陆地棉MADS-box家族基因鉴定及组织特异性表达分析

【目的】MADS-box蛋白是1种重要的转录因子,参与调控棉花生长发育进程。鉴定分析陆地棉MADS-box家族基因,可为研究其生物学功能奠定基础。【方法】基于2019年最新组装的陆地棉TM-1参考基因组,通过HMMER 3.0软件鉴定陆地棉TypeⅠ型及MIKC型MADS-box基因。利用MapInspect、MEGA7.0、MEME和TBtools软件以及omicshare网站进行染色体定位、多序列比对聚类分析、Motif预测、基因结构鉴定以及组织特异性表达分析。【结果】从全基因组水平上鉴定出181个陆地棉MADS-box基因(66个TypeⅠ型和115个MIKC型),染色体定位发现该181个基因在陆地棉26条染色体上均有分布,其中A组染色体上分布有78个基因、D组上分布有103个基因。系统进化分析显示TypeⅠ型MADS-box蛋白有3个亚家族,MIKC型蛋白包括MIKC*型和含有10个亚家族的MIKCC型;motif预测结果显示所有MADS-box蛋白均含有MADS结构域,基因结构分析结果显示,外显子、内含子结构和长度在各亚家族内具有同一性;组织特异性表达分析发现MADS-box...     

棉花GhMADS7基因正调控棉花花瓣发育

MADS-box基因家族作为一类重要的转录因子,主要参与植物花器官的生长发育。GhMADS7/98具有保守的MADS-box及K结构域,属于AG亚家族MIKC~C型MADS-box基因。通过同源序列比对发现,GhMADS7/98与拟南芥AtAG (AT4G18960)基因的蛋白序列具有64%的同源性。组织表达分析表明, GhMADS7基因在花瓣、花药、柱头和胚珠等花器官组织中均有表达。为进一步研究该基因的功能,构建了该基因的RNAi干涉载体并转化棉花,获得了表达量明显下调的转基因株系。表型观察发现,在干涉植株长度为5~6 mm和7~8 mm的花蕾中出现花瓣发育延缓的表型;通过对干涉系转基因植株花瓣进行石蜡切片观察发现,相较于野生型植株,干涉系植株花瓣中的维管束存在明显的收缩现象;通过qRT-PCR检测发现,转基因株系中控制花瓣发育的A、B类基因的表达量出现异常。因此推测GhMADS7在棉花花瓣发育过程中起着重要的作用。     

龙葵SnAGAMOUS-Like47基因的克隆与功能分析

本研究采用转录组数据筛选获得一个AG类基因SnAGL47并进行生物信息学分析,采用RT-PCR分析其在不同部位的组织特异性表达,通过在龙葵中超表达SnAGL47分析其表型变化,使用分光光度计测定转基因植株萼片花青素含量。结果显示,SnAGL47基因的开放阅读框为681 bp,编码226个氨基酸,含有MADS结构域以及K-box结构域,C端具有两个AG-motif结构,属于AG类MADS-box家族基因;系统进化树分析显示,SnAGL47与番茄中的TOMATO AGAMOUS-Like 11(TAGL11)亲缘关系最近。RT-PCR分析表明,SnAGL47基因只在花的心皮组织中表达。形态学分析发现超表达SnAGL47植株的花萼明显增大;在果实成熟期,萼片出现类似成熟果实中的花青素积累而变为紫红色。研究表明,SnAGL47具有MADS以及K-box结构域,属于AG类MADS-box家族基因,过表达SnAGL47会导致萼片向心皮状器官的转变并产生花青素的积累,推测SnAGL47参与龙葵心皮的发育及果实的成熟过程。     

陆地棉转激素基因材料的SSR标记分析

利用SSR标记对陆地棉遗传标准系TM-1及其转激素基因后代材料进行。DNA指纹分析。从25对引物中筛选出6对扩增条带差异明显、信号强、背景清晰的引物,选用这6对多态性SSR引物扩增出18个差异片段,其中13个片段呈多态性,占总扩增片段的72．2％。依据扩增结果对42份转激素基因后代材料进行了遗传相似系数分析,构建了分子聚类图,并对其中部分转激素基因材料绘制了SSR指纹图谱。结果表明13个转激素基因材料与TM-1的遗传相似系数都在0．5以下,对这些材料的遗传关系做了初步探讨。     

