嗜线虫致病杆菌YL001抑菌活性成分及其产量影响因素的研究

采用硅胶柱层析等分离方法,结合MS与NMR技术,对嗜线虫致病杆菌YL001发酵产物中的抑菌活性成分进行分离鉴定;采用微量稀释法对Nematophin的抑菌活性进行测定;利用HLPC分析不同因素对Nematophin产生的影响。结果表明,分离得到主要抑菌活性物质Nematophin,并鉴定其结构为3-吲哚乙基(3′-甲基-2′-酮)戊酰胺,其对革兰氏阳性菌具有较好的抑菌活性;不同菌株发酵产物中Nematophin的产量不同,其中YL001菌株的产量最高,为115.23μg/mL;Nematophin产量在初始pH 4.5~8.5逐渐升高,初始pH 8.5时最高,为155.08μg/mL。发酵罐培养条件下Nematophin的产量高于摇瓶,且在初始pH 8.5时达到最高,为206.97μg/mL。主要抑菌活性物质与文献报道的Nematophin相同,昆虫病原线虫共生菌次生代谢物的产生与菌种、菌株及培养条件密切相关。     

嗜线虫致病杆菌代谢物对马铃薯晚疫病菌的抑制作用

报道了嗜线虫致病杆菌发酵液对马铃薯晚疫病的平板抑制作用以及对离体叶片和盆载植株的防病效果。嗜线虫致病杆菌发酵液对致病疫霉菌丝生长有强烈的抑制作用 ,5 0～ 12mL·L-1发酵液能完全抑制疫霉菌丝的生长 ;10 0～ 5 0mL·L-1发酵液对离体马铃薯叶片晚疫病的发病和病害发展有较强的控制作用 ,其病害控制率分别达 10 0 %和 93.0 8% ;在盆载试验中 ,5 0mL·L-1的发酵液作为保护剂对晚疫病害控制率平均达 75 .9% ,与 2 0mL·L-1的 2 5 %甲霜灵效果差异不显著 (P =0 .0 5 ) ,作为治疗剂对病害的控制率达 5 2 .4% ,当低剂量的甲霜灵与发酵液混合时 ,其防病效果相当于二者单独使用的效果 ,说明发酵液与甲霜灵之间有增效作用。     

嗜线虫致病杆菌杀虫毒素对棉铃虫的中肠组织病理学研究

 嗜线虫致病杆菌HB310菌株与小卷蛾斯氏线虫HB310共生，对多种昆虫均具有较高生物活性。本实验通过盐析和非变性凝胶电泳等方法从嗜线虫致病杆菌HB310菌株的细胞内分离纯化出具胃毒活性的蛋白毒素Ⅱ。经毒素Ⅱ处理的棉铃虫幼虫，中肠组织的病理学变化类似于发光杆菌Tca毒素和Btδ-内毒素。棉铃虫4龄幼虫口服毒素Ⅱ 6 h后中肠组织开始发生变化：首先围食膜前端破碎，中肠柱状细胞伸长；随着时间推移，12 h后整个围食膜被破坏消失，中肠组织病变加重，肠壁细胞排列疏松混乱；随着毒素作用的逐渐减弱，处理72 h后棉铃虫中肠围食膜又重新出现。毒素Ⅱ离体处理棉铃虫围食膜，同样可以导致围食膜破碎。     

抗灰霉病解淀粉芽孢杆菌的发酵条件优化

【目的】研究灰霉病拮抗菌K1的发酵条件。【方法】以OD600值为指标采用响应面法对其发酵培养基、发酵条件进行优化。通过Plackett-Burman实验确定酵母膏、p H、接种量为其最显著的3个因素。经过BoxBehnken实验和响应面实验得到最优发酵条件。【结果】最优发酵培养基为:淀粉1%,酵母膏1.8%,硫酸钾1.5%。最优发酵条件:p H6.8,接种量为2.8%,温度25℃,转速130 r/min,装液量100 m L/250 m L。【结论】K1发酵16 h后的OD600值可达到1.490,远高于优化前0.864,明显提高了K1的生长速率。优化后发酵液抑菌直径为49mm,高于优化前的43 mm。     

