果表明:表达质粒在E.coli BL21中得到表达,克隆的MAPK1基因与Gen Bank中收录的基因序列同源性为99.9%。对重组质粒进行酶切鉴定,获得1 599 bp大小的目的基因片段,与预期结果相符,成功地构建了重组质粒PET-28a-MAPK1。Ni2+螯合柱纯化后蛋白浓度为0.26 mg/m L,可用作免疫原,经SDS-PAGE电泳显示PET-28a-MAPK1融合蛋白的分子量约为58 ku。Western blotting显示融合蛋白具有良好的抗原性。     

新城疫病毒HN基因的克隆与原核表达

根据GenBank公布的标准Lasota株的HN基因序列,设计了一对引物,经RT-PCR从标准Lasota疫苗毒中特异性扩增出约1590bp的HN基因。将扩增得到的基因定向克隆到原核表达载体pET-30a(+)中,获得重组质粒pET-NDV/HN,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中,得到重组菌BL21(pET-NDV/HN)。将重组菌诱导表达后,通过SDS-PAGE分析可见约64.3kDa的特异条带,说明融合蛋白大小与预期理论值相符;Western blotting结果进一步表明表达的蛋白可与NDV阳性血清发生特异性结合,说明其具有良好的免疫原性。     

人朊蛋白基因的克隆与原核表达

以人血液中提取的总DNA为模板,克隆朊蛋白(prion protein,PrP)基因Prnp户的开放阅读框(ORF),与pMD -18T载体连接后转入E．coli JM109,用Blast软件比较重组质粒序列,结果表明获得的人Prnp的ORF与Genbank登录的相应核苷酸序列最高同源性为99．6％,推导的氨基酸序列同源性为99．8％,将编码人成熟PrP的基因定向克隆到 pET-30a(+)表达载体,将重组质粒pET-homPrP转化E．coli BL21(DE3),在37℃下用1．0 mmol／L IPTG诱导,重组融合蛋白获得高效表达,SDS-PAGE显示表达产物以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的20％～25％．用Ni-NTA 树脂亲和层析纯化了表达产物．Western-blotting分析表明,融合蛋白被抗PrP的单克隆抗体特异识别．因此,在大肠杆菌中表达的人成熟PrP融合蛋白可以作为制备PrP抗体的免疫原．     

鸡Ii基因的克隆、鉴定及其原核表达

从ConA诱导的5周龄SPF鸡脾细胞中提取总RNA,用自行设计的一对引物通过RT—PCR方法扩增出鸡恒定链(invariant chain,Ii)基因片段。经酶切鉴定后,再将该片段克隆到pcDNA3载体中,测定其DNA序列,结果表明该片段长度为669bp,其DNA序列与GenBank登录的基本一致。再将该片段插入原核表达载体PGEX-4T-1,并导入菌株BL21,经诱导培养、蛋白提取和SDS—PAGE,获得分子量约为50kD的特定蛋白条带,表明所克隆的鸡Ii基因在原核细胞中得到表达。     

溴氰菊酯对微小牛蜱的毒力测定和杀灭试验

溴氰菊酯对微小牛蜱未吸血幼蜱的半致死浓度（ＬＣ５０）为０．３６×１０－６，对未吸血成蜱的半致死量（ＬＤ５０）为４．６８７μｇ／虫，对饱血雌蜱的ＬＤ５０为６．８６８μｇ／虫；而敌百虫对未吸血幼蜱的ＬＣ５０为１７５×１０－４，对未吸血成蜱和饱血雌蜱的ＬＤ５０分别为１１１６和５２６６μｇ／虫．可见，溴氰菊酯对微小牛蜱未吸血幼蜱、未吸血成蜱及饱血雌蜱的杀蜱效果分别为敌百虫的４８６、２３８和７６７倍．现场杀蜱试验，采用５％溴氰菊酯水和剂１２．５×１０－４时．杀蜱率达９２％，３０×１０－６时达１００％杀蜱效果，对牛无副作用。     

