蒺藜苜蓿MtMYB16基因克隆、表达及转录自激活分析

植物中MYB转录因子数量众多,功能多样,在植物生长发育、逆境响应等多方面发挥着重要作用。为研究MYB转录因子在蒺藜苜蓿中的功能,本研究采用PCR技术从蒺藜苜蓿中克隆MtMYB16基因,该基因开放阅读框1074 bp,共编码357个氨基酸。进化树分析结果显示,MtMYB16蛋白与白花草木樨中MYB蛋白同源性最高。亚细胞定位结果显示,MtMYB16蛋白定位在细胞核中。酵母自激活检测结果显示,MtMYB16蛋白具有自激活活性,自激活结构域位于C端。表达分析结果显示,MtMYB16在蒺藜苜蓿根、茎、叶、花、果实中均有表达,在根中表达水平最高;IAA、MeJA能够降低MtMYB16表达水平;盐胁迫和干旱胁迫下,MtMYB16表达量在1.0 h时迅速增加,说明MtMYB16可能具有响应盐及干旱胁迫的功能。     

日本结缕草ZjHY5的克隆、亚细胞定位及转录自激活检测

转录因子LONG HYPOCOTYL 5(HY5)在光诱导基因表达中起中心调控因子的作用。为了探究日本结缕草(Zoysia japonica)中ZjHY5基因的亚细胞定位及自激活特性,本研究从日本结缕草(Zoysia japonica)中克隆得到ZjHY5基因。该基因开放阅读框为711 bp,编码236个氨基酸残基。ZjHY5蛋白无信号肽,进化树分析显示其与漆姑草(Sagina japonica)及苜蓿(Medicago sativa)中HY5蛋白的相似度最高。亚细胞定位结果显示,ZjHY5定位于细胞核中。通过构建酵母诱饵载体,并对其进行自激活检测,结果显示,ZjHY5基因无自激活活性,可用于后续试验。本试验为深入研究日本结缕草ZjHY5基因的功能奠定了基础。     

日本结缕草ZjTCP20基因生物信息学及表达模式分析

TCP是高等植物所特有的一类转录因子，参与调控植物的生长发育、衰老及逆境应答等多个生物学过程。本研究从日本结缕草(Zoysia japonica)中克隆出ZjTCP20基因，并对该基因进行生物信息学分析、自激活检测、表达模式分析等来探究该基因特性。ZjTCP20基因完整编码区为624 bp,编码208个氨基酸。ZjTCP20蛋白无信号肽，具有疏水性，系统发育进化树结果显示其与玉米(Zea mays)ZmTCP20亲缘关系最近。亚细胞定位显示该蛋白定位于叶绿体、细胞质和细胞核上。ZjTCP20基因表达模式结果显示，该基因在幼嫩叶片中大量表达，随植物发育表达量逐渐减少，但茉莉酸甲酯(MeJA)等3个激素对基因的表达量没有显著影响。酵母自激活试验显示ZjTCP20具备自激活活性。本研究为进一步研究ZjTCP20基因提供了科学依据。     

黄花苜蓿AP2/ERF家族MfERF028基因的表达特性与耐寒功能分析

基于黄花苜蓿（Medicago falcata L.）转录组测序数据,克隆得到MfERF028基因,蛋白质编码区（Coding sequence,CDS）长度为672 bp,编码223个氨基酸。该基因编码的蛋白质相对分子质量为25.3 kDa,等电点为6.00;亚细胞定位表明该基因所编码的蛋白在细胞核内特异表达,基因表达模式分析表明对-8℃胁迫响应强烈。构建植物表达载体,并转入截形苜蓿（Medicago truncatula Jemalong A17）中进行基因功能验证,结果表明异源表达的转化植株遭受冷冻胁迫时MfERF028可上调MtCAS15A基因的表达。该研究为阐明AP2/ERF家族基因抗逆机制提供了理论依据,并为培育抗逆豆科牧草提供了新的候选基因。     

