紫花苜蓿不同栽培品种植株再生的研究

离体培养条件下对紫花苜蓿地方栽培品种--陇东苜蓿、和田苜蓿、准格尔苜蓿以及引进品种Rambler苜蓿植株不同部位的再生进行了研究,结果表明,不同的苜蓿品种、外植体、外源激素种类及其浓度等因素均影响着植株的再生.陇东苜蓿下胚轴愈伤组织出愈率和体细胞胚形成率最高可达91.04%和63.75%;和田苜蓿下胚轴愈伤组织出愈率最高可达92.05%,体细胞胚形成率最高为56.82%.这2个品种在紫花苜蓿的组织培养植株再生中是较理想的试验材料;紫花苜蓿下胚轴是理想的受体材料.苜蓿愈伤组织的诱导、体细胞胚的形成以2.0 mg/L 2,4-D处理2周为最佳;在2.0 mg/L 2,4-D 0.5～2.0 mg/L 6-BA的作用下,外植体产生愈伤组织以及进一步发育的趋势较强.对体细胞胚的发育和幼苗的形成则以2.0 mg/L 6-BA 0.5 mg/L NAA的激素组合进行处理.适宜的生根培养基为1/2 MS 1.0 mg/L IBA 1%蔗糖 0.7%琼脂.     

二穗短柄草幼胚再生体系及农杆菌介导转化的初步研究

以二穗短柄草3个品系BDR018,BD21,BD21-3的幼胚为外植体,研究了幼胚大小对胚性愈伤组织诱导和再生的影响。采用携带gus和bar基因双元表达载体(pDM805)的根癌农杆菌菌株AGL1对BDR018品系的幼胚愈伤组织进行了遗传转化。本实验探讨了影响幼胚愈伤组织诱导再生及遗传转化的几个因素。结果发现,幼胚大小介于0.5～1.0mm之间的愈伤组织诱导率最高。随愈伤组织年龄的增加,BDR018,BD21,BD21-3愈伤组织的再生率下降,白化率上升。愈伤组织年龄在5～8周范围内转化效率较高,平均转化效率为38.5%。真空处理5min和0.01%的SilwetL-77处理均可提高转化效率。对转化植株进行GUS基因化学组织检测和PCR鉴定,初步证明外源基因已整合再生植株基因组中。     

AtNHX1基因对菊苣的转化和耐盐性研究

用农杆菌介导法将AtNHX1基因导入菊苣中,共获得42株卡那霉素(Kan)抗性再生植株。经过PCR检测、Southern杂交和RT-PCR检测表明,AtNHX1基因已成功整合到菊苣基因组中,并且能够正常转录。野生型和转基因植株诱发的愈伤组织进行耐盐生长试验,结果显示,相同盐胁迫条件下,转基因愈伤组织的相对生长率显著高于野生型愈伤组织。施加梯度NaCl胁迫后,植株叶片K⁺和Na⁺含量测定结果显示,转基因植株叶片比野生型积累更多的Na⁺和K⁺,维持较高的K⁺/Na⁺;叶片相对电导率测定结果表明,转基因株系叶片相对电导率显著低于野生型。上述结果表明,AtNHX1基因的导入和表达在提高菊苣耐盐性的同时减轻了盐胁迫对植物细胞膜的伤害。     

紫花苜蓿胚性愈伤组织诱导与增殖的研究

为在不同栽培苜蓿(Medicago sativa)品种上，建立稳定、快速且高效的组织培养体系，本试验以品种'游客’、'Paola’和'Sardi7’为研究材料，探究了苜蓿外植体、激素配比及金属离子(Cu²⁺、Ag⁺)，对其胚性愈伤组织的诱导效果。结果表明：下胚轴为诱导愈伤组织的最佳外植体；MS+1 mg·L^-12,4-D+0.2 mg·L^-1 KT为培养基时'游客’和'Paola’胚性愈伤诱导率分别为24.7%，16.7%；MS+2 mg·L^-12,4-D+0.2 mg·L^-1 KT为培养基时'Sardi7’胚性愈伤诱导效果最佳为27.3%；1 μmol·L^-1 和5 μmol·L^-1 Cu²⁺均能显著促进'Sardi7’'游客’和'Paola’愈伤组织的诱导；5 μmol·L^-1 Ag⁺显著诱导'游客’和'Paola’形成胚性愈伤组织，诱导率分别提高25.3%,46.7%(P<0.05)。本研究探索了诱导苜蓿愈伤组织的最佳外植体及其培养条件、金属离子促进不同苜蓿品种再生的作用，为突破同源四倍体栽培苜蓿品种基因型上的限制、提高胚性愈伤组织出愈率提供了思路。     

