P450基因在氯虫苯甲酰胺不同抗性品系小菜蛾中的表达及功能分析

【目的】以十字花科蔬菜害虫小菜蛾（Plutella xylostella）为研究对象,筛选参与小菜蛾代谢氯虫苯甲酰胺的主要细胞色素P450解毒基因,为阐明不同抗性水平小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性机理提供依据。【方法】利用叶片药膜法测定不同小菜蛾种群3龄幼虫对氯虫苯甲酰的抗性水平,通过转录组测序、insectbase数据库和小菜蛾基因组数据库筛选得到52个细胞色素P450基因。应用MEGA5.10软件对52个细胞色素P450基因进行进化分析,获得与抗药性密切相关的CYP3和CYP4家族P450基因。利用实时荧光定量PCR方法分析目的基因在小菜蛾室内筛选种群（HZY）和田间抗性种群惠州种群（HZ）、连州种群（LZ）、东升种群（DS）、钟落潭种群（ZLT）中的表达量,选用RNA干扰技术,采用注射法,验证在抗性种群中显著上调表达的CYP6BF1V4在小菜蛾抗氯虫苯甲酰胺中的功能。【结果】抗药性测定结果表明,LZ和HZ小菜蛾种群为中等水平抗性,ZLT、DS和HZY小菜蛾种群为高水平抗性。对52个细胞色素P450基因的系统发育树分析发现,小菜蛾拥有10个CYP4家族基因,28个CYP3家族基因,其中2个CYP4家族基因在HZ和HZY种群中的表达量显著高于敏感种群,4个CYP3家族基因表达量与小菜蛾抗性呈正相关,8个基因在中等水平抗性小菜蛾体内的表达量高于在高水平抗性小菜蛾体内的表达量。对田间种群进一步筛选得到6个与小菜蛾抗氯虫苯甲酰胺密切相关,在不同抗性种群中均上调表达的细胞色素P450基因,其中4个为CYP6家族基因（CYP6BF1V4、CYP6BF1V3、CYP6f1和CYP6B6）,2个为CYP9家族基因（CYP9G2.1和CYP9G2.2）,以CYP6BF1V4的表达量最高,其在抗性种群中的表达量是在敏感种群中表达量的3.5—6.3倍。RNA干扰结果显示,沉默CYP6BF1V4能够显著提高小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的敏感性。【结论】CYP6BF1V4、CYP6BF1V3、CYP6f1、CYP6B6、CYP9G2.1和CYP9G2.2可能在小菜蛾体内协同调控多功能氧化酶的表达,从而加快小菜蛾代谢氯虫苯甲酰胺的速度,提高小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗性。     

黄瓜基因组中抗霜霉病候选基因的生物信息学及其表达特异性

【目的】寻找黄瓜抗霜霉病基因,研究黄瓜抗霜霉病机制。【方法】利用拟南芥和甜瓜抗霜霉病蛋白质序列,搜索黄瓜基因组数据库;通过生物信息学分析候选基因特征,以黄瓜抗霜霉病自交系M801-3-1为试材,分析候选基因在叶片组织中的表达状态。【结果】共获得187个黄瓜抗霜霉病候选基因;确定了候选基因染色体位置和排列特点、序列相似性特征以及系统进化关系;大部分黄瓜R基因在未接种霜霉病菌的抗病自交系和感病叶片组织中都有一定的表达量,在接种霜霉病菌后在抗病自交系M801-3-1中Csa001907和Csa002921表达量下调,感病自交系M302-3 中Csa001907和Csa002921变化不明显。【结论】在黄瓜基因组中存在185个与拟南芥抗霜霉病基因同源的R基因,2个与甜瓜的抗霜霉病基因At1和At2同源的eR基因,通过聚类分析这些基因可以分为6类,初步认定Csa001907和Csa002921为黄瓜抗霜霉病的R基因,这2个基因在叶片组织中有一定表达量,其表达量减少可诱发抗病黄瓜品种的抗病反应。     