柱花草SgLPR1基因克隆与表达分析

植物的生长和发育受土壤磷有效性的影响。柱花草(Stylosanthes guianensis)是主要的热带豆科牧草，对低磷胁迫表现出优良的适应性。由LPR基因编码的多铜氧化酶被报道在调控植物根系生长和低磷响应方面发挥重要作用。本研究分析了低磷胁迫对两个柱花草基因型生长的影响，并对SgLPR1基因进行了克隆和表达分析。结果表明：相对柱花草基因型‘TF0285’，‘TF0277’具有较高的植株干重和磷吸收效率，且低磷处理促进了‘TF0277’根系的生长。基因克隆分析表明，SgLPR1基因全长为1 713 bp，编码570个氨基酸残基，蛋白分子量为64.1 kDa，属于Cupredoxin家族成员，亚细胞定位预测SgLPR1蛋白定位于内质网上。实时定量聚合酶链反应(PCR)结果表明，SgLPR1基因在柱花草茎中表达量高于其他组织中的表达量，且在根尖大于1 cm的根段中表达量最高。相比对照处理，缺氮、缺磷和缺钾处理均增加了SgLPR1基因在柱花草叶和根中的表达量。此外，低磷处理增加了SgLPR1基因在柱花草‘TF0277’根中的表达，但其在‘TF0285’根中的表达无显著变化。本研究结果揭示了...     

德钦’紫花苜蓿叶绿体基因组序列及特征分析

‘德钦’紫花苜蓿(Medicago sativa L. ‘Deqin’,以下简称‘德钦’苜蓿)是一种优良的地方品种,具有特异耐旱性、耐热性和耐酸铝性。本研究利用Illumina第二代高通量测序技术对其叶绿体全基因组进行测序(NCBI登录号：MN218692),并对其结构及特征进行分析。结果显示：‘德钦’苜蓿叶绿体基因组含有一个反向重复区,属于IR缺失型;总长为125 470 bp,共有110个基因,其中蛋白质编码基因76个、tRNA 30个和rRNA 4个,缺失3个基因(rps16,rpl22和infA),总GC含量为33.9%;相对同义密码子使用度显示,‘德钦’苜蓿70.74%的密码子使用度>1,偏好以A和T结尾;共鉴定出115个SSRs位点,其中clpP基因鉴定出与紫花苜蓿不同SSRs位点;最大似然树结果显示‘德钦’苜蓿与紫花苜蓿聚在一起,支持率为75%。研究结果将对苜蓿属叶绿体基因组工程研究及‘德钦’苜蓿特异基因的进一步鉴定利用提供一定的参考价值。     

蒺藜苜蓿MtCKX基因功能的初步鉴定

采用RT-PCR法克隆了蒺藜苜蓿MtCKX基因,基因编码区长1635bp,编码544个氨基酸。生物信息学分析表明,其编码的蛋白与其他物种CKX蛋白具有较高的同源性,与鹰嘴豆的同源性最高。荧光定量分析结果表明,MtCKX基因在蒺藜苜蓿叶片中的表达量最高。此外,MtCKX基因还响应IAA、6-BA的诱导。成功构建了35S::MtCKX:YFP植物表达载体,亚细胞定位分析表明,MtCKX定位于细胞膜和细胞核。过表达的蒺藜苜蓿MtCKX基因可导致转基因拟南芥中细胞分裂素含量显著降低。     

紫花苜蓿MsHB1基因的克隆及表达分析

HD-Zip(Homologous structural Domain-leucine Zip,同源结构域-亮氨酸拉链)蛋白是植物特有的转录因子，其中HB1属于HD-ZIP I亚族。通过调节植物体内的内源激素含量变化，HB1转录因子可以提高植物对干旱、高盐等不利环境的抵抗能力。本文为探究紫花苜蓿HB1基因的生物学功能，采用RT-PCR技术成功克隆了MsHB1基因。其编码区长867 bp,编码288个氨基酸。氨基酸序列分析结果表明，HB1蛋白为不稳定蛋白。系统发育树分析表明HB1蛋白与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)同源蛋白的亲缘关系接近。构建MsHB1的原核表达载体，在大肠杆菌BL21中成功诱导紫花苜蓿MsHB1蛋白表达，Western Blot也证实MsHB1蛋白表达成功。表达分析显示：MsHB1基因在紫花苜蓿根、茎、叶中均有表达，在不同发育阶段中，幼嫩的叶片中表达最高。MsHB1在NaCl和ABA处理时的基因表达水平升高，推测MsHB1可能在紫花苜蓿高盐等胁迫应答方面发挥着重要的作用。     

