利用Target SSR-seq技术鉴定温州蜜柑芽变材料

【目的】柑橘芽极易发生变异,用形态学的方法鉴定这些芽变材料,易受环境、栽培条件等因素影响,而利用深度测序技术开展柑橘芽变材料鉴定,能够获得变异位点的基因型;同时,建立的技术体系也有利于柑橘资源的精准鉴定、种质资源的遗传多样性研究和植物性品种权保护。【方法】本研究通过靶位点SSR测序技术对柑橘芽变材料开展鉴定。首先利用柑橘全基因组序列扫描发掘SSR,采用多态性较高的SSR位点用于柑橘芽变材料的区分,进一步利用多路复用PCR扩增构建SSR靶位点文库,并通过MiSeq深度测序方法对2份温州蜜柑芽变材料的SSR靶位点进行测序验证。再利用开发的SSR标记对22份优质柑橘种质资源进行遗传多样性分析。【结果】利用GMATA软件在克里曼丁红橘(Citrus clementina Hort. ex. Tanaka)参考基因组和温州蜜柑(Citrus unshiu Macf.)基因组中分别获得69 101个和80 193个SSR,其中以AT/TA为主的2基序SSR最多,3基序中以AAT最多,通过序列比对发掘出变异热点区域的高多态性SSR用于温州蜜柑芽变材料的检测,4对SSR引物能对22份柑橘材料进行准确区...     

利用基因工程改良柑橘砧木种质的研究综述

概述了当前国内外基因工程技术在柑橘砧木种质改良工作中的研究现状与进展,基因工程在柑橘育种中的应用主要有农杆菌介导法、附体腋芽转化—离体扩繁鉴定法、DNA直接导入法等,并在培育新型抗性柑橘砧木品种上取得了一定的成果,建立了有效的基因转化体系,也获得了一批转基因植株。目前,随着生物技术的不断发展及基因工程技术的日趋成熟,基因工程在柑橘砧木资源多样性研究与种质改良方面仍将是今后的主攻方向。     

60份马铃薯种质资源评价

为了拓宽"雨养农业区(天水)"马铃薯育种的遗传基础和筛选适宜该地区种植的马铃薯品种(系),丰富育种亲本材料的遗传多样性,对引自全国各马铃薯育种单位的60份马铃薯种质资源进行熟性、抗病性、商品属性、产量等综合农艺性状的田间鉴定与评价。筛选出抗病毒病和晚疫病性能较强的材料11份为云薯107、云薯606、丽薯6号、云薯605、云薯202、LT-1、kw-45、kw-11、讷薯16、1-1和五龙;高产、商品薯率较好的材料5份为云薯507-653、云薯505-337、丽薯7号、LT-1及青薯9号。     

福州地区柑橘种质资源的ISSR分析

研究利用ISSR(inter-simple sequence repeat)分子标记技术对21份福州地区柑橘种质资源进行遗传多样性分析,以期为福州地区柑橘的品种鉴定及育种提供理论依据和技术支持。试验从27条ISSR引物中筛选出多态性好、条带清晰的14条引物,对供试材料进行遗传多态性分析。获得162条总条带,其中多态性条带129条,多态位点百分率为79.63%;聚类结果显示21份资源可分为5个组,13份福橘被聚为同一组,进而可划分为4个亚组。ISSR标记能较好地区分福州地区柑橘资源,且福州柑橘地方资源遗传多样性丰富。     

RAPD标记对25份柑桔资源及其芽变系的鉴定和多样性分析

 利用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术,对几份柑橘资源及其芽变系共计25份材料进行了鉴定和遗传多样性分析,从70个引物中筛选出多态性好的10个引物组成单引物和双引物对基因组进行扩增,共扩增出142条谱带,其中多态带72条,共同带70条,平均每个单引物出现多态带6.8条,每对双引物出现多态带1.3条。利用UPGMA法分析发现,这些基因型间的遗传相似系数在0.834～0.966之间,在此基础上,构建了各基因型的遗传关系树状图。结果表明RAPD标记可以准确鉴定出各柑橘资源及其芽变系,这25份柑橘资源代表了25个基因型。较高的遗传相似系数揭示了柑橘资源间狭窄的遗传背景。     

现代分子标记技术及其在柑橘种质资源研究中应用

快速发展的分子标记技术在柑橘种质资源研究与育种实践中得到了广泛应用.本文简要阐述了分子标记的主要类型、原理、特点及其在柑橘种质资源方面的研究,并对当前分子标记存在的问题及以后的发展前景进行了分析.     