苦荞VQ基因家族的全基因组鉴定及其在叶斑病原与激素处理下的表达谱分析

【目的】VQ基因家族在植物生长、发育以及对生物或非生物胁迫反应中发挥重要功能。在全基因组尺度上,全面鉴定苦荞（Fagopyrum tataricum L. Gaertn.）VQ（FtVQ）基因家族,分析其在苦荞叶斑病原——互格链格孢（Alternaria alternata）和黑孢霉（Nigrospora osmanthi）侵染和防御相关激素——水杨酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯（ET）处理下的表达模式,为深入解析苦荞VQ基因家族在植物抗病防御中的功能及机理奠定基础,同时为优良基因资源发掘及抗病品种改良提供线索。【方法】基于VQ保守结构域的隐马尔可夫文件（PF05678）,采用HMMER 3.0对苦荞平苦一号基因组数据库进行比对搜索,鉴定VQ基因;通过DNAMAN、MapInspect、MEGA、MEME、OrthoFinder、PLACE等生物信息学工具分析基因结构、染色体分布、启动子顺式元件、蛋白质理化性质、蛋白质保守基序、蛋白质亚细胞定位和蛋白质系统进化关系;采用实时荧光定量PCR（qPCR）方法分析苦荞叶VQ基因在病原侵染或激素处理下的表达模式。【结果】从苦荞基因组中鉴定获得28个VQ基因,大小为566—1 454 bp,均无内含子,不均一地分布在8条染色体上。根据它们在染色体上的物理位置,命名为FtVQ1—FtVQ28。每一个FtVQ蛋白含有1个VQ基序——FxxxVQx（L/F/I/V/A/Y）TG（x代表任意氨基酸）。亚细胞定位预测表明,21个FtVQ蛋白定位在细胞核中,其余定位在叶绿体或细胞质中。根据蛋白质氨基酸序列与保守结构基序,FtVQ蛋白归类于5个亚家族,亚家族内基因结构和蛋白质基序相对保守。基因重复分析表明,苦荞基因组中有8对VQ旁系同源基因,均为大片段重复基因,提示大片段基因重复在FtVQ基因家族数量扩张中发挥主要作用;它们的非同义突变和同义突变的比值（Ka/Ks）均小于1,提示重复基因在进化中经历了纯化选择。启动子顺式元件预测表明,所有FtVQ基因启动子含有BIHD1OS、CGTCA、ERELEA4、W-box和类W-box等病原或SA、JA、ET反应元件,尤其在FtVQ10、FtVQ14、FtVQ15、FtVQ22、FtVQ23、FtVQ27的启动子区域密集程度更高。qPCR分析显示,在可检测的20个FtVQ基因中,有55%—70%的基因为病原或激素处理下的差异表达基因（DEGs）,其中72.7%—85.7%的DEGs的表达显著上调。【结论】苦荞基因组拥有28个VQ基因成员,部分VQ基因可能参与了苦荞对叶斑病原的抗性反应。     

基于图像分析的玉米抗拟轮枝镰孢穗腐病的QTL定位

【目的】玉米穗腐病是一种在全世界广泛发生且危害严重的真菌性病害,其中,拟轮枝镰孢引起的穗腐病（Fusarium ear rot,FER）在中国发生最为普遍。通过图像分析方法进行FER抗病QTL定位,并对前期通过病害评级方法定位的FER抗病QTL进行验证,探索一种新的玉米穗腐病的病害鉴定方法,为玉米穗腐病的遗传改良提供依据。【方法】利用高感FER的自交系（ZW18）分别与3个高抗自交系（承351、丹598和吉V203）构建F₂群体（F₂-C、F₂-D和F₂-J）和相应的F_2﹕3家系,通过图像分析的方法获得每个F_2﹕3家系的果穗病斑百分比,进而定位玉米FER抗病QTL。【结果】3个群体共定位到18个FER抗病QTL,其中,分别位于2.02—2.03 bins、4.06—4.07 bins和8.06 bin上的3个QTL（qRf2、qRf3和qRf4）可解释的表型变异率分别高达21.80%、25.80%和27.40%。F₂-J群体的qRf11与F₂-C群体的qRf1和F₂-D群体的qRf6在第1染色体均有重叠区间,可解释的表型变异率达到16.50%。来自F₂-D群体的qRf9与F₂-J群体的qRf16在第8染色体8.05 bin有重叠区间,且抗性基因均来源于抗性亲本。F₂-C群体的qRf3与F₂-J群体的qRf15在第4染色体4.06—4.07 bins有重叠区间。另外,与之前通过病害评级方法定位的结果相比,qRf1、qRf6和qRf11在1.06—1.07 bins与评级方法定位的抗病位点qRfer13重合,qRf3和qRf15在4.06—4.07 bins与评级方法定位的抗病位点qRfer3和qRfer17重叠,qRf7与qRfer6在2.04 bin的定位区间完全重合,qRf17与qRfer20在S2重复中定位到9.03—9.05 bins的重叠区间,且来源于相同的抗源。【结论】定位到18个FER抗性位点,其中,位于1.04—1.07 bins、4.06—4.07 bins和8.05 bin上的抗病位点在不同群体中均可以被检测到,位于2.04 bin和9.03—9.05 bins上的抗病位点用不同的检测方法可以被检测到,表明在这些区间可能存在FER的抗性位点。QTL的定位区间在不同群体中的重叠性在一定程度上验证了定位区间的真实性,不同方法之间定位到重叠区间,说明利用图像分析方法定位FER抗病QTL具有一定的准确性。     

