紫花苜蓿CAMTA基因家族鉴定及其在非生物胁迫下的表达模式分析

钙调蛋白结合转录激活因子(CAMTA)是一类重要的钙调素结合蛋白,在激素信号转导、发育调控和环境胁迫耐受中发挥着重要作用。本研究采用生物信息学技术,基于紫花苜蓿“新疆大叶”参考基因组,对紫花苜蓿中CAMTA家族成员进行鉴定,并对这些基因的理化性质、系统发育树、保守结构域、染色体上位置、顺式作用元件、转录表达谱进行分析和验证。结果表明,共鉴定出17个MsCAMTA基因,MsCAMTA家族成员可划分为3个亚家族,亚家族成员在基因结构、保守基序位置上较为相似。染色体定位结果显示,MsCAMTA家族成员不均匀地分布在7条染色体上。启动子区具有大量响应低温、盐胁迫及植物激素信号相关的顺式作用元件。此外,采用RT—qPCR对盐(300 mmol·L^-1 NaCl)、模拟干旱(400 mmol·L^-1甘露醇)、低温(10℃)和脱落酸(100μmol·L^-1)处理下紫花苜蓿叶片中MsCAMTA1、MsCAMTA3、MsCAMTA11和MsCAMTA12的表达模式进行了初步研究。结果表明,4个MsCAMTA候选基因在各胁迫处理下均有一定程...     

草地早熟禾BBML基因的克隆及表达模式分析

为探究婴儿潮(BABY BOOM,BBM)基因诱导草地早熟禾(Poa pratensis)体胚发生的潜在功能,本研究采用同源克隆方法获得PpBBML(PpBBM-like)基因,并对其进行生信分析、亚细胞定位和表达模式分析。结果表明：PpBBML编码的蛋白具BBM特有的bbm-1基序且定位于细胞核,并与小麦(Triticum aestivum)BBM亲缘关系最近。PpBBML的表达水平存在组织特异性,表达量为花药>茎基>幼叶>根茎>老叶>不定根。6-BA,NAA(除0 h外),MeJA和EBR(除4 h外)处理后的PpBBML表达量均高于CK;GA₃处理后的PpBBML表达量均低于CK。在仅添加生长素的愈伤组织诱导培养基上,其表达量在接种第2 d最高。综上所述,PpBBML是AP2亚家族的转录因子基因,其表达量在幼嫩组织中最高且受到不同激素的诱导,并在愈伤组织形成初期表达量急剧上升,因此,该基因可能具有诱导草地早熟禾胚性愈伤组织发生的潜力。     

紫花苜蓿BAN基因的克隆及其生物信息学分析

BANYULS(BAN)基因编码的花青素还原酶是缩合单宁合成有关的一个关键酶.利用同源克隆的原理,采用RACE的方法,从紫花苜蓿中克隆得到了BAN基因(MsBAN),并对其进行了初步的分析.该基因cDNA全长1313bp,包括开放阅读框1017bp,编码339个氨基酸,在N端存在一个NADP结合位点“VIGGTGFVASLLIKQLLEKGY”.实时荧光定量PCR结果表明,该基因在紫花苜蓿荚果中表达量最高,花中最弱.在NaCl和PEG诱导下,MsBAN基因表达量明显高于对照.在外源激素ABA和GA3处理下,该基因被诱导表达.表明单宁可能在紫花苜蓿的抗逆性调控中也起到一定的作用.     

紫花苜蓿MsBBX24基因的克隆及耐盐性分析

盐胁迫是影响植物生长发育的主要非生物胁迫因子之一,BBX家族转录因子在植物色素积累、光形态发生、种子生长发育以及逆境适应等方面具有重要的调节作用。为明确紫花苜蓿BBX基因的功能,本研究使用Primer Premier 5软件根据NCBI数据库MsBBX24基因的序列设计特异性引物,以紫花苜蓿的cDNA为模板克隆MsBBX24基因。利用生物信息学软件对基因序列和结构进行分析,并与其他植物的BBX24进行比对和进化树构建,分析它们之间的进化关系。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MsBBX24基因的表达模式。利用DNA的酶切与连接方法构建MsBBX24过表达载体,采用农杆菌介导法将其转入野生型拟南芥,通过除草剂Basta筛选,以半定量RT-PCR鉴定获得阳性转基因植株。通过对野生型和MsBBX24转基因拟南芥植株的表型观察和生理指标测定分析它们的耐盐性。研究结果表明,MsBBX24基因编码区序列长723 bp,编码240个氨基酸,分子量为30.58 kDa,等电点为7.74,MsBBX24与鹰嘴豆和蒺藜苜蓿的BBX24具有较高的同源性。qRT-PCR检测结果表明,MsBBX24基...     