棉花GhMADS43基因的克隆及酵母自激活分析

为探索棉花GhMADS43基因在茎尖和花分生组织发育过程中的机理,从棉花中克隆了MADS-box家族中GhMADS43基因,并对该基因进行表达分析和酵母自激活分析,以期利用酵母双杂交筛选GhMADS43的互作蛋白质。对棉花中GhMADS43基因进行克隆及组织特异性表达分析,结果显示,GhMADS43基因全长696 bp,编码231个氨基酸,与其他植物中编码FUL蛋白的基因亲缘关系相近。由特异性表达分析可得,GhMADS43基因在根和顶芽中表达量较高;对2种不同果枝材料进行不同顶芽发育时期的表达分析表明,该基因在无限果枝材料中棉所50五叶期和六叶期的表达量显著高于一式果枝材料早铃1号。将该基因构建到酵母诱饵载体pGBKT7,得到pGBKT7-GhMADS43诱饵表达载体。重组质粒转化酵母Y2HGold菌株后,在SD/-Trp平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性,在SD/-Trp/X-α-Gal平板上长出白色菌落变蓝。利用不同浓度的3-AT对其进行筛选发现,该基因不能在三缺培养基SD/-Trp/-His/-Ade中生长,表明该基因不具有自激活活性。构建好诱饵表达载体后,...     

棉花GhMADS12基因的克隆及其表达载体的构建

MADS-box基因是真核生物中一类重要的转录调控因子,调节着植物根、茎、叶到花的发育和果实的成熟。本研究以中棉所36花发育期均一化全长cDNA文库为基础,分离出一个棉花的MADS-box基因全长cDNA命名为GhMADS12。同时利用pBI121双元载体成功构建了GhMADS12基因的植物过表达载体,并利用基因枪轰击法瞬时表达载体,验证了载体的可靠性,为下一步转基因验证基因的功能奠定了基础。     

陆地棉EPSPS基因全基因组分析

当前在NCBI中提交的来源于陆地棉的EPSPS基因有2个,随着陆地棉基因组测序结果的公布,为在陆地棉基因组中全面鉴定EPSPS基因的存在提供了便利条件。从陆地棉异源四倍体标准系TM-1基因组数据库中共搜寻获得4个EPSPS同源基因,这4个基因分别分布在A07、A12、D07和D12亚基因组。从这4个基因的核苷酸序列、氨基酸序列和基因结构的比对,构建进化树的系统发育分析以及基因的转录情况研究来看,定位在A07和D07亚基因组的2个基因属于共线性高度同源基因,定位在A12和D12亚基因组的2个基因也是相同的情况。序列比对结果表明,已经在NCBI中提交的2个EPSPS基因分别是定位在A12和D12亚基因组上的基因,研究结果为定位在A07和D07亚基因组上EPSPS基因的克隆和功能研究提供了基础理论依据。     

陆地棉叶片发育相关基因GhRH39克隆与功能分析

【目的】研究陆地棉DEAD-box RNA解旋酶基因GhRH39在叶片发育中的功能。【方法】借助生物信息学方法分析GhRH39的基因结构和进化关系,利用实时定量聚合酶链反应PCR (Quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)分析该基因在棉花不同组织和叶片不同发育时期的表达情况,利用病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing, VIGS)技术对该基因进行沉默。观察阳性植株表型,检测其光合色素含量变化,对阳性植株中叶绿体发育和光合色素合成相关基因进行表达量检测。【结果】Gh RH39编码620个氨基酸,且序列较为保守。qRT-PCR分析表明,该基因在根、茎、叶片、顶芽、花瓣、纤维中均有表达,在叶片中表达量较高,且在叶片中的表达量随着叶片发育进程而变化。利用VIGS技术成功降低了GhRH39的表达水平,基因沉默的阳性棉株出现失绿表型,叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素3种光合色素含量均降低。阳性沉默棉株的叶绿体发育和光合色素合成相关基因表达量出现一定程度的下降。【结论】GhRH39基因影响棉花叶绿素和类胡萝卜素合成,同时影响叶绿体发育过程。     