大丽轮枝菌木糖苷酶基因的鉴定及基于HIGS技术的功能分析

【目的】 从大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）中鉴定木糖苷酶基因,研究其与大丽轮枝菌致病力的关系,为解析大丽轮枝菌致病分子机制提供理论依据,同时为制定更好的棉花黄萎病防治策略提供科学依据。【方法】 利用生物信息学方法从大丽轮枝菌基因组数据库中鉴定全部木糖苷酶基因,并对基因编码蛋白的结构域、基因的染色体定位及进化关系等进行分析。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测木糖苷酶基因在不同抗/感棉花品种根系分泌物培养0、6、12、24和48 h大丽轮枝菌中的表达量。利用寄主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing,HIGS）技术对木糖苷酶基因VdxyL3在大丽轮枝菌侵染过程中的功能进行初步分析。将VdxyL3的目标片段转化棉花,采用伤根法接种大丽轮枝菌Vd991,观察转化植株的表型,调查病情指数,同时利用qRT-PCR技术对植株中真菌生物量和VdxyL3的表达量进行检测。【结果】 利用生物信息学方法从大丽轮枝菌中查找出13个木糖苷酶基因（VdxyL1—VdxyL13）,其编码序列长度介于1 461—2 544 bp,蛋白质分子量介于38.78—90.97 kD,理论等电点介于4.67—5.89。结构域和进化树分析发现13个木糖苷酶基因中包括9个糖苷水解酶43家族成员、1个3家族成员和3个31家族成员。染色体定位分析发现13个基因分布在6条染色体上,未形成基因簇。qRT-PCR结果发现选取的6个基因均受到根系分泌物的诱导,在一种或多种根系分泌物中培养6 h或12 h后,表达量均明显升高,然后降低。其中VdxyL3受海岛棉根系分泌物诱导后表达量明显升高,表明该基因的表达明显受海岛棉根系分泌物的诱导。HIGS研究结果表明,接菌14 d和21 d后转化VdxyL3基因干扰片段的棉花发病明显较重,其病情指数（33.3和83.9）明显高于空载体对照（21.7和66.1）。qRT-PCR分析发现转化VdxyL3基因干扰片段的棉花植株茎中VdxyL3的表达量明显低于空载体对照,真菌生物量显著多于对照。【结论】 利用HIGS技术将VdxyL3基因沉默后,棉株的抗病性明显降低,表明VdxyL3在大丽轮枝菌致病及宿主-病原体互作过程中可能发挥着重要的作用。     

