不同毛色巴什拜羊皮肤组织中LEF1、YWHAZ及WNT2基因差异表达

【目的】研究LEF1、YWHAZ及WNT2基因表达量与毛色之间的关系,为分析LEF1、YWHAZ及WNT2基因在Wnt/β-actenin信号通路中的分子机制奠定基础。【方法】采用随机选取黑色和白色被毛的巴什拜羊各8只,采集皮肤组织,通过定量反转录聚合酶连锁反应(qRT-PCR)方法测定LEF1、WNT2及YWHAZ基因在不同毛色巴什拜羊皮肤中的表达量,并与LEF1、YWHAZ及WNT2基因转录组测序结果的FPKM值进行双向验证。【结果】LEF1基因在黑色巴什拜羊皮肤组织相对表达量是(4.66±0.59),在白色巴什拜羊皮肤组织是 (0.43±0.15);WNT2基因在黑色巴什拜羊组织相对表达量是(7.35±0.77),在白色巴什拜羊皮肤组织是(0.36±0.11);YWHAZ基因在黑色巴什拜羊组织相对表达量是 (4.44±0.57),在白色巴什拜羊皮肤组织是(1.02±0.23)。LEF1、YWHAZ及WNT2基因的转录组数据的FPKM值与qRT-PCR结果趋势一致。【结论】LEF1、WNT2及YWHAZ基因在不同毛色的巴什拜羊皮肤组织中均有表达。且LEF1、WNT2及YWHAZ基因在黑色绵羊皮肤中的表达量极显著高于白色绵羊皮肤(P<0.01),LEF1、WNT2及YWHAZ参与毛色的形成过程,可作为绵羊毛色潜在基因研究与毛色之间的相关性。     

牦牛和犏牛睾丸组织DDX4基因mRNA表达水平 与启动子区甲基化

【目的】了解牦牛和犏牛睾丸组织中DDX4基因mRNA表达水平和启动子区甲基化状态。【方法】采用real-time PCR技术检测牦牛和犏牛睾丸组织DDX4基因mRNA表达水平,采用克隆测序技术获得牦牛和犏牛DDX4基因启动子区序列,采用亚硫酸氢钠测序法检测牦牛和犏牛睾丸组织中DDX4基因启动子区甲基化状态。【结果】牦牛睾丸组织中DDX4基因mRNA表达水平极显著高于犏牛（P＜0.01）;牦牛和犏牛DDX4基因启动子区1 370 bp,含有核心启动子区（251 bp）和CpG岛（918 bp）。犏牛睾丸组织中DDX4基因启动子区甲基化水平（86.5%）极显著高于牦牛（67.0%）（P＜0.01）。【结论】牦牛睾丸组织DDX4基因表达水平极显著高于犏牛,获得了牦牛和犏牛DDX4基因启动子区序列,且犏牛睾丸组织中DDX4基因启动子区甲基化水平极显著高于牦牛（P＜0.01）。     

新疆巴什拜羊不同毛色与有关基因多态性分析

【目的】以不同毛色(红棕色73只,黑色53只,青灰色40只)新疆巴什拜羊为研究对象,采用PCR-SSCP技术检测ASIP、TYR、TYRP1和TYRP2基因多态性,并分析其与被毛表型的相关性。【方法】采用随机抽样的方法选取出三种毛色的巴什拜羊,用枸橼酸钠抗凝管进行采血。运用软件PIC-CALC和POPGENE 32计算巴什拜羊ASIP、TYR、TYRP1和TYRP2基因的多态信息含量和基因型频率、等位基因频率、纯合度、杂合度、有效等位基因数,并对该位点基因型的分布进行Hardy-Weinberg平衡的卡方检验。将所得数据输入Excel表中进行整理,并用SPSS 19.0软件进行差异性分析。【结果】ASIP基因在不同毛色的巴什拜羊群体中有两种基因型分别为AA型和AB型,等位基因B为红色被毛群体中的优势等位基因;等位基因A为黑色和青灰色两种被毛群体中的优势等位基因。处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05),红色被毛多态信息含量处于中度多态,而黑色和青灰色被毛多态信息含量处于低度多态。TYR基因在不同毛色的巴什拜羊群体中有两种基因型分别为AA型、AG型和GG型,等位基因G为3种毛色的优势等位基因TYR基因在巴什拜羊黑色和青色被毛群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05),而红色被毛群体中处于不平衡状态(P<0.05)。TYRP1基因存在两种基因型:AA型和GG型,等位基因A为红色和青灰色两种毛色的优势等位基因;等位基因G为黑色被毛群体的优势等位基因。TYRP1基因在巴什拜羊群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态。红色被毛多态信息含量处于高度多态,黑色和青灰色被毛多态信息含量处于低度多态。TYRP2基因PCR-SSCP检测结果没有显示多态。【结论】ASIP、TYR、TYRP1和TYRP2基因多态性与巴什拜羊的毛色性状有相关性。     