嗜线虫致病杆菌北京变种的型变进程及抗生素相关性质的研究

嗜线虫致病杆菌是小卷蛾斯氏线虫体内的共生细菌,在实验室条件下延长培养将会出现型态变异,即从野生型的I型细胞变为II型细胞.对嗜线虫致病杆菌北京变种的型变进程进行了研究,结果发现,嗜线虫致病杆菌北京变种I型菌株在LB培养基中培养4d即有II型菌出现;培养10d后,II型菌的比例超过50%;培养到22d时,II型菌在整个NBTA平板中的比例几乎达到95%.然后分别以I型菌株和II型菌株为材料,对其产素能力和抗生素抗性水平进行了比较,结果显示,北京变种II型菌株对枯草芽孢杆菌的抑制水平降低到I型菌的10.08%;2种型态的菌株均对青霉素和氨苄青霉素具有抗性,其中I型菌株的耐受程度高于II型菌株,因此,嗜线虫致病杆菌北京变种2型细胞的产抗生素能力差异与抗生素抗性水平差异之间可能存在相关性.     

初始pH对嗜线虫致病杆菌YL001菌株抑菌活性及代谢的影响

【目的】研究初始培养pH对Xenorhabdus neamatophila YL001发酵液抑菌活性的影响,为进一步提高YL001的抑菌活性提供理论依据。【方法】采用生长速率法、琼脂扩散法、活体组织法,分别测定了初始pH 4.5,5.5,6.5,7.0,7.5和8.5培养条件下,X.neamatophila YL001发酵液及其乙酸乙酯提取物的抑菌活性;同时采用HPLC、LC-MS分析了乙酸乙酯提取物中代谢物的差异。【结果】随着初始pH的升高,共生菌发酵液及其乙酸乙酯提取物的抑菌活性也逐步提高。pH8.5时,YL001发酵液对水稻瘟疫病菌(Magnaporthe grisea)、辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、苹果轮纹病菌(Physalospora piricola)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、甘蓝黑斑病菌(Alternaria brassicae)以及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)均具有最强的抑制作用,发酵液乙酸乙酯提取物对番茄灰霉病的EC50为1.29mg/mL,对枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径为14.65mm。随着初始培养pH的升高,YL001发酵液及乙酸乙酯提取物对番茄灰霉病的治疗和保护作用也逐渐提高,保护作用明显优于治疗作用。HPLC和LC-MS代谢分析表明,pH8.5、pH 7.0及pH 4.5培养条件下发酵液乙酸乙酯提取物中代谢物含量存在显著差异。【结论】初始培养pH可以显著影响X.neamatophila YL001的抑菌活性及代谢能力,碱性条件更有利于活性物质的产生及其稳定性的保持。     

渗透压对嗜线虫致病杆菌YL001生长及抑菌活性的影响

【目的】研究渗透压对嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)YL001菌体生长、抑菌活性的影响,为进一步提高YL001抑菌活性及开发利用奠定基础。【方法】以NaCl为渗透压调节剂,分别测定其质量浓度为0,5,10,20,30和40g/L条件下,嗜线虫致病杆菌YL001不同时间段细胞生长量、pH、还原糖变化;采用琼脂扩散法、生长速率法及活体组织法测定了YL001发酵液的抑菌活性;同时采用HPLC及LC-MS分析了甲醇提取物中酰胺类化合物(Nematophin)与水溶性苯并芘类化合物(Xenocoumacins,包括XCN1和XCN2)含量差异。【结果】在NaCl质量浓度为0,5g/L时,YL001细胞生长最适且无显著差异,吸光值分别达0.63,0.62,随着NaCl质量浓度的进一步增大细胞生长量显著下降;在NaCl质量浓度为0,5,10g/L时,YL001发酵液对苏云金芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、猕猴桃溃疡病菌、金黄色葡萄球菌的抑菌作用较好且无显著差异,随着NaCl质量浓度的进一步增大抑菌作用显著降低;在NaCl质量浓度为0,5g/L时,YL001发酵液对水稻稻瘟病菌、番茄灰霉病菌、苹果树腐烂病菌、苹果轮纹病菌、苹果炭疽病菌、水稻纹枯病菌、油菜菌核病菌的抑制率均高于80%且均无显著差异,明显优于其他较高NaCl质量浓度的处理;在NaCl质量浓度为0,5,10g/L时,YL001发酵液对番茄灰霉病的治疗作用较好且无显著差异,在NaCl质量浓度为0,5g/L时,对番茄灰霉病的保护作用较好且无显著差异,治疗作用和保护作用均随着NaCl质量浓度的进一步增大而显著下降;甲醇提取物中抑菌活性物质Nematophin含量、XCN1的相对含量随NaCl质量浓度的增大显著下降,如NaCl质量浓度为0g/L时,甲醇提取物中抑菌活性物质Nematophin含量、XCN1的相对含量较NaCl质量浓度为40g/L时分别提高7.82和27.55倍;XCN2的相对含量在NaCl质量浓度为5g/L时最高,显著高于其他处理。【结论】低渗透压有利于X.nematophila YL001菌体生长、抑菌活性提高及抑菌活性代谢产物Nematophin、Xenocoumacins的产生。     