番茄ShARPC5抗白粉病功能分析

【目的】白粉病（powdery mildew）是番茄生产上的重要病害,严重影响番茄的产量。番茄基因组测序工作的完成为抗病基因挖掘提供了重要的信息资源。ARP2/3（actin-related protein 2 and 3）复合体是肌动蛋白微丝骨架动力学的主要调控因子,能够参与包括响应外界胁迫等多种细胞学过程。本研究通过对番茄ARPC5（actin-related protein C5）进行克隆和抗病功能验证,为番茄基因组信息完善、抗病机制解析和分子育种等方面打下基础。【方法】从番茄LA1777（Solanum habrochaites）cDNA中PCR扩增ShARPC5,使用DNAMAN 6.0进行多序列比对;MEGA 6.0构建系统发育树;应用在线工具ProtComp v. 9.0进行亚细胞定位预测。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）比较接种白粉菌（Oidium neolycopersici,On-Lz）后高感品种Moneymaker（MM）和高抗品种LA1777中番茄ARPC5的表达特征,分析白粉菌侵染与ARPC5表达的相关性。应用病毒诱导的基因沉默（virus-induced gene silencing,VIGS）技术进一步验证该基因在番茄中的抗病功能,观察沉默株和野生型株系接种后表型变化,利用台盼蓝和DAB染色法检测植株产生过敏性坏死和H₂O₂的能力,并检测ShARPC5沉默后一些与植物抗病相关标记基因的表达变化。采用农杆菌浸花法遗传转化拟南芥过表达ShARPC5植株,观察转基因和野生型株系接种后表型变化,并统计单病斑分生孢子数。【结果】从番茄品种LA1777中克隆到ShARPC5,编码132个氨基酸残基,包含一个保守的P16-Arc结构域。与番茄MM-白粉菌亲和互作相比,非亲和互作的番茄品种LA1777在接种白粉菌后,ShARPC5显著上调表达,尤其在接种后18 h。在番茄上沉默ShARPC5能够增加植株对白粉菌On-Lz的敏感性,防卫反应基因PR1b1显著下调表达。组织学观察显示与对照植株相比,ShARPC5沉默植株接种后诱导产生过敏性坏死和活性氧减少。在烟草上瞬时过表达ShARPC5能够诱导产生坏死斑。相反,在拟南芥上过表达ShARPC5能够增加植物的抗病性。【结论】ShARPC5是番茄响应白粉菌侵染的重要基因,可减轻番茄白粉病的发病程度,在番茄抗白粉病机理研究方面具有较大的应用价值,可作为番茄抗白粉病分子育种的一个候选基因。     

黄瓜幼苗下胚轴长度GWAS分析及候选基因挖掘

【目的】挖掘与黄瓜幼苗下胚轴长度显著相关的SNP位点及候选基因,为揭示下胚轴长度的遗传基础和分子机制提供理论依据,为短下胚轴分子标记辅助选择育种奠定基础。【方法】以95份黄瓜核心种质为试验材料,分别于2016年春季、2017年春季、2017年秋季和2018年春季在中国农业科学院南口试验基地塑料大棚进行种植,在两叶一心期调查黄瓜幼苗的下胚轴长度;利用Structure 2.3.4软件分析群体结构,Haploview 软件分析连锁不平衡的衰减;基于最优模型对下胚轴长度进行全基因组关联分析（GWAS）,依据关联SNP位点的LD区间序列,预测与下胚轴长度相关的重要关联候选基因,并利用荧光定量PCR对预测基因进行表达模式分析。【结果】共检测到8个显著关联的位点（Hl1.1、Hl1.2、Hl2.1、Hl3.1、Hl3.2、Hl4.1、Hl5.1、Hl6.1）,分别位于1、2、3、4、5、6号染色体,其中,Hl2.1、Hl3.1、Hl3.2、Hl5.1、Hl6.1等5个位点被重复检测到两次以上。通过分析关联SNP位点的LD区间序列,获得Csa1G074930、Csa1G475980、Csa2G381650、Csa3G141820、Csa4G051570、Csa3G627150、Csa5G174640、Csa6G362970 8个与黄瓜下胚轴长度有关的候选基因,其中既有光形态建成、泛素化、激素信号通路等调控基因,也有调控网络下游参与细胞生长发育,调节细胞大小,直接调控黄瓜下胚轴长度的基因。多基因在不同黄瓜材料中的有机分布,形成了具有不同下胚轴长度的黄瓜种质。基因表达分析显示Csa1G074930、Csa1G475980、Csa2G381650、Csa4G051570、Csa5G174640在短下胚轴材料中高表达。Csa3G141820、Csa3G627150在长下胚轴材料中高表达。【结论】检测到Hl1.1、Hl1.2、Hl2.1、Hl3.1、Hl3.2、Hl4.1、Hl5.1、Hl6.1等8个与黄瓜下胚轴长度密切关联的SNP位点,挖掘到Csa1G074930、Csa1G475980、Csa2G381650、Csa3G141820、Csa4G051570、Csa3G627150、Csa5G174640、Csa6G362970等8个调控下胚轴长度的候选基因。     