紫花与杂花苜蓿再生影响因子的比较研究

对紫花苜蓿(Medicago sativa L.)(秘鲁、关中、甘农3号)及杂花苜蓿(Medicagovaria Martyn)(甘农1号、甘农2号)组培再生体系各影响因子进行比较研究。结果表明:紫花、杂花苜蓿的组培再生能力差异较大,前者显著高于后者;在愈伤组织诱导中,子叶节是最佳的外植体材料;2,4-D浓度增加对紫花苜蓿出愈率影响不明显,但杂花苜蓿的出愈率随着2,4-D浓度的增加呈明显的升高趋势;紫花苜蓿的最佳愈伤组织诱导培养基为MS₊2,4-D2.0mg/L+蔗糖30g/L,诱导率均在95%以上;杂花苜蓿为MS₊2,4-D 4.0mg/L+蔗糖30 g/L,两个品种诱导率分别为65.6%、73.3%;5个品种的最适分化培养基均为MS₊KT 1.0 mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖20 g/L或MS₊BA4.0 mg/L,分化率也各有差异,紫花苜蓿不定芽的分化率可达到70%左右,而杂花苜蓿在30%左右;最佳诱导生根的培养基为1/2MS₊IBA 1.0 mg/L;本研究建立了紫花苜蓿高频再生组织培养体系,为实现外源基因的高效遗传转化奠定基础;通过紫花苜蓿和杂花苜蓿的再生体系影响因子的比较研究,为杂花苜蓿再生体系的建立提供参考。     

农杆菌介导的PSAG12-IPT基因转化柳枝稷研究

为延长生物能源作物柳枝稷(Panicum virgatum)的叶片功能期,以柳枝稷‘西稷1号’品系的成熟胚诱导的愈伤组织为受体,采用农杆菌介导法转化叶片衰老延缓基因P_SAG12-IPT.结果表明:经过农杆菌转化,共培养,抗性愈伤组织筛选、再生和生根培养,在农杆菌介导处理的8500块愈伤组织中共获得了320株转化植株;经PCR检测分析,转化植株中共有19株植株扩增出标记基因潮霉素B磷酸转移酶基因的目标片段,初步表明P_SAG12-IPT基因已整合到柳枝稷基因组中,转化率为0.223%.对柳枝稷转基因植株的叶片叶绿素含量、净光合速率、胞间CO₂浓度和气孔导度进行测定,表明P_SAG12-IPT基因在部分转基因植株中已经表达.     

Lyz-GFP双元基因在苜蓿愈伤组织中的转化

利用农杆菌介导法将溶菌酶(Lyz)与绿色荧光蛋白(GFP)基因转入"甘农1号"杂花苜蓿(Medicago sativa Martyn)和"甘农3号"紫花苜蓿(Medicagosativa L.)品种中,获得含有该双元基因的苜蓿转基因愈伤组织;采用荧光检测和PCR扩增技术,检测到溶菌酶Lyz和绿色荧光蛋白GFP基因在苜蓿愈伤细胞中的表达;研究该双元基因在苜蓿品种"甘农1号"和"甘农3号"中转化的若干影响因素,确定适宜的转化条件以期提高基因转化效率。结果表明:75 mg·L^-1的卡那霉素对苜蓿愈伤组织的生长具有显著抑制效应;300mg·L^-1头孢霉素能够有效地抑制农杆菌LBA4404的生长;OD₆₀₀值为0.4-0.5的农杆菌适宜的侵染时间是10min;经预培养3-4d的材料侵染后再共培养3d之后,在愈伤组织诱导培养基MS₊2,4-D 2.0mg·L^-1+KT0.5 mg·L^-1+0.6%琼脂+2.5%蔗糖的培养基上诱导出抗性愈伤组织;"甘农1号"和"甘农3号"的抗性愈伤组织诱导率分别为35%和32%。     