利用SSR和SRAP技术分析广西柑橘种质遗传多样性

利用SSR和SRAP 2种分子标记技术对11份广西野生柑橘种质、13份广西地方品种和10份对照品种,共计34份柑橘类材料进行遗传多样性分析,结果表明:选用22对SSR和11对SRAP引物组合进行PCR扩增,依次获得221和215条多态性条带,平均每对引物获得10.1和19.5条多态性条带;SSR聚类图显示34份柑橘种质两两之间的遗传相似系数为0.78~0.96,SRAP聚类显示遗传相似系数为0.60~0.92;2种分子标记基本上能有效地区分宽皮柑橘类、枸橼类、柚类、大翼橙类、宜昌橙类和马蜂柑;同时,广西地区宽皮柑橘类与道县野橘、皱皮柑类与元橘、印度野橘与枸橼类的尤力克柠檬、大种橙与大翼橙类和阳朔金柑、柚类与大翼橙类亲缘关系紧密。     

柑橘

柑橘钙结合蛋白基因的克隆及其在果皮褐变中的表达分析／高雪,／生物技术通报（北京）,2011．06高效氯氰菊酯在柑橘和土壤中的残留消解动态／王彦辉,／农药（沈阳）,2011．06柑橘黄龙病与柑橘木虱在我国发生北界调查／熊红利／／植物检疫dE京）,2011．04柑橘粉虱对不同柑橘品种的选择性／万珊∥湖北农业科学俄汉）,2011．11柑橘小实蝇的识别与防治研究／向飞,／宁夏农林科技（银川）,20l1．06     

柑橘

柑橘钙结合蛋白基因的克隆及其在果皮褐变中的表达分析／高雪,／生物技术通报（北京）,2011．06高效氯氰菊酯在柑橘和土壤中的残留消解动态／王彦辉,／农药（沈阳）,2011．06柑橘黄龙病与柑橘木虱在我国发生北界调查／熊红利／／植物检疫dE京）,2011．04柑橘粉虱对不同柑橘品种的选择性／万珊∥湖北农业科学俄汉）,2011．11柑橘小实蝇的识别与防治研究／向飞,／宁夏农林科技（银川）,20l1．06     

利用GBS技术研究240份宽皮柑橘的系统演化

【目的】GBS(genotyping-by-sequencing)是一种高效而经济的SNP(单核苷酸多态性)发掘和基因分型技术。采用GBS技术对240份宽皮柑橘进行基因分型,以阐明一些野生宽皮柑橘和地方品种的遗传背景,为其起源和演化研究提供更可靠的证据。【方法】选用国家柑橘种质重庆资源圃保存的具有广泛遗传多样性和地理起源的240份宽皮柑橘作为材料,利用Eco R I限制性内切酶消化基因组DNA后构建GBS文库;然后进行Illumina HiSeqPE150二代测序获得短读序列,通过BWA软件将序列映射到克里曼丁参考基因组上,再利用SAMTOOLS软件鉴定SNP位点。依据SNP的基因分型结果,采用邻近法构建系统演化树,并进行主成分分析。【结果】利用GBS简化基因组测序技术对240份宽皮柑橘进行测序,共获得96.3 Gb的测序数据,平均每个样本测序数据为401.26 Mb,经过测序深度为4X、Miss0.2、次要等位基因频率(MAF)0.01的筛选条件过滤,最后共获得了114 200个高质量的SNP位点。主成分分析结果显示240份宽皮柑橘被分为4大类,其中温州蜜柑亚群、野生宽皮柑橘亚群可明显区分于其他宽皮柑橘。利用系统演化树可将240份宽皮柑橘划分到11个类群中。系统演化树和主成分分析都揭示了不同地理来源和特定形态的宽皮柑橘在遗传水平上存在明显的差异,比如来源于日本的温州蜜柑、欧美的克里曼丁橘及其杂种后代,以及中国南方的野生宽皮柑橘由于地理分布不同而形成了较为独特的类型,彼此间能够相互区分开。进化树结果表明中国南、北不同地域的宽皮柑橘可能存在不同的演化路径,南岭山脉及南方地区的野生宽皮柑橘、酸橘和目前南方地区栽培的砂糖橘存在较近的起源演化联系,而北方宽皮柑橘的演化却与宽皮柑橘中的古老地方品种存在紧密联系。人工杂交育种、长期的人工选择和驯化形成了不同类型的宽皮柑橘,同时也导致宽皮柑橘遗传多样性的增加。另外,一些宽皮柑橘资源中的可疑亲本也通过GBS技术得以准确鉴定。本研究表明沃柑与金诺橘有较近的亲缘关系。【结论】GBS技术用于柑橘种质资源的基因分型高效可靠,建立的系统演化树可以对240份宽皮柑橘进行准确划分,与用植物形态学划分的结果高度吻合。另外,GBS技术用于资源材料的准确鉴定和亲缘关系的研究,可为柑橘植物新品种权的保护提供可靠的技术支撑。     