中国水稻主产区白叶枯病菌致病型分析及近等基因系鉴别寄主的构建

【目的】分析中国不同稻区白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）致病型,建立近等基因系鉴别寄主,为白叶枯病菌群体结构田间实时准确监测、抗性品种应用以及抗病育种提供科学依据。【方法】利用中国鉴别寄主、IR24以及15个抗白叶枯病近等基因系等共21个鉴别寄主,采用人工剪叶接种方法,对2018—2021年采自广东、广西、海南、浙江、湖南、辽宁、云南共7个省（自治区）的954个单菌落分离菌株进行致病型测定,探明白叶枯病菌致病型种类、分布及毒性分化;基于测试菌株与15个近等基因系及IR24的抗感互作,应用主成分因子分析法,开展近等基因系与病菌互作的变量因子分析,构建白叶枯病菌致病型近等基因系鉴别寄主;基于抗病基因与测试菌株的抗感反应,分析抗病基因聚合效应。【结果】954个测试菌株在中国鉴别寄主上鉴定出11个致病型,包括SRRRR（I）、SSRRR（Ⅱ）、SSSRR（Ⅲ）、SSSSR（Ⅳ）、SSRRS（V）、SRSRR（Ⅵ）、SSSSS（Ⅸ）、SSSRS（新型1）、SRSRS（新型2）、SRSSS（新型3）以及SSRSS（新型4）,占测试菌株的比率分别为11.53％、4.82％、7.34％、6.18％、7.23％、1.05%、59.96％、1.57%、0.10%、0.10%、0.10%。Ⅸ型菌作为致病性最广的强毒菌系已上升为华南和长江中下游湖南和浙江稻区的优势致病型,西南稻区的云南以Ⅳ型菌为主,东北稻区的辽宁以I型菌为主。15个水稻抗白叶枯病近等基因系对954个菌株的抗感性分析结果表明,测试的15个近等基因系可分为5种类型,第Ⅰ类为高感基因系,包括IRBB1、IRBB2、IRBB10、IRBB11、IRBB4;第Ⅱ类为中感基因系,包括IRBB3、IRBB203、IRBB14;第Ⅲ类为中抗基因系,包括IRBB8、IRBB13;第Ⅳ类为抗病基因系,有IRBB21;第Ⅴ类为高抗基因系,包括IRBB5、IRBB7、CBB23、GDBB23;测试菌株中,出现可侵染抗病基因xa5的有42个、Xa7的有34个、Xa23的有31个。对以白叶枯病近等基因系为主的16个品种（系）与954个菌株组成的抗感互作变量数据矩阵进行因子分析,以解释总变量>85.0%为界,提取出8个主成分因子,组建了以近等基因系为主的10个品种(系)组成白叶枯病菌近等基因系鉴别寄主,按其对变量方差贡献大小,这些寄主分别为IRBB10（Xa10）、IRBB4（Xa4）、GDBB23（Xa23）、IRBB5（xa5）、IRBB7（Xa7）、IRBB21（Xa21）、IR24（Xa18）、IRBB13（xa13）、IRBB3（Xa3）、金刚30;新鉴别寄主可将954个测试菌株划分为55个致病型,对测试稻区的白叶枯病菌菌株表现出较好的鉴别力。基因聚合联合抗性分析表明,不同抗病基因聚合对病菌的抗性频率有一定的提升,不同抗病基因对测试菌株的抗性具有一定的互补性。【结论】监测稻区的白叶枯病菌系趋向多样化,毒性分化明显,强毒菌系Ⅸ型菌在部分稻区已上升为优势致病型,侵染xa5、Xa7及Xa23等广谱抗性基因的菌株有上升趋势;抗病基因聚合可拓宽品种对病原菌系的抗性谱,是培育广谱抗性品种的有效途径;近等基因系鉴别寄主的建立与应用可为白叶枯病发生流行的精准监测以及田间实时预警提供技术支撑。     