利用基因枪共转化法获得转bar与P5CS基因黑麦草

以多年生黑麦草(Lolium perenne L.)种子成熟胚为外植体进行高效诱导愈伤组织的组培条件,在此基础上用基因枪法轰击其成熟胚的愈伤组织,共转化分别携带bar基因和P5CS基因表达框架的2种质粒,经1.2‰草丁磷(Glufosinate)抗性筛选获得了转基因再生植株.经聚合酶链式反应(PCR)检测筛选到整合bar基因的株系18个,遗传转化率为0.72%,其中5个检测到P5CS,共转化效率为27.8%.     

苜蓿组织培养研究进展

苜蓿Medicago spp.组织培养已在多个种上取得成功,且以紫花苜蓿M. sativa最多。对苜蓿组织培养的外植体选择、培养基组成成分、愈伤组织和体细胞胚的诱导、植株再生以及基因型的选择5个方面阐述了苜蓿组织培养的研究现状。并进一步对目前存在的问题和发展趋势进行了归纳,以期为苜蓿基因工程和细胞工程研究提供有益的借鉴。     

口蹄疫病毒抗原决定簇融合基因转化苜蓿

摘要：通过农杆菌的介导,以携带O型和A型口蹄疫抗原决定簇融合基因O21 O14 A21 HBcAg的植物表达载体转化苜蓿(Medicago sativa)愈伤组织,并再生得到抗性植株。试验建立了苜蓿甘农1号愈伤组织再生系统;优化了农杆菌介导的苜蓿遗传转化系统;获得抗性再生植株4棵;GUS报告基因在转化的愈伤组织中得到瞬时表达;抗性植株PCR检测结果证实目的基因已经成功整合到苜蓿基因组中。     

抗逆转录因子在百脉根中的功能分析

为提高豆科牧草百脉根抗旱方面的能力,从沙生植物胡杨和铃铛刺中克隆了4个抗逆转录因子基因并进行功能分析,从中筛选了2个具有抗旱特性的基因PeDREB2a和HhERF2,构建了以磷酸甘露糖异构酶为筛选标记的单、双价植物表达载体,转化百脉根Leo品种,结果表明,转录因子基因明显改善了百脉根的抗旱特性,经过抗旱复水试验证明转基因百脉根成活率达到100%。     

海滨雀稗以hpt与bar基因为筛选标记的转化体系比较研究

海滨雀稗作为耐盐性较强的暖季型草坪草,具有极大的应用潜力。为建立高效稳定的海滨雀稗遗传转化体系,本研究以海滨雀稗成熟种子为外植体,确定了筛选剂潮霉素和草丁膦在海滨雀稗的愈伤组织继代培养和再生阶段的最佳筛选压。在进一步优化遗传转化条件的基础上,比较了以hpt与bar基因作为转基因筛选标记对海滨雀稗农杆菌介导的遗传转化效率的影响。结果表明：愈伤组织的再生率在继代36周后显著下降,继代48周的最高再生率为67.9%。潮霉素的最佳筛选压在继代培养阶段为120 mg·L^-1,再生阶段为80 mg·L^-1。草丁膦的最佳筛选压均为1.2 mg·L^-1。选取继代24周的愈伤组织用于农杆菌介导的遗传转化,最佳的转化条件为菌液浓度OD600=0.6,添加100μmol·L^-1乙酰丁香酮和0.01%的Silwet L-77,并辅以超声波处理20 min或真空处理10 min,浸染30min后共培养2 d。通过多次抗性愈伤组织和抗性再生苗的筛选,2种载体均获得了转基因再生植株。通过PCR检测证明hpt和bar基因分别成功在...     