陆地棉转录因子GhNAC78基因的特征及功能分析

本实验室从陆地棉中克隆得到GhNAC78,分析了其基因特征及功能。该基因cDNA全长为937 bp,开放阅读框为876bp,编码291个氨基酸,隶属于NAM转录因子亚家族。体外转录激活实验表明,GhNAC78具有转录激活活性。上游启动子区1537 bp序列的生物信息学分析可知其包含多种激素、胁迫和光响应元件,表明GhNAC78广泛地参与植物生长发育和胁迫响应的调控。荧光定量结果显示,GhNAC78在棉花叶片衰老过程中高调表达,推测其参与叶片衰老的调控。     

陆地棉钾转运体基因GhHAK5启动子的克隆与功能分析

KUP/HAK/KT钾转运体基因的转录调控是植物响应低钾胁迫的一项重要机制。克隆和分析棉花钾转运体基因的启动子,不仅有助于了解其表达模式及调控机制,对于改良棉花的钾吸收特性也具有重要意义。陆地棉钾转运体基因GhHAK5是一个在根中特异性高表达的基因,其表达受低钾胁迫诱导,目前关于该基因启动子的功能还不清楚。本研究以陆地棉品种百棉1号为材料,通过PCR方法对GhHAK5上游2000bp启动子片段(pGhHAK5)进行克隆,并通过转化拟南芥、GUS组织定位和低钾诱导表达特性分析来研究其功能。结果表明, pGhHAK5除具有TATA-box和CAAT-box等基本顺式作用元件外,还含有多个响应于光、逆境胁迫、植物激素和生物钟等的顺式作用元件。pGhHAK5与雷蒙德氏棉pGrHAK5在重要调控元件的数量和位置分布上具有较高的一致性,均具有5个参与根特异性表达调控的元件(ATAAAAT)和1个参与低钾条件下转录调控的ARF转录因子结合位点(TGTCNN)。GUS组织化学染色结果显示,转基因拟南芥幼苗的叶脉和胚轴维管束组织染色较深,根系染色较浅;成熟期转基因拟南芥植株的根、叶脉和花萼维管束组织染色...     

陆地棉NF-YB基因家族的全基因组分析

为了进一步了解NF-YB基因家族结构的功能,利用生物信息学手段,系统研究了陆地棉标准系TM-1基因组中NF-YB基因家族的数目、亚细胞定位、染色体分布、进化关系、基序以及组织表达情况。结果表明:TM-1基因组中共有41个NF-YB基因家族成员,它们含有相同的CBFD_NFYB_HMF结构域,大部分定位到细胞核内;41个NF-YB基因家族成员分布在19条染色体上,其中有19组成员在A亚组和D亚组中表现为直系同源基因;进化树分为Ⅰ和Ⅱ2个小组,每个小组成员间具有相似的基序类型和排列顺序;组织表达分析则发现,在这41个NF-YB基因家族成员中,至少有24个成员可以进行表达,且表现出一定的组织特异性。     

陆地棉GhERF8基因的克隆与表达分析

 乙烯响应元件结合因子（Ethylene-responsive element-binding factor,ERF）是植物中最大的转录因子家族之一。本研究以棉花叶片cDNA文库为基础,从陆地棉中棉所10号中克隆得到一个新的ERF基因,命名为GhERF8（GenBank：JN656957）。该基因编码265个氨基酸,蛋白序列中包含一个AP2保守结构域。采用荧光定量PCR（RT-PCR）的方法,对GhERF8基因在棉株不同生育时期叶片和不同组织中的表达水平进行了定量分析。结果表明,GhERF8基因在各组织中均有表达,但在成熟后期的叶片中表达量最高。GhERF8表达量与叶片衰老过程中叶绿素含量出现相反的变化趋势,推测GhERF8可能与叶片衰老有一定关系。在乙烯利和茉莉酸处理下GhERF8基因在叶片中上调表达,而在脱落酸处理下GhERF8表达量无显著变化,推测GhERF8可能处于乙烯和茉莉酸信号转导网络中,且表达途径为非ABA依赖途径。     