苹果LRR-RLK基因家族鉴定和表达分析

【目的】从苹果全基因组中鉴定LRR-RLK家族蛋白成员,并进行生物信息学和表达模式分析,为研究苹果LRR-RLK的潜在功能提供理论基础。【方法】利用BLASTp基于GDR数据库鉴定苹果LRR-RLK家族成员,通过ExPASy Proteomics Server、Cell-PLoc、CD-Search Tool、MEGAX、MG2C等软件分析LRR-RLK蛋白序列基本信息、亚细胞定位情况、结构域组成、系统进化关系以及染色体定位情况。利用实时荧光定量PCR技术检测苹果12个LRR-RLK的组织表达和诱导表达特性。【结果】苹果LRR-RLK基因家族包含378个成员,这些LRR-RLK蛋白包括318—1 827个不等的氨基酸残基,等电点分布在5.16—9.75。亚细胞定位结果显示LRR-RLK蛋白均定位在细胞膜。系统进化分析可将其分为15类,各亚家族基因数量分布在1—111。染色体定位结果显示,LRR-RLK在苹果17条染色体上均有分布,其中第7条染色体数量最多,为40个。LRR-RLK家族基因具有2个特定的保守结构域,分别是LRR结构和蛋白激酶结构。蛋白二级结构以无规则卷曲为主,其次是α-螺旋,β-转角所占比例最小。通过定量检测发现筛选的12个家族成员在各组织中均有表达（除MD00G1105400外）,且多数基因在茎中表达水平相对较高。低温条件下,7个基因上调表达,其中MD09G1153800上调最明显,最高为对照的6.8倍,而MD06G1170200和MD05G1061600均下调表达;在干旱条件下,8个基因上调表达,其中MD00G1105400上调最明显,最高为对照的9.6倍;在盐胁迫条件下,MD04G1150400、MD13G1108000和MD02G1071800始终处于上调表达状态,其中MD02G1071800上调最明显,最高为对照的14.9倍。苹果新梢接种轮纹病菌后,12个LRR-RLK家族基因表达基本上呈先上升后下降的趋势。并且在‘望山红’中,1 d时表达水平较高,而在‘鸡冠’中,3 d时表达水平较高。MD09G1153800和 MD05G1065800在‘鸡冠’响应轮纹病菌侵染过程中显著上调表达,而在‘望山红’中无响应,可作为进一步开展抗病研究和功能分析的候选基因。【结论】苹果LRR-RLK基因家族包含378个成员,进化上可分为15组,在17条染色体上均有分布,多数基因具有在茎中高表达的组织表达特征,多数基因受逆境和轮纹病菌调控。     

小麦抗条锈基因Yr52在品种改良中的应用

【目的】 评价小麦高温成株期（high temperature adult plant,HTAP）抗条锈病基因Yr52在生产中的应用价值,选育出农艺性状优良并高抗小麦条锈病品系,为充分利用现有高温成株期抗病资源、提高相关产量性状奠定基础。【方法】 通过回交和自交结合分子标记辅助选择育种方法,将小麦抗条锈病基因Yr52转育到轮选987（LX987）、百农矮抗58（AK58）和邯6172（H6172）中。在四川绵阳和陕西杨凌鉴定圃,用小麦条锈菌流行生理小种CYR32、CYR33和CYR34混合侵染,鉴定抗病基因载体品系和受体品种以及它们的高代家系的成株期抗病性。比对中国春参考基因组,结合Yr52两翼SSR分子标记Xcfa2040（6.8 cM-Yr52）和Xbarc182（1.2 cM-Yr52）,在目标基因物理区间内寻找35K SNP芯片标记,并开发成dCAPS和KASP分子标记,对BC₂F_5:6高代群体进行抗条锈病基因Yr52的检测。【结果】 抗病性鉴定和农艺性状评价表明,在19个具LX987背景的BC₂F_5:6家系中,抗条锈性表现为高抗（IT=0—3,DS=1%—20%）有11个,中抗（IT=4—6,DS=15%—30%）有8个,平均千粒重（TKW）、每穗穗粒数（KPS）、单株有效分蘖（PTN）、株高（PH）和穗长（SL）分别为45.33 g、46粒、7个、113.26 cm和10.05 cm。4个具AK58背景BC₂F_5:6家系全部表现高抗（IT=0—3,DS=5%—25%）;平均TKW、KPS、PTN、PH和SL分别为44.67 g、48粒、7个、96.54 cm和10.17 cm。5个具H6172背景的BC₂F_5:6家系全部表现高抗（IT=0—3,DS=5%—20%）;平均TKW、KPS、PTN、PH和SL分别为43.74 g、49粒、8个、109.72 cm和10.06 cm。分子标记检测结果表明,Yr52两翼连锁的分子标记Xbarc182、Xcfa2040和Xwmc557在后代群体中的检出率分别为78.57%、66.67%和66.67%,并成功开发出1个dCAPS标记Xdcaps-Yr52-1和1个KASP标记Xkasp-Yr52-1,两者在群体中的检出率分别为73.68%和41.67%。通过比较高抗（IT=0—3）与中抗（IT=4—6）水平家系的农艺性状,结果表明,IT在0—3的家系平均TKW（P>0.05）、PTN（P>0.05）和KPS（P<0.05）高于中抗水平的家系。结合各亲本抗病性和农艺性状筛选出PH为80—105 cm、PTN≥6个、KPS≥45粒、TKW≥42 g、SL≥8 cm的材料共5份。【结论】 Yr52仍对当前主要流行小种具有成株期抗性;将Yr52导入中国主栽感病小麦品种中,选育出综合抗病性和农艺性状良好的高代材料可用于培育多基因聚合的品种,丰富抗病基因的多样性,并实现持久利用。     