全基因组水平紫花苜蓿TCP基因家族的鉴定及其在干旱胁迫下表达模式分析

紫花苜蓿是世界最重要的豆科牧草之一,干旱是影响其产量和地理分布的关键瓶颈。在紫花苜蓿响应干旱胁迫过程中,转录因子发挥着重要的调控作用。TCP（teosinte branchesd 1/cycloidea/pro-liferating cell factors）为植物特有的转录因子,在植物生长、发育、响应逆境胁迫中都具有重要的生物学功能。截至目前,该基因家族在紫花苜蓿中的分布以及响应干旱胁迫的生物学功能仍未见报道。因此,为进一步挖掘紫花苜蓿中响应干旱胁迫功能基因,本研究利用生物信息学方法在全基因组水平对TCP基因家族进行了鉴定,并对其系统进化、基因结构、染色体定位、共线性分析以及干旱胁迫下的表达模式进行了分析。结果表明,紫花苜蓿基因组中共鉴定出40个MsTCP基因,不均匀地分布于20条染色体上,其中包括17对旁系同源基因对,且都是基因片段复制事件。系统发育和保守结构域分析发现,MsTCP基因可以分为2个大分支和3个亚家族（PCF, CIN与CYC/TB1）,同一分支中的成员具有相同氨基酸数目的TCP结构域,同亚家族中的成员具有相似的保守基序与基因结构。此外,通过分析紫花苜蓿响应干旱转录组数据共鉴定出4个可能与紫花苜蓿响应干旱胁迫有关的MsTCP基因（MsTCP23,MsTCP27,MsTCP29,MsTCP33）。qRT-PCR结果进一步表明PEG模拟干旱胁迫处理后,这4个基因的表达量在根和叶中均显著上调,进一步确定了这些基因的确响应紫花苜蓿干旱胁迫。该研究为后期深入解析紫花苜蓿响应干旱胁迫理论以及通过基因工程技术创制高抗旱紫花苜蓿新种质奠定基础。     

紫花苜蓿MsSOS1基因的克隆与表达分析

Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因SOS1（salt overly sensitive 1）是植物在抵御盐胁迫过程中一个重要的必需基因之一。本研究在紫花苜蓿（Medicago sativa）叶片中克隆得到一个MsSOS1基因,编码859个氨基酸,具有一个CAP-ED superfamily结构域、一个Crp superfamily结构域和一个Na⁺/H⁺ Exchanger superfamily结构域。与鹰嘴豆、大豆、羽扇豆、花生和葡萄的一致性分别是91%,87%,85%,84%和77%。实时荧光定量PCR分析表明,MsSOS1基因在根、茎、叶和花中均有表达,其中在根中的表达量最高,花中最低。此外,MsSOS1基因在4℃、PEG和ABA的胁迫中的表达均受到调控,推测该基因的表达与紫花苜蓿的抗逆性有关。     

紫花苜蓿柠檬酸合成酶基因的克隆及对烟草的转化

柠檬酸合成酶是调节植物体内有机酸的活性酶之一,增加植物体内的柠檬酸可以提高植物对土壤中磷的吸收以及抗铝毒性。通过从紫花苜蓿(Medicago sativa L.)中克隆柠檬酸合成酶基因(MsCS),以期获得该基因全长,并为将来研究紫花苜蓿耐铝性以及对磷的吸收方向提供基础。首先利用cDNA末端快速扩增方法(RACE),克隆获得MsCS的cDNA全序列,然后利用pBI121构建植物超表达载体pBI-MsCS,通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tabacum L.)。结果显示:该基因序列全长为2031 bp,开放阅读框1551 bp,编码517个氨基酸,与其他物种的柠檬酸合成酶具有高度的同源性。获得17株卡那抗性植株。经PCR检测有6株为阳性植株,初步表明该基因已整合到烟草的基因组中。     