陆地棉抗坏血酸过氧化物酶基因家族全基因组生物信息学分析

【目的】抗坏血酸过氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)是过氧化物酶家族中的1类成员,可以清除活性氧。APX家族的生物信息学分析有助于更好地了解该家族基因。【方法】利用生物信息学方法,从中国农业科学院棉花研究所提供的陆地棉序列中鉴定出14条APX基因家族序列,并对这14个成员的染色体定位、亚细胞定位、进化关系、理化性质、信号肽、保守基序以及其编码蛋白的结构特征进行了预测分析,并初步分析了部分基因的表达。【结果】APX基因分布广泛,分散在不同的染色体上;且大部分APX蛋白定位在细胞质,是亲水性脂溶蛋白;有3个保守基序,保守性较强;基因起源和进化比较复杂;二级结构的主要元件为α-螺旋和无规则卷曲。根据表达分析推测,第1亚组和第2亚组的基因在棉纤维发育的不同时期起作用。【结论】这些结果有望为APX家族成员的结构与功能挖掘提供参考。     

转兔角蛋白基因改良棉纤维品质研究

通过花粉管通道转基因技术,将E6启动子驱动的兔角蛋白基因导入高产棉花品种苏棉16号。所用转基因表达载体还含有选择标记基因NPTⅡ(卡那霉素抗性基因)及Gus报告基因。对转化体后代的检测结果表明,T1代有2.1%呈现Gus阳性,在Gus阳性株中84.6%具有卡那霉素抗性。用依据E6启动子序列和兔角蛋白基因序列设计的两对引物,对经过上述筛选的植株进行PCR检测,多次重复,最终确定3株结果稳定的转兔角蛋白基因棉株。从品质分析结果看,这3个株系成熟棉纤维的品质部分得到改良,尤其比强度有较大幅度提高,与转基因受体相比平均提高6.3cN·tex 1。     

Induction of Embryogenic Callus in Gossypium barbadense L. and Gossypium hirsutum L. by Hormone Treatments

The aim of this study was to induce embryogenic callus from various cultivars of cotton in tissue culture, so that a stable and efficient regeneration system could be developed to produce new cotton varieties for cultivation in Xinjiang. The explant materials were hypocotyls of the main cotton cultivars grown in Xinjiang, i. e. Xinhai 25, Xinhai 16, Xinluzao 39, and Xinluzao 42. We tested the effects of different combinations of two hormones (kinetin, KT; 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D) on induction of callus from these explants. Calli were produced by the explants under four different combinations of hormones in the media. The optimal hormone combination to induce callus from Gossypium hirsutum explants was 0.1 mg·L^-1 KT + 0.05 mg·L^-1 2,4-D, while that to induce callus from Gossypium barbadense explants was 0.1 mg·L^-1 KT + 0.1 mg·L^-1 2,4-D. Hormone-free medium and medium containing double to the normal concentration of KNO₃ promoted the emergence of embryogenic callus. Filter paper placed under the medium promoted somatic embryo growth and regeneration of the root system. The differentiation and embryogenesis processes occurred more rapidly in G. hirsutum explants than those in G. barbadense explants. Using this protocol, normal plantlets of these cotton cultivars with strong roots were produced within 10 to 12 months. These methods could be used to increase the number of cotton genotypes that can be regenerated in tissue culture.     