基于BSA-Seq技术的甜瓜抗霜霉病InDel标记开发

目的 获得与甜瓜抗霜霉病基因连锁的分子标记或功能标记,用于甜瓜分子标记辅助选择育种。为进一步克隆甜瓜抗霜霉病主效基因奠定基础。方法 以野生高抗霜霉病资源DM-4和感病自交系DM-2为亲本,构建F₂代分离群体,利用BSA-seq对甜瓜抗霜霉基因进行QTL定位,开发InDel分子标记,并在双亲及其F₂群体单株进行筛选验证。结果 甜瓜抗霜霉病主效QTL位于第9号染色体。在候选区间开发了37个InDel分子标记,有9个PCR产物大小在抗、感双亲表现出差异,用F₂单株验证,结合田间表型鉴定结果,引物InDel 15和InDel 20准确率分别为95 %和98 %,引物InDel 15和InDel 20在抗病亲本中扩增产物大小分别为251和349 bp,在感病亲本中分别为231和324 bp。结论 引物InDel 15和InDel 20可以作为分子标记进行抗霜霉病辅助选育,加快了甜瓜抗霜霉病育种速度。     

查尔酮合成酶基因在葡萄抗灰霉病和霜霉病中的作用

[目的]克隆不同抗性葡萄品种中查尔酮合成酶(chalcone synthase)基因CHS1,明确该基因在葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)和葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)侵染下的表达模式,并对CHS1进行亚细胞定位和功能验证,为探究CHS1的广谱抗病作用机理提供依据.[方法]分别...     

苹果转录因子MdWRKY40b抗白粉病的机理

【目的】探究苹果白粉病相关基因MdWRKY40b调控苹果抗白粉病的机理,为苹果白粉病的抗性育种提供理论依据。【方法】以苹果品种‘嘎拉’叶片为材料提取总RNA,并以cDNA为模板克隆MdWRKY40b 552 bp特异性片段,采用Gateway技术将该基因片段的正反向序列构建入RNAi表达载体pB7GWIWG2(Ⅱ)中,然后利用农杆菌介导法对苹果叶片进行转化获得转基因植株,苹果叶片选用组培苗茎尖处幼嫩叶片;利用RT-qPCR技术对转基因植株中MdWRKY40b、超氧化物歧化酶基因（SOD）、过氧化氢酶基因（CAT）、过氧化物酶基因（POD）以及β-1,3-葡聚糖酶基因（β-1,3-glucanase）的表达量进行分析;进一步以1年生植株为材料,通过白粉病菌（Podosphaera leucotricha）接种试验,分析转基因植株对白粉病的抗病性;然后以接种白粉病菌后0、5、10、15、20 d的转基因植株及其对照植株叶片为材料,进行氯化硝基四氮唑蓝液（NBT）和二氨基联苯胺法（DAB）染色来分析病菌侵染期间植物材料中超氧阴离子和过氧化氢的积累量,进一步对病菌侵染期间植株中SOD、POD、CAT和β-1,3-葡聚糖酶等酶活性进行测定。【结果】经过PCR检测,确定获得3个MdWRKY40b基因沉默株系,分别为RNAi-1、RNAi-2和RNAi-3;RT-qPCR结果显示3个转基因株系MdWRKY40b基因沉默效率分别为95.2%、92.2%、79.8%,转基因植株中SOD、CAT、β-1,3-glucanase的表达量相较野生型显著上调;人工接种白粉病菌后发现,与野生型植株相比,转基因植株叶片中的粉状病斑显著减少,超氧阴离子和过氧化氢的积累量显著降低,SOD、CAT、POD等调节植物超氧阴离子代谢的抗氧化酶以及抗病相关的β-1,3-葡聚糖酶的活性显著增强。【结论】MdWRKY40b的沉默使得苹果植株对白粉病的抗病性增强,推测转基因植株中SOD、CAT、β-1,3-glucanase的上调表达提高了苹果植株对白粉病的基础抗性,导致植物对超氧阴离子的清除能力增加,维持了植物体在响应病菌侵染过程中的低浓度超氧阴离子含量,从而减少高浓度超氧阴离子对植物的损伤。     