苏博美利奴羊胚胎期WNT2基因的组织表达及其生物信息学预测分析

【目的】检测WNT2基因在苏博美利奴羊胚胎期135 d不同组织中的表达水平,了解WNT2基因的分子结构和进化特征,从分子水平及进化特征上研究苏博美利奴羊的组织器官与WNT2基因表达之间的内在联系,为筛选细毛羊毛囊发育相关候选基因提供理论依据。【方法】采用qRT-PCR法研究苏博美利奴羊毛囊成熟时期WNT2基因在不同组织中的表达,并使用PROMO软件预测WNT2基因启动子区域序列的转录因子,并用Cytoscape_v3.5.1软件可视化,使用MEGA 7.0软件分析WNT2基因启动子区域序列的核苷酸组成成分及密码子的偏好性,并且利用绵羊、山羊、牛、人等9个物种的WNT2基因的DNA序列构建系统进化树。【结果】WNT2基因在皮肤组织中的表达量极显著高于心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及肌肉组织。在绵羊WNT2基因启动子区域序列共预测出101个相关转录因子,4种碱基呈现均匀分布,CAG与UCU是使用相对较多的密码子,对WNT2基因的DNA序列系统进化树分析发现山羊和绵羊之间的进化关系比与其他哺乳动物进行比较时更为接近。【结论】建立了胚胎期135 d的苏博美利奴羊的不同组织中WNT2基因表达量的RT-PCR方法,并使用生物信息学软件对其分子结构和进化特征进行分析。     

哈萨克羊MSTN基因的DNA甲基化分析

【目的】研究肌肉和脂肪组织中MSTN基因(生长抑素)的DNA甲基化水平,为改良哈萨克羊品种的选育提供遗传科学依据。【方法】基于亚硫酸氢盐的方法,测序哈萨克绵羊MSTN基因在CpG二核苷酸中的DNA甲基化水平。【结论】6月龄哈萨克羊肌肉MSTN基因DNA甲基化低,脂肪组织DNA甲基化程度最高,股二头肌,股三头肌,半膜肌,半腱肌,背最长肌和脂肪组织的MSTN基因的DNA甲基化概率分别为34.7％,22.6％,23.3％,28％,42.6％和76.7％。【结论】哈萨克羊各组织MSTN基因DNA的甲基化概率没有显著差异。脂肪组织MSTN基因DNA甲基化的最高,肌肉组织MSTN基因的DNA甲基化的概率较低。脂肪的甲基化概率是背最长肌,股二头肌,股三头肌,半腱肌,半膜肌的甲基化概率分别为:1.8倍,2.2倍,3.39倍,2.74倍,3.29倍。其次甲基化从高到低的依次为:脂肪组织>背最长肌>股二头肌>半腱肌>半膜肌>股三头肌。     

Hoxc13基因在苏博美利奴羊胎羔生长发育期不同组织中的表达分析

【目的】分析苏博美利奴羊不同组织中Hoxc13基因mRNA的表达量差异,为分子标记辅助育种以及,研究细毛羊主要经济性状,奠定理论基础。【方法】使用RT-PCR技术检测Hoxc13基因在苏博美利奴羊65和135 d皮肤、肌肉和不同内脏组织(心脏、脾脏、肝脏、肺脏、肾脏)中mRNA的表达量,并采用相对定量法对其表达量进行统计分析。【结果】在苏博美利奴羊皮肤、肌肉和不同内脏组织中均有Hoxc13基因的表达,并且在皮肤中的表达量显著高于其它组织(P<0.05),毛囊的形成和毛发生长与Hoxc13基因密切相关。【结论】建立了胎龄分别在65和135 d的苏博美利奴羊,其不同组织中适于定量检测的Hoxc13基因表达量的RT-PCR方法,从分子水平探讨了苏博美利奴羊的组织器官与Hoxc13基因表达之间的内在联系。     

巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中miR-486靶基因的研究

【目的】为了深入挖掘巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中miR-486的靶基因,为最终阐明巴什拜羊优良肉质性状形成的分子调控机制奠定基础,同时为巴什拜羊的持续选育提供理论依据。【方法】分别采集了巴什拜羊胎儿期40,50,60,80,100和120 d,以及出生当天,出生后30,60和90 d共计10个不同发育阶段的骨骼肌组织,分别利用胎儿期6个阶段的混合mRNA和出生后4个阶段的混合mRNA构建了胎儿期和出生后骨骼肌中miR-486调控靶基因的cDNA文库,并利用高通量测序技术对cDNA文库中的靶基因信息进行了深入挖掘。在对所得候选靶基因功能分析的基础上,选择10个候选靶基因,使用qRT-PCR检测其在巴什拜羊上述10个不同发育阶段骨骼肌中表达量的变化,结合课题组前期获得的miR-486在巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中的表达规律,对其靶向调控关系及生物学功能进行初步验证和分析。进而选择其中的4个候选靶基因使用荧光素酶报告载体试验和巴什拜羊骨骼肌卫星细胞中的靶向调控试验最终确认其靶向调控关系。【结果】通过对两个cDNA文库高通量测序数据的分析,胎儿期和出生后分别获得了123个和118个miR-486的靶基因,因其靶向调控关系未经实验验证,故暂称为候选靶基因。其中有96个为两个阶段共表达的候选靶基因,其余27个和22个分别为胎儿期和出生后骨骼肌中特异表达的候选靶基因。GO和KEGG分析结果表明所得候选靶基因显著富集于与肌肉分化和肌纤维发育相关的代谢和信号转导通路,诸如PI3k-Akt、MAPK、Wnt、Adherens junction和Regulation of actin cytoskeleton等。qRT-PCR检测结果表明所选10个候选靶基因在不同发育阶段巴什拜羊骨骼肌中均有表达,但其表达变化规律有所不同。PTEN、Foxo1、Dock3、PAX7、IGF1R、PIK3I1和FBN1在胎儿期巴什拜羊骨骼肌中呈高表达,出生后其表达量显著下调,而OLFM4的表达量则呈相反的变化趋势,ARHGAP5和PDCD4在胎儿期和出生后巴什拜羊骨骼肌中的表达量未见显著变化。对其中4个候选靶基因的进一步试验验证,双荧光素酶报告载体试验结果表明,miR-486可以高效结合在其候选靶基因PTEN、Foxo1、IGF1R和PIK3R1的靶位点上,进而极显著抑制其后萤火虫荧光素酶的活性;巴什拜羊骨骼肌卫星细胞中的靶向调控试验结果亦表明miR-486可以显著下调上述4个候选靶基因的mRNA水平,抑制其生物学功能。所以可以确证在巴什拜羊骨骼肌中miR-486可以靶向调控PTEN、Foxo1、IGF1R和PIK3R1的表达。【结论】对巴什拜羊不同发育阶段骨骼肌中miR-486的靶基因进行了深入挖掘,全面解析了miR-486及其靶基因在巴什拜羊骨骼肌发育过程中参与的生物学过程和信号通路,所得候选靶基因数据可靠性高,可为阐明巴什拜羊优良肉质性状的分子调控机制奠定基础。     

b-Boule基因5′调控序列的克隆与睾丸组织DMR甲基化分析

【目的】研究b-Boule基因5′调控序列的序列特征,以及牦牛、黄牛与犏牛睾丸组织b-Boule基因DMR甲基化状态的差异,为揭示b-Boule基因的表达调控和犏牛雄性不育的表观遗传机制提供依据。【方法】采用PCR扩增和克隆测序技术获得牦牛b-Boule基因5′调控序列,利用生物信息学方法分析b-Boule基因5′调控序列的序列特征,采用亚硫酸氢钠测序法检测牦牛、黄牛与犏牛睾丸组织中b-Boule基因DMR的甲基化状态。【结果】b-Boule基因5′调控序列长度为1 352 bp,核心启动子区含有SP1等甲基化敏感位点,5′端存在一个CpG岛。犏牛b-Boule基因DMR的甲基化水平(17.78%)高于牦牛(7.50%)和黄牛(6.94%)(P<0.01),特别是CpG位点33—35的甲基化水平差异更明显。【结论】犏牛b-Boule基因DMR的甲基化水平高于牦牛和黄牛,结合前期mRNA表达水平和组织学观察结果,认为DMR甲基化在b-Boule基因的表达调控中发挥关键作用,犏牛b-Boule基因可能是通过DMR区的高甲基化抑制其mRNA表达来阻滞精子发生减数分裂过程。     

酪氨酸酶在不同被毛颜色羊驼皮肤组织中的表达与定位

【目的】研究酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)在不同毛色羊驼皮肤组织中的表达与定位,为揭示羊驼被毛颜色形成的机制奠定基础。【方法】采用半定量RT-PCR方法检测TYR mRNA在不同毛色羊驼皮肤组织中的相对表达量,采用免疫组织化学技术对TYR在羊驼皮肤中的表达进行定位。【结果】不同毛色羊驼皮肤组织中均有TYR基因mRNA的表达,有色被毛皮肤组织中TYR的基因mRNA表达量显著高于白色被毛组织的表达量;在有色被毛皮肤组织中,TYR阳性反应区主要集中于毛球部位,即毛根成形部;而白色被毛组织中,TYR阳性反应区主要位于毛根壶腹部及膨大部,即毛根永久部。【结论】综合分析TYR基因mRNA表达量及蛋白定位结果可知,TYR是成熟黑色素细胞的标记分子之一,羊驼毛色形成取决于成熟黑色素细胞在毛囊组织中的相对数量及分布部位。     