紫花苜蓿MsHB1基因的克隆及表达分析

HD-Zip(Homologous structural Domain-leucine Zip,同源结构域-亮氨酸拉链)蛋白是植物特有的转录因子,其中HB1属于HD-ZIP I亚族。通过调节植物体内的内源激素含量变化,HB1转录因子可以提高植物对干旱、高盐等不利环境的抵抗能力。本文为探究紫花苜蓿HB1基因的生物学功能,采用RT-PCR技术成功克隆了MsHB1基因。其编码区长867 bp,编码288个氨基酸。氨基酸序列分析结果表明,HB1蛋白为不稳定蛋白。系统发育树分析表明HB1蛋白与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)同源蛋白的亲缘关系接近。构建MsHB1的原核表达载体,在大肠杆菌BL21中成功诱导紫花苜蓿MsHB1蛋白表达,Western Blot也证实MsHB1蛋白表达成功。表达分析显示：MsHB1基因在紫花苜蓿根、茎、叶中均有表达,在不同发育阶段中,幼嫩的叶片中表达最高。MsHB1在NaCl和ABA处理时的基因表达水平升高,推测MsHB1可能在紫花苜蓿高盐等胁迫应答方面发挥着重要的作用。     

鸡HMIT基因的克隆与表达分析

旨在克隆鸡H+/肌醇转运蛋白（H+/myoinositol transporter,HMIT）基因的转录序列,并检测HMIT基因在鸡不同组织中的表达情况,以及外源胰岛素处理对HMIT基因相对表达量的影响。本研究以AA肉鸡为试验动物,采用RT-PCR技术克隆鸡HMIT基因全编码区序列,采用生物信息学技术分析其编码蛋白的生物学特性,利用荧光定量PCR检测HMIT基因在大脑、肝、腹脂、腿肌、心、肾、空肠和回肠等组织中的表达情况,并检测其在肾和大脑中进行胰岛素处理120和240 min后的表达情况。结果表明,以NCBI预测的鸡HMIT（XM_001232939.5）序列为模板设计引物,成功克隆出鸡HMIT基因（1 694 bp,GenBank登录号：MN708211）。克隆的鸡HMIT编码区全长1 380 bp,相比XM_001232939.5预测的编码序列少561 bp,预测编码含有459个氨基酸组成的蛋白。核苷酸和氨基酸序列比对发现,鸡HMIT在物种间高度同源,共线性分析显示,HMIT所在的1号染色体区域在物种间也是高度保守的。HMIT编码的蛋白质是一种不稳定的亲水性蛋白质,其二级结构和三级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主。跨膜结构分析显示,鸡HMIT存在8个明显的跨膜结构域。亚细胞定位结果表明,鸡HMIT蛋白分布于质膜（52.3%）、内质网（21.7%）、液泡（17.4%）、线粒体（4.3%）和高尔基体（4.3%）。实时荧光定量PCR检测结果显示,HMIT基因在鸡大脑和肾表达量最高,且显著高于其他组织（P<0.05）。胰岛素处理240 min后,HMIT在肾和大脑中的表达量都显著低于PBS对照组（P<0.05）。本研究克隆获得了鸡HMIT的全编码区,生物信息学分析及组织表达特性研究为深入探索鸡HMIT基因的生理功能和调控机制奠定基础。     

紫花苜蓿MsJMT基因的克隆及其与育性的关联分析

以实验室前期对紫花苜蓿(Medicago sativa L.)不育系BSA-Seq分析为背景,为探究茉莉酸类对其育性的影响,本试验采用PCR法,成功从紫花苜蓿基因组中克隆了一个全长1 047 bp,功能为控制茉莉酸O-甲基转移酶合成的基因,命名为MsJMT。分析表达模式后发现,该基因编码氨基酸348个,编码蛋白为不稳定非分泌亲水蛋白。亚细胞定位结果为核质表达。构建基因进化树后,验证其氨基酸序列与5种豆科植物相似度达99%以上。利用qPCR技术分析其对紫花苜蓿花苞育性的时空表达差异,结果显示不育系全时期表达量比保持系高且在Ⅲ时期两者差异极显著(P<0.01)。而茉莉酸含量测定结果则相反,为不育系全时期低于保持系,且保持系Ⅲ时期含量最高。利用外源茉莉酸甲酯喷施处理Ⅲ时期花苞,结果为在0.5 mmol·L^-1,1 mmol·L^-1水平下花药提前开裂。研究结果表明MsJMT可能通过茉莉酸通路影响紫花苜蓿育性。     