香蕉MaUFGT1基因克隆及表达分析

从香蕉果肉中克隆得到了一个类黄酮-3-O-葡糖基转移酶基因UFGT1基因全长,利用生物信息学方法分析了该基因的基本理化性质、蛋白二级结构、亚细胞定位、亲疏水性、信号肽、跨膜区、磷酸化位点、基因结构、保守结构域、系统进化关系,并对该基因的时空表达模式及香蕉果实不同发育阶段进行了表达分析。结果表明：UFGT1基因长1380bp,编码459个氨基酸的蛋白质;该蛋白为疏水性蛋白,亚细胞定位在叶绿体,蛋白无跨膜结构,不存在信号肽;MaUFGT1在不同组织中均有表达,但表达丰度存在差异;MaUFGT1在‘巴西’和‘香粉1号’两个不同品种中,随着果实成熟,其表达量逐渐上升,后期‘香粉1号’明显高于‘巴西’。这些结果表明,MaUFGT1可能参与了香蕉果肉黄酮类物质的合成,为进一步研究MaUFGT基因的功能奠定了基础。     

杂花苜蓿叶绿体基因组特征及系统发育分析

本研究以‘草原3号’杂花苜蓿(Medicago varia‘Caoyuan No.3’)为材料，采用第二代高通量测序技术，对叶绿体基因组序列进行分析、组装及注释，以探究杂花苜蓿在系统发育中的位置及在分子水平上与其近缘物种的关系。结果表明：杂花苜蓿绿体基因组全长125 317 bp,为典型四分体结构，不存在IR区缺失的情况，GC含量为33.87%。叶绿体基因组共编码106个基因，其中蛋白质编码基因54个，涉及36 498个密码子。3种不同类型的88个SSR位点分布不均衡，在LSC,SSC,IR区域的SSR数量各自为79,7和2个。对苜蓿属7个植物进行共线性分析发现其重排现象严重。系统发育分析发现杂花苜蓿与紫花苜蓿的亲缘关系最近。本研究可为苜蓿属植物遗传变异、特异基因挖掘以及品种选育改良等研究提供参考。     

紫花苜蓿MsJMT基因的克隆及其与育性的关联分析

以实验室前期对紫花苜蓿(Medicago sativa L.)不育系BSA-Seq分析为背景,为探究茉莉酸类对其育性的影响,本试验采用PCR法,成功从紫花苜蓿基因组中克隆了一个全长1 047 bp,功能为控制茉莉酸O-甲基转移酶合成的基因,命名为MsJMT。分析表达模式后发现,该基因编码氨基酸348个,编码蛋白为不稳定非分泌亲水蛋白。亚细胞定位结果为核质表达。构建基因进化树后,验证其氨基酸序列与5种豆科植物相似度达99%以上。利用qPCR技术分析其对紫花苜蓿花苞育性的时空表达差异,结果显示不育系全时期表达量比保持系高且在Ⅲ时期两者差异极显著(P<0.01)。而茉莉酸含量测定结果则相反,为不育系全时期低于保持系,且保持系Ⅲ时期含量最高。利用外源茉莉酸甲酯喷施处理Ⅲ时期花苞,结果为在0.5 mmol·L^-1,1 mmol·L^-1水平下花药提前开裂。研究结果表明MsJMT可能通过茉莉酸通路影响紫花苜蓿育性。     

蒺藜苜蓿MtDWF1基因克隆、亚细胞定位及表达特征分析

Delta24-甾醇还原酶(Delta24-sterol reductase, DWF1)是油菜素内酯(Brassinosteroide, BR)合成途径中的关键酶，在植物生长发育中起着关键性的作用。为了研究DWF1基因在蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中的功能，本试验从蒺藜苜蓿R108中克隆MtDWF1基因全长序列，该基因开放阅读框(ORF)1 704 bp,编码567个氨基酸，分子量65.911 kD,理论等电点为8.53。亚细胞定位显示，该蛋白定位于细胞质内。进化分析表明，蒺藜苜蓿MtDWF1蛋白与鹰嘴豆(Cicer arietinum)、红三叶(Trifolium pratense)及豌豆(Pisum sativum)亲缘关系较为接近。MtDWF1基因在蒺藜苜蓿根、茎、叶中均有表达，在茎和叶中的表达水平较高。外源激素脱落酸(Abscisic acid, ABA)能够明显提高MtDWF1表达，水杨酸(Salicylic acid, SA)能够显著降低MtDWF1表达水平。同时，经油菜素内酯诱导后，MtDWF1表达水平整体呈现增加趋势。本研究为进一步探索MtDWF...     

紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因的克隆及对烟草的转化

柠檬酸合成酶是调节植物体内有机酸的活性酶之一,增加植物体内的柠檬酸可以提高植物对土壤中磷的吸收以及抗铝毒性。通过从紫花苜蓿(Medicago sativa L.)中克隆柠檬酸合成酶基因(MsCS),以期获得该基因全长,并为将来研究紫花苜蓿耐铝性以及对磷的吸收方向提供基础。首先利用cDNA末端快速扩增方法(RACE),克隆获得MsCS的cDNA全序列,然后利用pBI121构建植物超表达载体pBI-MsCS,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum L.)。结果显示:该基因序列全长为2031 bp,开放阅读框1551 bp,编码517个氨基酸,与其他物种的柠檬酸合成酶具有高度的同源性。获得17株卡那抗性植株。经PCR检测有6株为阳性植株,初步表明该基因已整合到烟草的基因组中。     

策勒黑羊ERα基因克隆、生物信息学分析及卵巢组织表达研究

【目的】克隆策勒黑羊雌激素受体α(estrogen receptorα,ERα)序列并进行生物信息学分析,同时测定策勒黑羊卵巢中ERα基因的表达情况。【方法】利用RT-PCR和TA克隆方法获得策勒黑羊ERα基因序列,并采用在线软件对其进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR方法检测ERα基因在策勒黑羊卵泡期、黄体期和妊娠30 d母羊卵巢中的表达情况。【结果】成功克隆获得策勒黑羊ERα基因序列,长1 791 bp,编码596个氨基酸,与山羊和牛的相似性最高。生物信息学分析显示,ERα蛋白分子式为C₂₉₃₀H₄₆₀₀N₈₂₂O₈₆₂S₄₁,理论等电点(pI)为7.32,不稳定指数为50.33,为不稳定亲水性蛋白;存在28个O-糖基化位点和54个磷酸化位点,不存在N-糖基化位点;主要定位在细胞核中,不具备跨膜结构;二级结构主要为α-螺旋及无规则卷曲。实时荧光定量PCR检测显示,ERα基因在策勒黑羊卵泡期、黄体期和妊娠30 d的卵巢中均有表达,与卵泡期相比,黄体期ERα基因表达量极显...     

紫花苜蓿MsSOS1基因的克隆与表达分析

Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因SOS1（salt overly sensitive 1）是植物在抵御盐胁迫过程中一个重要的必需基因之一。本研究在紫花苜蓿（Medicago sativa）叶片中克隆得到一个MsSOS1基因,编码859个氨基酸,具有一个CAP-ED superfamily结构域、一个Crp superfamily结构域和一个Na⁺/H⁺ Exchanger superfamily结构域。与鹰嘴豆、大豆、羽扇豆、花生和葡萄的一致性分别是91%,87%,85%,84%和77%。实时荧光定量PCR分析表明,MsSOS1基因在根、茎、叶和花中均有表达,其中在根中的表达量最高,花中最低。此外,MsSOS1基因在4℃、PEG和ABA的胁迫中的表达均受到调控,推测该基因的表达与紫花苜蓿的抗逆性有关。     

沙葱萤叶甲GdHsp70-2,GdHsp70-3的克隆鉴定与表达谱分析

为明确沙葱萤叶甲Galeruca daurica热激蛋白70 (Heat shock protein 70,Hsp70)基因的序列结构及其系统进化关系,本研究通过PCR技术克隆沙葱萤叶甲Hsp70基因cDNA全长序列与基因组序列,并进行生物信息学与表达谱分析。结果显示,克隆获得了沙葱萤叶甲2条Hsp70基因GdHsp70-2(GenBank登录号：MZ853083)和GdHsp70-3(Genbank登录号：OK585088),基因全长分别为2 410 bp和2 242 bp,各自编码657和646个氨基酸,均含有3个保守的HSP70家族特征序列,预测蛋白三维结构均由N-端ATPase功能域和C-端底物结合功能域所组成;系统发育分析表明GdHSP70-2,GdHSP70-3分别与松墨天牛(Monochamus alternatus)MaltHSC70-1、玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera) DvirHSP70-2的亲缘关系最近;基因组DNA克隆获得GdHsp70-2的两段内含子序列,GdHsp70-3则不含有内含子;表达谱分析结果表明GdHsp...     