过表达长穗偃麦草EeHKT1；4基因增强拟南芥抗旱耐盐性分析

植物高亲和性K⁺转运蛋白基因（HKT）编码K⁺、Na⁺转运或K⁺-Na⁺共转运质膜通道蛋白,在植物抗逆过程中发挥重要作用。为了研究长穗偃麦草EeHKT1;4（GenBank： KF956112.1）的功能作用,构建了EeHKT1;4过表达植物表达载体转化拟南芥,进行拟南芥转基因植株的抗旱耐盐性评价分析。结果显示,正常生长条件下野生型（WT）与转基因株系的主根长度无差异,NaCl与甘露醇处理下WT和转基因株系根的生长受到抑制,转基因株系根长度均大于同等胁迫条件下（WT）的根长;正常生长条件下WT与转基因株系表型无显著差异,但在NaCl与甘露醇处理下WT表现出叶片萎缩和植株枯黄,转基因株系仅部分植株表现出叶片萎缩,同一胁迫条件下转基因株系的植株存活率皆高于WT。硝基氮蓝四唑（NBT）与二氨基联苯胺（DAB）染色结果显示,正常生长条件下WT与转基因株系叶片染色相对较浅,随着NaCl与甘露醇浓度提高,所有叶片染色程度逐渐加深且同等胁迫下WT染色程度高于转基因株系。以正常生长条件下基因的表达量为对照,随着NaCl浓度的增加,AtSOS1基因在WT和转基因植株中逐渐上调且在转基因中的表达量高于WT;AtNHX1基因在NaCl处理下上调表达且转基因植株中表达量低于WT,除转基因株系L5外并未检测到WT和转基因株系自身因NaCl浓度的提高AtNHX1基因表达量发生改变;在甘露醇处理下,AtRD29B和AtP5CS1基因均上调表达且转基因植株中表达量高于WT。综上所述,EeHKT1;4过表达降低了逆境胁迫下拟南芥中超氧阴离子和H₂O₂的积累,诱导抗逆基因上调表达,增强拟南芥抗旱耐盐性。     

紫花苜蓿MsBBX24基因的克隆及耐盐性分析

盐胁迫是影响植物生长发育的主要非生物胁迫因子之一，BBX家族转录因子在植物色素积累、光形态发生、种子生长发育以及逆境适应等方面具有重要的调节作用。为明确紫花苜蓿BBX基因的功能，本研究使用Primer Premier 5软件根据NCBI数据库MsBBX24基因的序列设计特异性引物，以紫花苜蓿的cDNA为模板克隆MsBBX24基因。利用生物信息学软件对基因序列和结构进行分析，并与其他植物的BBX24进行比对和进化树构建，分析它们之间的进化关系。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MsBBX24基因的表达模式。利用DNA的酶切与连接方法构建MsBBX24过表达载体，采用农杆菌介导法将其转入野生型拟南芥，通过除草剂Basta筛选，以半定量RT-PCR鉴定获得阳性转基因植株。通过对野生型和MsBBX24转基因拟南芥植株的表型观察和生理指标测定分析它们的耐盐性。研究结果表明，MsBBX24基因编码区序列长723 bp，编码240个氨基酸，分子量为30.58 kDa，等电点为7.74,MsBBX24与鹰嘴豆和蒺藜苜蓿的BBX24具有较高的同源性。qRT-PCR检测结果表明，MsBBX24基...     

西藏野生垂穗披碱草EnCBL10基因的克隆与功能研究

钙调磷酸酶B类蛋白(Calcineurin B-Like Proteins, CBLs)是钙信号通路中重要成员,在植物应答多种非生物胁迫中具有重要的作用。本研究基于前期转录组数据,在西藏野生垂穗披碱草(Elymus nutans Griseb.)中筛选EnCBL10基因,将其异源表达于烟草(Nicotiana tabacum)中,分析转基因植株EnCBL10在低温和干旱胁迫下的生长及生理响应。结果表明：EnCBL10开放阅读框为792 bp,编码263个氨基酸。EnCBL10蛋白的理论等电点为5.17,为疏水蛋白和非分泌蛋白。低温和干旱胁迫下,对比于野生型烟草,转基因烟草叶片的细胞膜稳定性显著增加,过氧化物酶(Peroxidase, POD),抗坏血酸过氧化物酶(Aseorbateperoxidase, APX)和谷胱甘肽还原酶(Gluathione reductase, GR)活性显著升高。低温胁迫下,两个转基因株系的脯氨酸含量分别提高了79.7%和70.8%(P<0.05);在干旱胁迫下,野生型植株(WT)和过表达植株中脯氨酸含量均有所降低,但转基因植株比WT的下降幅度小。因...     