桑树橡胶延伸因子基因的克隆与表达分析

桑树乳汁在桑树的生长和防御过程中起重要作用,乳汁中的糖苷酶抑制剂还是治疗糖尿病的有效成分。通过桑树cDNA文库中的序列比对,发现一段与乳汁合成相关的基因片段,采用RACE方法获得该基因的全长序列,基因cDNA全长1 145 bp,编码区759 bp,编码252个氨基酸残基,将该基因命名为桑树橡胶延伸因子基因(GenBank登录号:GQ466080)。为探究该基因的功能,通过RT-PCR的方法分析该基因在桑树不同组织器官的表达,结果表明该基因在桑树幼叶中的表达量最高,其次是茎和芽,在根中的表达量最低。对桑树叶片进行细胞分裂素处理,发现细胞分裂素处理后该基因表达量有减少的趋势,在细胞分裂素处理的叶片中,正在伸展的幼叶中该基因的表达量要高于刚出现的幼叶和成熟叶。与桑树中已知的其它功能基因相比,桑树橡胶延伸因子在桑树正常生长中的表达量远高于桑树Na+/H+逆向转运蛋白基因MaNHX和桑树抗冻蛋白基因WAP27的表达量。从以上结果初步推测桑树橡胶延伸因子基因在桑树的生长发育中起重要作用。     

香蕉MaUFGT1基因克隆及表达分析

从香蕉果肉中克隆得到了一个类黄酮-3-O-葡糖基转移酶基因UFGT1基因全长,利用生物信息学方法分析了该基因的基本理化性质、蛋白二级结构、亚细胞定位、亲疏水性、信号肽、跨膜区、磷酸化位点、基因结构、保守结构域、系统进化关系,并对该基因的时空表达模式及香蕉果实不同发育阶段进行了表达分析。结果表明：UFGT1基因长1380bp,编码459个氨基酸的蛋白质;该蛋白为疏水性蛋白,亚细胞定位在叶绿体,蛋白无跨膜结构,不存在信号肽;MaUFGT1在不同组织中均有表达,但表达丰度存在差异;MaUFGT1在‘巴西’和‘香粉1号’两个不同品种中,随着果实成熟,其表达量逐渐上升,后期‘香粉1号’明显高于‘巴西’。这些结果表明,MaUFGT1可能参与了香蕉果肉黄酮类物质的合成,为进一步研究MaUFGT基因的功能奠定了基础。     

杧果MiNPR1抗病基因克隆及生物信息学分析

NPR1是SA介导的植物抗病通路中的转录共激活因子。本实验采用RT-PCR技术从杧果（Mangifera indica）中分离得到了MiNPR1-1和MiNPR1-2。序列分析显示：MiNPR1-1基因编码471个氨基酸,MiNPR1-2基因编码445个氨基酸。2种MiNPR1蛋白皆含BTB/POZ结构域和锚蛋白重复序列,非跨膜蛋白且无信号肽,为不稳定酸性亲水蛋白。蛋白结构预测表明：MiNPR1蛋白由α-螺旋、无规则卷曲、延伸链和β-折叠构成,三级结构与二级结构相符。进化关系得出：MiNPR1-1为单独分支起源,MiNPR1-2蛋白与阿月浑子（Pistacia vera）的XP_031280798.1聚类为一簇。本研究克隆了杧果NPR1基因,预测其编码蛋白特征,为后续研究该基因在杧果上的功能及培育杧果优良抗病品种提供参考。     

柞蚕核糖体蛋白基因S3a的克隆及表达分析

核糖体蛋白在蛋白质的生物合成、细胞的代谢与凋亡、机体免疫、信号转导等方面有重要作用。采用RT-PCR方法克隆了柞蚕(Antheraea pernyi)核糖体蛋白基因S3a的开放阅读框(ORF),ORF序列长795bp,编码264个氨基酸。序列比对表明,柞蚕S3a蛋白与其它10个物种S3a蛋白的相似性介于72%～99%之间,其中与柳蚕(Actias selene)S3a蛋白的相似性最高。用RT-PCR方法分析该基因在柞蚕幼虫组织中的表达情况,结果显示柞蚕S3a基因在柞蚕幼虫的血液、中肠、丝腺和脂肪体组织中均有表达,且转录水平无显著差异。SDS-PAGE和Westernblotting检测显示柞蚕S3a基因在大肠杆菌中获得了正确表达。     