嗜线虫致病杆菌Sy1a菌株粗提液杀虫活性的研究

以桃蚜(Myzus persicae),豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum Harris)和白粉虱(Trialeurodes?vaporariorum)作为供试昆虫,对Sy1a菌株粗提液的杀虫活性和总蛋白酶活性进行测定。结果表明:桃蚜取食浓度分别为400、600、1 000μg/ml Sy1a菌株粗提液48 h后LC50值为987.7μg/ml,IC50值为5 941.2μg/ml;豌豆蚜取食浓度分别为250、500、1 000μg/ml Sy1a菌株粗提液36 h后,LC50值为227.2μg/ml,IC50值为508.3μg/ml;采用浓度为1 200.0μg/ml的Sy1a菌株粗提液处理后7、14和21 d的温室中白粉虱虫口减退率分别为51.6%、83.7%、89.1%,校正防效分别达到62.0%、88.7%、93.1%。研究结果表明:Sy1a菌株粗提液对桃蚜、豌豆蚜及白粉虱等害虫均有显著的防治效果,具有开发成为环境友好型生物农药的前景。     

昆虫病原线虫共生细菌嗜线虫杆菌和发光杆菌的型变

嗜线虫杆菌(Xenorhabdus spp.)和发光杆菌(Photorhabdus spp.)是与昆虫病原线虫互惠共生的细菌,Xenorhabdus和Photorhabdus的一个显著特点是在共生菌体外培养期间出现细胞的型变,其型变的发生在几个方面不同于传统的型变.本文就近年来有关共生菌型变的生物学、遗传学等方面的研究进行了概述.     

中国葡萄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性检测

【目的】检测中国葡萄灰霉病菌对苯胺基嘧啶类杀菌剂嘧霉胺的抗药性,明确中国不同葡萄产区灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性及抗性频率,为葡萄灰霉病的药剂防治提供理论基础。【方法】从中国葡萄主产区采集、分离纯化104个葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers.）的单孢菌株,采用菌丝生长速率法测定其对嘧霉胺的抗药性。【结果】中国葡萄灰霉病菌对嘧霉胺的抗性频率为22.22%—62.5%,且以高抗和中抗菌株为主,其中高抗菌株频率达44.23%;葡萄不同气候栽培区的灰霉病菌对嘧霉胺抗药性不同。【结论】中国葡萄灰霉病菌对嘧霉胺的抗药性较为普遍,且存在交互抗性,据此,在葡萄灰霉病的防治中应限制嘧霉胺的使用次数,可与二甲酰亚胺类、氨基甲酸酯类杀菌剂交替使用;引进防治葡萄灰霉病的新型杀菌剂或生物农药。     

番茄灰霉病菌拮抗基因工程菌株Fh-chib培养条件的研究

[目的]筛选番茄灰霉病菌拮抗基因工程菌株Fh-chib的最佳培养条件。[方法]在单因素试验的基础上,采用正交试验设计对番茄灰霉病菌拮抗菌株Fh-chib的最佳培养条件(碳源、氮源和无机盐)进行了研究。[结果]工程菌株Fh-chib的最佳培养基配方为0.50%葡萄糖、1.00%蔗糖、1.00%酵母膏、1.50%麸皮、1.00%黄豆饼粉、0.03%MgSO4和0.40%CaCl2。各个因素对发酵液抑菌活性影响的主次顺序为:葡萄糖>蔗糖>CaCl2>黄豆饼粉>酵母膏>麸皮>MgSO4。[结论]为该菌株的工业化生产奠定了基础。     