黄瓜白粉病抗性基因定位及候选基因分析

【目的】通过对黄瓜白粉病抗性基因的精细定位,明确抗性基因的候选区段,为进一步克隆基因及解析基因功能奠定基础。【方法】本研究选用高抗白粉病资源(自交系‘74’)和感白粉病资源(自交系‘80’)配制杂交组合,构建F_1、F_2群体,利用单囊壳白粉菌鉴定亲本及群体白粉病抗性并进行遗传分析;采用BSA-seq的方法对黄瓜白粉病抗性基因进行初步定位,在此基础上在候选区段开发分子标记,进一步精细定位白粉病抗性基因。【结果】分离群体单株表型鉴定结果表明,自交系74的抗性是由不完全隐性基因控制的。BSA-seq技术初步将抗性基因定位于5号染色体15—25 Mb位置,命名为PM 74。最终,利用分子标记将抗性基因定位于SSR15321和SSR07531之间,遗传距离为3.06 c M,物理距离为238 444 bp,可解释41.95%的表型变异。生物信息学分析表明在候选区段内包含有17个候选基因,其中Cucsa.275630为TIR-NBS-LRR类基因。【结论】本研究将黄瓜白粉病抗性基因精细定位到约238 kb的候选区段内,区段内包含有一个TIR-NBS-LRR基因,该基因将是今后研究的重点候选基因。     

中国野生毛葡萄芪合酶基因表达及对葡萄抗白粉病的影响

[目的]克隆中国野生毛葡萄(Vitis quinquangularis)'丹凤-2'芪合酶(stilbene synthase)基因(STS)并研究其功能,为提高欧洲葡萄(V.vinifera)的白粉病抗性及品质提供依据.[方法]利用同源克隆法获得中国野生毛葡萄'丹凤-2'芪合酶基因VqSTS9和VqSTS21,构建植...     

黄瓜抗白粉病突变体筛选与鉴定

【目的】白粉病是危害黄瓜产量、品质的最严重的病害之一,抗白粉病材料的发掘与研究,可以实现从根本上解决病害问题。对获得的‘长春密刺’突变体材料进行分析,旨在筛选出黄瓜抗白粉病突变体材料,丰富育种群体。【方法】对400份‘长春密刺’突变体材料进行苗期接种白粉病菌试验,通过叶片病斑观察结合病情指数分析,初步筛选出抗病材料,将筛选出的抗病材料在大田环境下自然发病进一步观察表型。对初步筛选出的抗病材料进行苗期生理鉴定,测定并分析超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性以及叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素、可溶性蛋白含量等生理指标,通过田间自然发病进一步筛选抗病材料,并测定其蒸腾速率、胞间二氧化碳浓度、气孔导度、净光合速率等光合作用指标及乙烯、茉莉酸、水杨酸激素含量,并通过荧光定量PCR分析叶片中乙烯、茉莉酸、水杨酸、木质素、病程相关蛋白等防御信号途径中相关基因的表达。【结果】与感病材料相比,抗病材料的表面菌斑少,净光合速率、气孔导度都优于对照‘长春密刺’,胞间CO₂浓度低于‘长春密刺’。在防御激素方面,抗病材料的乙烯、茉莉酸、水杨酸含量同样优于感病材料,而在成熟期叶片的防御信号途径相关基因表达上,抗病材料的表达高于感病材料。通过苗期接种白粉病菌和田间自然发病综合筛选出了两份抗白粉病突变体材料：Mu-86-2、Mu-58-9。【结论】通过对突变体库的筛选可以获得抗白粉病新材料,这些材料的获得对黄瓜抗白粉病的遗传研究和新品种培育具有重要价值。