苹果MdROS1结合MdFLS启动子促进低温诱导的黄酮醇积累

【目的】为探究DNA去甲基化基因MdROS1与苹果叶片黄酮醇积累的关系。【方法】以苹果品种‘嘎啦’组培苗叶片为试材,进行16℃低温处理7 d后,提取叶片中总RNA并反转录合成cDNA;通过实时荧光定量PCR检测处理叶片中黄酮醇合成关键基因MdFLS和DNA去甲基化基因MdROS1的表达水平,并通过高效液相色谱法测定处理叶片中黄酮醇含量,并进行相关性分析。进一步通过酵母单杂交和生物膜层干涉技术测定MdROS1与MdFLS启动子结合情况。【结果】低温能够促进苹果植物叶片黄酮醇积累和MdROS1及MdFLS基因的表达,MdROS1能够结合MdFLS基因的启动子。【结论】低温条件下,DNA去甲基化基因MdROS1可能通过结合MdFLS启动子促进其表达,从而促进黄酮醇积累,参与苹果植物对低温的响应。     

巴什拜羊瘦肉型新品系的培育及其生产性能分析

[目的]培育瘦肉型巴什拜羊新品系.[方法]纯巴什拜羊及其野生盘羊杂交培育的瘦肉型巴什拜羊新品系21的产肉性能数量性状指标、不同饲养季节的肉成分;同时,对体型外貌的遗传变异也进行了测量对比.[结果]两者在产肉性能上相差不大,但小尾型巴什拜羊新品系总脂肪比纯巴什拜羊减少3 910 g,瘦肉增加1 500 g,大腿肌厚和腰肌厚度各增厚0.5 cm,背部脂肪层减薄1 cm,腰部脂肪层减薄1.5 cm,脂臀减少85.3;,瘦肉增加14.2;,不同季节肉成分中总蛋白含量变化不大,但总脂肪和胆固醇含量变化幅度较大.[结论]新品系的体型野生基因占优势,毛质和毛色巴什拜羊占优势.     

中国美利奴超细型与哈萨克羊毛囊兴盛期皮肤组织消减cDNA文库的构建

【目的】筛选影响绵羊羊毛性状的重要候选基因,为研究羊毛性状形成的分子机制奠定基础。【方法】利用抑制性消减杂交技术构建中国美利奴超细型和哈萨克羊兴盛期皮肤组织间正、反向消减cDNA文库,并对差异基因进行测序和生物信息学分析;应用半定量RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR对部分差异基因进行鉴定。【结果】①从所构建绵羊皮肤组织的正、反向消减cDNA文库中分别获得153和143个ESTs,其中分别包括5和4个未知功能的ESTs,推测可能是新基因;对部分已知功能ESTs进行了GO聚类分析、通路分析和蛋白互作分析,结果显示粗、细毛羊之间存在一定差异;②文库中的3个差异基因KRTAP8-2、Trichohyalin和KRTAP3-2均能在皮肤中特异性地高表达,其中KRTAP8-2和Trichohyalin基因在中国美利奴超细型羊皮肤组织中的表达丰度分别是哈萨克羊的3.45和2.07倍,而KRTAP3-2基因在哈萨克羊皮肤组织表达丰度是中国美利奴超细型羊的1.87倍。【结论】成功构建了中国美利奴超细型和哈萨克羊皮肤组织间抑制性消减cDNA文库,初步筛选出一批可能影响羊毛性状的差异表达ESTs。     

新疆红肉苹果果实性状及MYB10启动子基因型鉴定分析

【目的】 分析新疆红肉苹果(Malus sieversii f. Neidzwetzkyana (Dieck) Langenf.)的果实特性及MYB10基因的启动子类型,为研究新疆的红肉基因类型及红肉苹果资源的利用研究奠定基础。【方法】 测定果实单果重、纵径、横径等性状指标并观察果肉颜色,设计引物,利用PCR克隆的方法,进行启动子类型检测。【结果】 果肉颜色多为淡红色,丝状或片状分布,HX-1为血红色果肉全红,单果重变异系数较大,最大单果重为124.57 g,果形指数最大值1.01,最小值0.82;可溶性固形物最大值17.36,最小值10.66;果梗粗最大值2.50 mm,最小值1.02 mm;果梗长度最大值34.36 mm,最小值13.48 mm;MYB10启动子类型全部为R₆R₁型。【结论】 29份资源的果实性状的遗传多样性较为丰富,果肉的呈色各有特点,但MYB10启动子类型全部一致为R6R₁型。