不同昆虫病原线虫共生细菌对草莓灰霉病菌的抑制作用

为了探明不同昆虫病原线虫共生细菌对草莓灰霉病菌的抑制效果,本研究测定了2株伯氏致病杆菌(Xenorhabdus bovieniiHJ4)和(X.bovienii HF22)及2株发光杆菌(Photorhabdus luminescens F30-4)和(Pho-torhabdus sp.S21)对灰霉(Botrytis cinerea)的抑菌活性。结果表明:4个菌株的培养液对灰霉病菌均有一定的抑制作用,稀释5倍的培养液对菌丝生长抑制率达70%~85%,稀释10倍的培养液抑菌效果仍达50%以上。其中HF22菌株效果最好,其稀释5倍的培养液抑菌效果可达84.92%;另外,滤液对灰霉病菌的孢子萌发也有一定的抑制作用,其中HJ4菌株效果最好,稀释5倍时达34.98%。HF22菌株的细胞10倍稀释液、滤液10倍稀释液的抑菌率分别为74.19%和18.92%,可见其抑菌物质主要存在于细胞中。用不同温度对HF22菌株的细胞、滤液进行处理,结果表明温度对其滤液抑菌活性无影响,而其细胞能耐50℃处理10 min,但在70℃处理10 min时,其抑菌活性显著下降;HF22菌株的滤液经20 W紫外灯照射0.51、h时,对其抑菌活性无显著影响,而细胞经紫外线照射0.5 h时其抑菌活性则显著降低。     

番茄灰霉病生防细菌BAB-1的鉴定及发酵条件的优化

菌株BAB-1是从土壤中分离出的对番茄灰霉病具有较好防治效果的拮抗细菌。通过对该菌株进行形态特征观察、16S rDNA序列分析和API 50CHB细菌鉴定试剂盒鉴定,确定菌株BAB 1为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。采用16种培养基对菌株BAB-1进行了发酵培养,结果表明,3号培养基最适合该菌株菌体生长和抑菌物质的产生。进一步进行了培养条件的优化,发现在培养温度30℃,转速210 rpm,初始pH 7.24,接种量3%,装样量为70 mL/250 mL时菌体生产量最高,菌量达到1.63×109 cfu/mL;而在培养温度30℃,转速210 rpm,初始pH 7.24,接种量2%,装样量为100 mL/250 mL时最适合抑菌物质的产生,对番茄灰霉病菌的抑菌圈直径达到1.81 cm。     

查尔酮合成酶基因在葡萄抗灰霉病和霜霉病中的作用

[目的]克隆不同抗性葡萄品种中查尔酮合成酶(chalcone synthase)基因CHS1,明确该基因在葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)和葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)侵染下的表达模式,并对CHS1进行亚细胞定位和功能验证,为探究CHS1的广谱抗病作用机理提供依据.[方法]分别...     

枯草芽孢杆菌对黄瓜灰霉病的防效评价

为了探究枯草芽孢杆菌对黄瓜灰霉病的抑制作用,采用室内抑菌试验和大田试验研究了枯草芽孢杆菌对黄瓜灰霉病菌的抑制作用及对黄瓜灰霉病的防治效果。对峙培养法测定表明,枯草芽孢杆菌YN-5对黄瓜灰霉病菌有明显的拮抗作用,对黄瓜灰霉病菌菌丝及孢子都有较强的抑制效果;盆栽试验表明,拮抗菌YN-5的抑病效果在50%以上。该菌株可作为黄瓜灰霉病生物防治的优良候选微生物资源,开发及应用前景广阔。     

啶酰菌胺和咯菌腈对番茄灰霉病菌不同菌株的毒力（初报）

为了明确啶酰菌胺和咯菌腈对番茄灰霉病菌不同菌株的毒力,采用菌丝生长速率法测定了从河北和山东采集的番茄灰霉病菌菌株对啶酰菌胺及咯菌腈的敏感性。结果表明：2008～2010年,从河北定州采集的番茄灰霉病菌对啶酰菌胺和咯菌腈的敏感性差异不显著;而2010年,从河北徐水采集的菌株对啶酰菌胺和咯菌腈的敏感性显著低于从河北定州和山东寿光采集的菌株,但啶酰菌胺和咯菌腈对所有菌株均有很强的抑制作用。啶酰菌胺和咯菌腈可替代生产中普遍发生抗药性问题的多菌灵、乙霉威、异菌脲和嘧霉胺防治番茄灰霉病的药剂。室内筛选药剂时,应选择不同菌株进行毒力测定,以提高筛选准确率。     

番茄灰霉病分子诊断方法研究

为提供番茄灰霉病的早期诊断技术,应用其病原菌灰葡萄孢种特异片段P729分子标志,建立了PCR检测方法,并进行了实验室和大田现场标本的评价。结果显示番茄灰霉病的分子诊断方法在实验室具有特异、稳定和可靠的特点。比较6种抽提基因组DNA的方法,方法B效果理想。应用建立的分子诊断方法可从0.2μg灰葡萄孢菌丝中获得阳性扩增,具有相当高的灵敏性;大田样本的检测结果说明该方法可用于番茄灰霉病的早期诊断。