柑橘内生真菌的分离与鉴定

自2002—2004年,对广东梅州、重庆北碚、湖南石门的不同种类的柑橘（柑、橙、柚）进行了12次定点取样分离,共分离到柑橘内生真菌5642株,其中有5136株已鉴定,分别属于24个属,在这24个属中,出现频率在1％以上的只有Colletotrichum spp.,Fusarium spp.,Alternaria spp.,Penicillium spp..柑橘内生真菌的静息部位依种类而异,Colletrichum spp．主要分布在柑橘的叶片、枝条、果皮内;Fusarium spp．则主要分布在根中。     

农杆菌介导AFT基因转入四季桔的研究

以四季桔上胚轴为外植体,研究农杆菌介导转化过程中的影响因素.结果显示,转化研究所用抑菌剂抗菌素中,替门的汀杀菌效果较好,且对外植体出芽无明显抑制作用.转化芽选择初期,2～3 d的预培养及选择培养初期3～5 d的暗培养有利于卡那霉素抗性芽的发生.PCR扩增检测结果显示,AFT基因已转化至四季桔,转基因植株-4℃处理6d时,SOD酶与脯氨酸含量均高于对照.该试验建立了四季桔上胚轴遗传转化再生系统,其再生条件为:MT基本培养基附加TDZ0.5～1.0 mg/L,替门汀300 mg/L,卡那霉素100 mg/L;预培养时间为2～3 d,共培养后3～5 d的暗培养有利于转化率的提高.     

柑橘内生细菌的分离与鉴定

从湖南省石门县园艺场采集到的柑橘材料中,得到柑橘内生细菌分离物75份,经鉴定,分别属于气芽孢杆菌属(Aerobacillus sp.)、气单胞菌属(Aeromonas spp.)、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、黄单胞杆菌属(Xanthomonas spp.)、假单胞杆菌属(Pseudomonas spp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、乳杆菌属(Lactabacillus sp.).柑橘内生细菌在不同种类的柑橘及同一种类的不同器官中出现的频次不同.     

柑橘黄龙病的传播途径及鉴定方法

在生产中,柑橘类果树由于长期无性繁殖,往往感染1种或几种病毒、类病毒病害。柑橘黄龙病是一种毁灭性病害,大多数柑橘品种都易感病,主要发生在亚洲和非洲的40多个国家。全面认识柑橘黄龙病的传播途径及鉴定方法,对柑橘类果树生产具有重要的指导意义。     

用草本植物番茄鉴定五种柑橘类病毒

【目的】通过嫁接木本指示植物进行柑橘类病毒鉴定需要合适的季节和较长的显症时间,并且柑橘木本指示植物的遗传转化和基因功能验证体系尚不成熟,研究其与寄主间的互作较为困难。因此,寻找合适的草本鉴定和实验寄主对于更好地进行柑橘类病毒的鉴定及研究其与寄主间的互作具有重要意义。论文旨在明确中国报道的5种主要柑橘类病毒,包括柑橘裂皮类病毒（Citrus exocortis viroid,CEVd）、柑橘曲叶类病毒（Citrus bent leaf viroid,CBLVd）、啤酒花矮化类病毒（Hop stunt viroid, HSVd）、柑橘矮化类病毒（Citrus dwarfing viroid,CDVd）和柑橘树皮裂纹类病毒（Citrus bark cracking viroid,CBCVd）对番茄（Solanum lycopersicum）的侵染能力,进而明确其可否作为5种类病毒的鉴别寄主或实验寄主。【方法】将5种柑橘类病毒的野生型分子变种（分别为CEVd.188,长370 nt;CBLVd.032,长328 nt;HSVd.cit106,长296 nt;CVd-III.072,长295 nt;CVd IV Ca,长285 nt）二聚体cDNA克隆质粒（克隆于pGEM-T载体）,采用限制性内切酶Nde I在37℃条件下进行酶切线性化处理,经琼脂糖凝胶电泳分析鉴定酶切成功后,将该含有目标片段的线性化重组质粒采用T7 RNA多聚酶在37℃条件下进行体外转录,获得类病毒RNA二聚体溶解于1% K2HPO4接种缓冲液中,机械摩擦接种Alisa Craig和 Rutgers番茄（S. lycopersicum var. Alisa Craig和 var. Rutgers）叶片,置于24℃温室条件下培养。接种60 d后,采集新生叶片釆用CTAB法提取番茄叶片总RNA,通过RT-PCR对接种的类病毒进行检测。将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析后,切胶回收目标片段,与pMD18-T载体连接,热击转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。经PCR鉴定后挑取阳性克隆进行序列测定,采用DNAMAN version 6.0软件对获得的cDNA序列进行相似性分析。【结果】线性化质粒体外转录后经琼脂糖凝胶电泳分析显示,每个质粒转录产物均可检测到目标大小的RNA条带。接种后,RT-PCR检测显示5种类病毒侵染率表现出显著差异,CEVd、CDVd和HSVd可以侵染大部分接种植株（侵染率分别为7/8、5/8和7/8）。从接种成功的植株样品中对所接种类病毒后代的cDNA克隆和序列测定显示,随机测定的5-10个克隆中均能找到与接种类病毒cDNA一致的核苷酸序列,后代序列与接种序列间的相似性在99.7%以上;后代分子变异分析显示变异位点小于10个,变异率小于0.3%;而 CBLVd和CBCVd不能侵染或侵染率很低（0或1/8）。【结论】CEVd、CDVd和HSVd能够侵染Rutgers和Alisa Craig番茄,2种番茄均可以作为3种类病毒的草本鉴定和实验寄主;而 CBLVd和CBCVd 难于侵染Rutgers和Alisa Craig番茄。在接种的Alisa Craig番茄品种上,各类病毒接种植株均比接种缓冲液对照表现显著的矮化效果;在Rutgers植株上,仅有接种了CEVd的植株表现较对照的矮化效果。     