生长抑素(SS)基因在pET-32表达系统中的高效表达

分别将SS基因克隆至pET 32a和pET 32c表达系统中 ,得到重组质粒SS N/X和SS N/S。实验结果表明 ,SS N/X Thioredoxin (硫氧还原蛋白 )和SS N/S Thioredoxin融合蛋白在IPTG (异丙基硫代 β D半乳糖苷 )诱导 3h后(37℃ )表达产量最高 ,约占菌体总蛋白的 30 %左右。 0 0 5～ 1mmol·L-1IPTG对SS融合蛋白表达产量的影响并不太大 ,0 0 5mmol·L-1IPTG即可达到有效的诱导效果 ,但单位体积内的表达产量以 0 5mmol·L-1时为最高。乳糖诱导 4h(37℃ )的效果明显低于IPTG ,但当培养时间延长至 8h时 ,2 0mg·mL-1的乳糖可达到与IPTG同样的诱导效果 ,10和 5mg·mL-1的乳糖也可接近IPTG的诱导效果。SS N/X融合蛋白在 2 6℃表达时 ,主要以可溶性形式存在 ,占75 8% ,包涵体仅占 2 4 2 % ;而SS N/S融合蛋白则主要以包涵体形式存在 ,占 6 0 2 % ,可溶性蛋白仅占 39 8%。SS可溶性融合蛋白具有良好的SS抗原性。     

Jo-1蛋白在大肠杆菌中的克隆与表达

构建在E.coli中表达人组氨酰-tRNA合成酶(Jo-1)的质粒。用RT-PCR从人胎盘组织总RNA中获得编码人组氨酰-tRNA合成酶(Jo-1)基因的全序列,将此片段定向克隆到麦芽糖融合蛋白表达载体pMAL-c中,诱导表达获得Jo-1的可溶性融合蛋白,并通过亲和层析予以纯化。结果免疫印迹实验表明,表达的融合蛋白能与含有抗Jo-1抗体的病人血清发生特异反应,重组融合蛋白具有Jo-1蛋白的免疫原性和免疫特异性。     

鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白A的克隆与表达

为了表达鸭疫里默氏杆菌外膜蛋白A（ompA）,参照其已知的全基因序列设计1对特异性引物,经PCR扩增得到目的片段约1 200 bp,然后克隆入pET-28a（＋）载体中,经测序比较,与标准序列的核苷酸同源性达99.8%;同时经诱导表达后,SDS-PAGE结果显示,ompA得到高效表达,Western-blotting检测,RA1,RA2,RA 10,RA11型全菌兔血清呈阳性,而阴性兔血清不反应。说明表达蛋白具有高度免疫反应特异性。     

金针菇免疫调节蛋白基因克隆及其表达

根据金针菇免疫调节蛋白基因(FIP-fve)合成1对引物,以从金针菇鲜子实体提取的RNA为模板,通过RT-PCR扩增得到目的片段,构建重组质粒pUC19-FIP-fve,测序将其与pET30a质粒分别用限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ酶切,连接,构建原核高效表达载体pET30a-FIP-fve,转化感受态大肠杆菌DE3(BL21),经IPTG诱导该基因在大肠杆菌DE3(BL21)中获得了大量表达。该结果对将金针菇免疫调节蛋白开发为免疫调节、抗过敏、抗肿瘤新药具有重要意义。     

反义CYP86MF基因植物表达载体的构建及其对白菜的转化

在获得一个与白菜核雄性不育相关的编码细胞色素P450(CYP450)的基因CYP86MF的基础上,采用PCR技术在该基因的内部第901个碱基至第1338个碱基之间设计引物,扩增出438 bp序列作为反义基因片段.把该反义片段连接至pBI121双元载体质粒上得到CaMV35S组成型启动子的表达载体pBI35S-AMF,随后利用"三亲杂交"法将pBI35S-AMF质粒转入农杆菌LBA4404和EHA105两个菌株中.PCR扩增和酶切鉴定结果表明,所构建的反义CYP86MF基因植物表达载体pBI35S-AMF是正确的,并已成功导入了根癌农杆菌中.随后,按照已建立的遗传转化体系对‘上海青'白菜进行了转化,并获得130了多株转化再生植株.     

蚯蚓MT基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为了研究蚯蚓金属硫蛋白的生物学功能,采用RT-PCR方法从镉诱导后的赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)中克隆到蚯蚓金属硫蛋白基因cDNA。将其克隆入原核表达载体pET-DsbA中,然后转化至大肠杆菌表达受体菌BL21(DE3)中进行表达。产物经SDS-PAGE进行分析,可见约32.4 kD的融合蛋白。Zn2+抗性测定表明含pET-DsbA-efMT的重组菌较含空载体pET-DsbA的对照菌重金属抗性有所提高。