转多抗基因新疆大叶苜蓿光合生理特征对土壤水分变化的响应

以新疆大叶苜蓿及其为母本的4种转基因株系(SN:转AtNDPK2基因;SC:转codA基因;SOR:转IbOr基因;SAF:转AtABF3基因)为研究材料,通过盆栽控制试验,比较研究了不同土壤水分条件下始花期各株系苜蓿的光合和荧光参数特征。结果表明,随土壤含水量从80% FC(田间持水量)降至40% FC,各株系叶片净光合速率(P_n)、蒸腾速率(T_r)和气孔导度(G_s)均呈下降趋势,叶片瞬时水分利用效率(WUE_i)呈上升趋势。在40% FC时,各转基因株系P_n值(11.19~21.58 μmol·m^-2·s^-1)均显著(P<0.05)大于非转基因株系(6.06 μmol·m^-2·s^-1),各株系间WUE_i无差异但以转AtABF3基因株系最大(3.22 μmol·mmol^-1)。土壤水分降低过程中,各株系叶片初始荧光(F_o),最大光化学效率(F_v/F_m)和光化学淬灭系数(qP)值总体呈下降趋势,实际光化学效率(Φ_PSⅡ)和表观电子传递效率(ETR)值呈先上升后下降,而非光化学淬灭系数(NPQ)值整体呈上升趋势。转基因株系qP值出现显著下降时的土壤水分含量(50% FC)低于非转基因(70% FC)苜蓿。在40% FC时,转基因株系F_v/F_m(0.78~0.82)值显著高于非转基因苜蓿(0.58)。总体表明,转多抗基因均不同程度地提高水分胁迫条件下新疆大叶苜蓿的光合性能,其中转codA基因株系可维持较高光合速率,转IbOr基因株系能维持较高光能利用能力,转AtABF3基因株系能够高效利用水分,转AtNDPK2基因株系总生物量最高。     

日本百脉根LjbHLH34基因克隆及耐旱功能鉴定

干旱是影响植物生长发育的重要环境因素。本研究分析了日本百脉根抗旱相关基因LjbHLH34的耐旱功能，初步解析其响应干旱胁迫的分子机制，以期为百脉根抗旱分子育种提供理论基础。本研究克隆得到的LjbHLH34基因大小为711 bp、编码236个氨基酸，属bHLH转录因子家族成员。系统进化树分析显示，LjbHLH34蛋白与拟南芥bHLHⅣ亚家族中AtbHLH34和AtbHLH104亲缘关系较近。实时荧光定量分析表明LjbHLH34在日本百脉根的根中表达量最高，叶中次之，茎中最少，暗示其在日本百脉根多个组织中发挥作用；同时LjbHLH34基因也受聚乙二醇(PEG)和脱落酸(ABA)诱导表达。在酵母中检测发现LjbHLH34具有转录激活活性；亚细胞定位试验表明LjbHLH34蛋白定位于细胞核中。将LjbHLH34基因转入拟南芥获得过表达株系。在200 mmol·L^-1甘露醇胁迫下，LjbHLH34转基因拟南芥的根长明显长于野生型。干旱处理后，野生型拟南芥比转基因拟南芥萎蔫程度更加明显，而转基因株系的相对含水量和超氧化物歧化酶(SOD)活性显著高于野生型，丙二醛(MDA)积累...     

紫花苜蓿MsCCD4基因克隆及耐盐功能鉴定

为验证紫花苜蓿(Medicago sativa L.)胡萝卜素裂解双加氧酶(Carotenoid cleavage dioxygenase, CCD)基因的耐盐功能,本试验克隆了紫花苜蓿MsCCD4的CDS全长序列,并以其叶片为试验材料,通过发根农杆菌介导的毛状根诱导法获得过表达MsCCD4的转基因毛状根,验证过表达MsCCD4对紫花苜蓿耐盐性的影响。结果表明：MsCCD4为稳定的酸性亲水蛋白质,二级结构以无规则卷曲为主,C-端含有RPE65保守结构域;MsCCD4启动子区含有光响应、激素应答和非生物胁迫响应结合元件;盐胁迫可诱导MsCCD4表达量升高;盐胁迫生理实验证明,过表达MsCCD4可以增强毛状根的耐盐性。本研究为紫花苜蓿耐盐遗传改良提供基因资源及耐盐基因快速鉴定方法。