犏牛L-PGDS基因克隆及其在各组织和睾丸不同发育阶段的表达研究

本研究旨在克隆犏牛前列腺素D合成酶（prostagland D synthase,L-PGDS）基因序列,并检测其在不同组织及不同发育时期睾丸中的表达水平,从而为深入研究L-PGDS基因在犏牛睾丸发育过程中的作用机制提供依据。采集成年健康犏牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大肠、小肠、胃、大脑及不同发育时期犏牛睾丸组织：胎牛期（5~6月）、幼年期（1~2岁）、青春期（2.5~4岁）、老年期（7~9岁）,Trizol法提取各组织总RNA,利用RT-PCR技术扩增、克隆L-PGDS基因序列并利用相关生物学软件进行分析,利用实时荧光定量PCR检测犏牛各组织及4个不同发育阶段睾丸中L-PGDS基因mRNA的表达水平。结果显示,L-PGDS基因序列全长624 bp,包括完整的开放阅读框576 bp,编码191个氨基酸。同源性比对发现,犏牛与黄牛和绵羊的同源性最高,分别为99.28%和94.0%。系统进化树分析结果显示,犏牛与黄牛亲缘关系最近,其次是绵羊、马。L-PGDS蛋白为不稳定疏水蛋白,分子质量为21.229 ku,分子式为C₉₅₃H₁₄₇₁N₂₅₁O₂₈₁S₉,等电点为6.43,不稳定指数为47.25,不含跨膜区及信号肽,蛋白质二级结构预测显示α-螺旋、无规则卷曲、延伸链分别占25.65%、53.40%和20.94%。实时荧光定量PCR检测结果显示,L-PGDS基因在犏牛睾丸组织中特异性高表达,极显著高于其他组织（P<0.01）;随着年龄增长L-PGDS基因mRNA在犏牛睾丸中呈先上升后下降趋势,其中在青春期相对表达量最高,极显著高于其他时期（P<0.01）。本研究结果为深入探究L-PGDS基因在犏牛睾丸发育过程中的作用机制提供了基础资料。     

藏山羊SFRS18基因克隆、表达及其与肌内脂肪含量相关性研究

试验旨在克隆藏山羊SFRS18(splicing factor arginine/serine-rich 18)基因CDS序列,并进行生物信息学分析,同时分析其组织表达特征以及与肌内脂肪含量进行相关性分析,为深入研究该基因在山羊肌内脂肪沉积中的作用积累数据。采用RT-PCR技术获得藏山羊SFRS18基因序列,结合生物信息学分析蛋白的理化性质、结构和不同物种的同源性,实时荧光定量检测SFRS18 mRNA表达情况,并将表达量与肌内脂肪含量相关联。结果表明,藏山羊SFRS18基因cDNA序列长为1299 bp,开放阅读框(ORF)长为1272 bp,编码423个氨基酸,蛋白分子结构式为C₂₀₀₃H₃₄₂₄N₇₆₀O₆₉₆S₄,分子质量为49.42 ku,等电点pI=11.20,SFRS18蛋白为不稳定的亲水性蛋白,无信号肽;有103个磷酸化位点,2个N-糖基化位点和39个O-糖基化位点;亚细胞定位于在细胞核(82.6%)、细胞质(8.7%)、细胞骨架(4.3%)和质膜(4.3%),属于非跨膜蛋白;预测二级结构由0.71% α-螺旋和99.29%无规则卷曲组成;藏山羊核苷酸序列和氨基酸序列与牛、绵羊和水牛的相似性最高(99%),系统进化树分析表明藏山羊与牛亲缘关系最近;实时荧光定量PCR结果显示,SFRS18基因在藏山羊的不同组织中都存在表达,其中在脾脏中表达水平最高,在背最长肌中表达水平最低;在藏山羊背最长肌和腿肌中SFRS18 mRNA表达与肌内脂肪含量均呈显著正相关(r=0.081,P<0.05;r=0.373,P<0.05)。SFRS18基因可以作为调节山羊脂肪沉积的候选基因。