棉花转录因子GhWRKY4基因的克隆及特征分析

 本研究从陆地棉中克隆得到GhWRKY4基因,全长cDNA是1281 bp,包含1083 bp的开放阅读框,编码的360个氨基酸属于IIcWRKY转录因子家族。分析GhWRKY4基因结构表明其有三个外显子和两个内含子。GhWRKY4蛋白的亚细胞定位实验表明其定位在洋葱表皮细胞核。实时荧光定量分析结果显示GhWRKY4在棉花的根、茎、叶和花中均有表达。染色体步移得到了GhWRKY4的5’端侧翼序列,生物信息学软件预测表明GhWRKY4包含一系列和胁迫基因调控相关的反式作用元件,表明GhWRKY4参与植物对盐害和冷害胁迫的反应。     

棉花微管结合蛋白基因GhMAP1-LC3的克隆与表达分析

应用RT-PCR从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)石远321开花当天胚珠中分离到一个553 bp的片段,含有一个360 bp的开放读码框,推导的氨基酸序列（119个氨基酸）与水稻、拟南芥的MAP1-LC3 (Microtubule-associated Protein 1-Light Chain3)分别具有94%与90%的同源性,由此推测该基因为编码棉花微管结合蛋白基因家族的一     

对一个新发现的棉纤维突变体的鉴定及特性分析

在农杆菌介导的转基因组织培养再生后代中发现了一个无绒有絮的纤维发育突变体,通过自交选择T₃代获得其纯合体,命名为CM突变体。尽管CM突变体从转基因后代中发现,但和转基因插入位点无关,推测是在组织培养过程中产生的点突变所致。通过与陆地棉遗传标准系TM-1,海岛棉军海1号,以及新乡小吉无绒有絮(XinFLM),新乡小吉无绒无絮(XinWX),徐州142无绒无絮(XZ142WX),显性光子N1N1,隐性光子n2n2、SL-7-1、MD17及T586等一系列纤维发育突变体分别配制F₂组合进行突变基因的遗传及等位性分析,结果表明CM突变体与纤维发育正常的TM-1和军海1号杂交,F₁表型均为无绒有絮,F₂表现无绒有絮和有绒有絮3∶1分离,说明该突变体与纤维发育正常材料相比,在短绒发育方面存在一个位点的差异,该突变性状由单显性基因控制。等位性测验及分子定位均表明, 控制该突变体短绒的基因与控制N1N1显性光子的N1基因等位。扫描电镜进一步证明该基因突变会造成纤维起始突起延迟。与N1N1突变体相比,CM突变体的衣分比N1N1显著高,而百粒重比N1N1极显著低。推测CM突变体中的突变基因与显性N1基因为复等位基因。     

陆地棉KFB基因家族全基因组鉴定与表达分析

【目的】KFB(Kelch containing F-box protein)是普遍存在于各种生物体中含有F-box结构域的一类家族蛋白,参与众多生物过程。本研究旨在开展陆地棉KFB家族基因鉴定和表达分析。【方法】利用生物信息学方法从陆地棉(TM-1)基因组中鉴定KFB家族成员,与已知的拟南芥、水稻、大豆等KFB蛋白序列构建系统进化树;进一步针对第Ⅱ亚族进行基因结构、染色体定位和表达分析。【结果】从陆地棉基因组共鉴定出150个KFB家族成员,进化分析表明这些基因可分为7个亚族。陆地棉KFB第Ⅱ亚族24个基因分布在14条染色体上,有9对直系同源基因;该亚族基因结构简单,半数基因只有1个外显子;qRT-PCR结果表明,该亚族基因具有较为广泛的组织表达模式,但在不同组织的表达存在差异。【结论】这些结果显示陆地棉KFB第Ⅱ亚族基因在进化过程中出现了功能分化。     

陆地棉(G. hirsutum L.) N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因(GhGnT)的克隆及耐盐性功能分析

在耐盐相关基因芯片基础上,我们筛选到盐诱导显著上调表达(Ratio>2)的N-乙酰氨基葡糖转移酶基因.选取耐盐材料中9806为材料,根据耐盐性抑制消减文库EST序列设计引物,利用RACE及RT-PCR技术获得该基因cDNA全长1970 by,命名为GhGnT.通过Blast比对,发现该基因与蓖麻乙酞氨基葡萄糖转移酶基因...