单增李斯特氏菌溶血素基因的克隆及原核表达

参考GenBank收录的单增李斯特菌Hly基因序列,设计1对引物,采用PCR技术扩增出单增李斯特氏菌的溶血素基因Hly(不含有信号肽部分),得到一条1590bp的条带。将其连入pMD18-T载体,经酶切、PCR鉴定和序列测定法进行鉴定。测序正确后,将该基因插入到pET-28a中构建原核表达载体pET-28a-sHly,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,将诱导产物用SDS-PAGE和Western-blot鉴定。结果显示,Hly基因可以在大肠杆菌中获得表达,表达产物分子质量约为65kU,与预期蛋白质分子质量大小一致。经Western-blotting鉴定可知,诱导表达产物以可溶形式存在,可被兔抗LM阳性血清特异识别,具有较好的抗原活性,为进一步研制基于溶解素蛋白的诊断抗原和特异性单克隆抗体,开展LM的致病与免疫机理研究奠定基础。     

柳枝稷PvbZIP8基因的克隆与表达分析

bZIP转录因子在植物非生物逆境胁迫的响应中发挥着重要作用,本研究通过同源克隆在柳枝稷（Panicum virgatum L.）中获得PvbZIP8基因,并对该基因进行了初步的生物信息学分析,同时利用荧光定量PCR技术进行了非生物胁迫下基因表达模式分析以及组织特异性表达分析。结果显示：基因的开放阅读框长度为468 bp,编码155个氨基酸,分子式为C₇₆₁H₁₂₄₈N₂₄O₂₃S₈,分子量为17.81 kDa,为亲水性蛋白。系统进化分析表明该蛋白与哈氏黍（Panicum hallii）、谷子（Setaria italica）和糜子（Panicum miliaceum）相似性较高,并且具有典型的bZIP保守结构域,属于bZIP转录因子家族成员。定量PCR结果显示,PvbZIP8基因在盐、干旱、高温和低温胁迫下上调表达,在柳枝稷抗逆过程中发生作用。组织特异性表达分析表明,PvbZIP8在多个组织或器官均有表达,其中在根、茎、叶中表达量较高。本研究初步确定柳枝稷PvbZIP8基因响应抗逆性反应,并为进一步研究柳枝稷PvbZIP8基因的生物学功能奠定基础。     

桑树天冬酰胺合成酶基因的克隆与表达分析

天冬酰胺合成酶B(asparagine synthetase,AS-B;EC 6.3.5.4)参与植物氮同化过程的催化与调节。在构建的盐胁迫下桑树(Morus L.)抑制消减杂交(SSH)文库中发现一个编码天冬酰胺合成酶的基因片段,采用cDNA末端快速扩增(RACE)方法获得2 061 bp的全长序列,完整的开放读码框(ORF)长1 761 bp,编码586个氨基酸,预测蛋白分子质量65.66 kD,将该基因命名为桑树天冬酰胺合成酶基因(MaAS,GenBank登录号:HQ025955)。序列分析显示,MaAS编码的蛋白包括2个保守的功能域(谷氨酰胺-氨基转移结构域和合成酶结构域),与其它植物天冬酰胺合成酶的氨基酸序列相似性在75%以上。将MaAS基因开放读码框连接到pET28a(+)表达载体中,转化大肠杆菌BL21后,诱导表达的MaAS重组蛋白分子质量大小与预测的分子质量一致。采用邻接法构建的桑树和其它植物基于MaAS蛋白氨基酸序列的系统进化树显示:桑树、葡萄(Vitis vinif-era)、毛果杨(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)聚为一类,亲缘关系较近。半定量RT-PCR分析表明,MaAS基因在桑树不同部位的转录水平存在明显差异,在盛花期的雌花中转录水平最高,尚未木质化的幼根和成熟桑椹中的转录水平较高,幼茎的茎皮和木质部中的转录水平较低,嫩叶中的转录水平很低,腋芽中的转录水平最低。     

紫花苜蓿MsZIP基因RNAi表达载体的构建及苜蓿转化

根据已经得到的MsZIP基因序列(GenBank序列号:HQ911778),设计两对含有酶切位点的引物ZIPF1/ZIPF2和ZIPR1/ZIPR2,合成用于构建干扰载体的正反义片段。将正反义片段插入到载体pART27中,构建成为含有发夹结构的RNAi干扰载体pART-F-R。采用农杆菌介导的方法,将该干扰载体成功转化到苜蓿中,得到9株抗性苗,选取其中的3株进行PCR鉴定,结果表明成功得到转基因苜蓿。