云南省柑桔根际短体线虫种类的鉴定

从采自云南省12个县市140个柑桔园的260份柑桔病根样本中分离鉴定出4种短体线虫属线虫:咖啡短体线虫(Pratylenchus coffeae),卢斯短体线虫(Pratylenchus loosi),穿刺短体线虫(Pratylenchus pene-trans)和伤残短体线虫(Pratylenchus vulnus)。其中咖啡短体线和伤残短体虫为优势种。     

‘春甜橘’及其突变体果皮差异相关蛋白质组分析

【目的】柑橘自然芽变材料是柑橘育种的重要来源。‘明柳甜橘’(Citrus reticuiata Blancocv.Mingliutianju,MP)是从‘春甜橘’(C.reticuiata Blanco cv.Chuntianju,CP)中选育出的自然芽变品种。分析‘春甜橘’与其自然芽变‘明柳甜橘’果皮差异蛋白质,探讨导致两品种形态差异的原因。【方法】以花后12周和23周的‘明柳甜橘’和‘春甜橘’果皮为材料,采用双向电泳技术(Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)分离获得野生型与突变型差异表达蛋白点,利用MALDI-TOF-MS质谱鉴定技术分析相关差异蛋白质,并进行功能注释和生物信息学分析。【结果】将提取的果皮总蛋白质经双向电泳后,分别采用硝酸银和考马斯亮蓝染色法进行蛋白质凝胶染色,均获得了清晰的2-DE电泳图。2-DE图谱经Image Master 2D软件分析表明,硝酸银染色法能检测到约1 200个蛋白点,考马斯亮蓝染色法能检测到约500个蛋白质点,从中各选取20个变化丰度2倍以上且重复性好的蛋白点进行MALDI-TOF-MS质谱鉴定和数据库检索分析,共有33个蛋白质有功能注释,其中17个蛋白质在‘明柳甜橘’果皮中表达上调,16个表达下调。按照33个差异蛋白质的功能,可将其分为11类,它们分别参与糖类/能量代谢、胁迫/防御反应、核酸代谢、氨基酸代谢、转录、氮代谢、脂肪酸代谢、蛋白修饰与降解以及未知类。利用KOBAS(KEGG Orthology-Based Annotation System)在线功能分析平台对33个差异表达蛋白质进行信号通路分析,其中18个差异蛋白质有KO注释,共涉及31条信号通路,按照P值大小排列,类黄酮生物合成过程位居第一,说明该信号通路最有可能参与春甜橘芽变形成过程。【结论】综合分析‘春甜橘’和‘明柳甜橘’基因水平及蛋白质水平的差异,推测可能是由参与类黄酮生物合成过程的差异表达基因尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶基因和差异表达蛋白咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶的差异表达导致了二者的表型差异。     

贵州新引进柑橘品种对炭疽病的抗性鉴定

为明确贵州新引进的14个柑橘品种对炭疽病的抗病能力,采用离体叶片法测定了其对柑橘炭疽病的抗病性。结果表明,14个参试柑橘品种在接种4d和5d后,抗病性存在差异。其中,天草在接种4d和5d后的病情指数分别为0和0.46,佛拉的病情指数分别为52.78、79.17,濑户佳的病情指数分别为1.85、2.78,若瓦的病情指数分别为4.63、9.26。2次的调查结果都说明天草的病情指数最小,抗病性最强,表现为免疫或高抗;佛拉的病情指数最大,抗病性最弱,表现为感病;濑户佳、若瓦均表现高抗。