集胞藻PCC6803蛋白组学研究进展

自集胞藻PCC6803蛋白组学研究工作开展以来,已取得一系列研究成果。这些研究成果主要分为2类：①鉴定了全细胞或亚细胞结构内表达的蛋白质;②发现了许多环境胁迫条件引起的蛋白质差异表达,为理解细胞胁迫反应和蛋白的功能提供了线索。从这2个方面分别对集胞藻PCC6803蛋白组学的研究成果进行简要综述。     

集胞蓝细菌PCC 6803中CcmK2蛋白多克隆抗体的制备与检测

CcmK2蛋白是集胞蓝细菌PCC 6803羧酶体外壳蛋白的主要组分,在羧酶体的组装与功能行使方面扮演重要角色。为解析其功能,本研究构建了原核表达载体pET28a-CcmK2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达带有6个组氨酸标签的CcmK2重组蛋白。通过金属亲和层析技术,将CcmK2重组蛋白纯化后免疫家兔,制备抗CcmK2多克隆抗体。基于Dot blot分析的结果显示:该多克隆抗体能够有效检测蓝细菌CcmK2蛋白;进一步的抗体特异性分析显示,CcmK2多克隆抗体与其他羧酶体外壳蛋白存在微弱的抗原抗体反应;最后,通过Western blot分析证实该多克隆抗体能够特异而灵敏地检测集胞蓝细菌PCC 6803中CcmK2的丰度。     

集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803 slr1501的克隆及原核表达分析

组蛋白乙酰基转移酶上调表达与抗逆性有一定相关性。集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803 Slr1501是一个未知蛋白,预测其属于组蛋白乙酰基转移酶GNAT家族N-乙酰基转移酶。为了进一步明确slr1501基因功能,本研究从集胞藻6803中克隆slr1501基因,成功构建了pET-28a(+)-slr1501原核表达载体,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行分析。经1 mmol/L IPTG诱导2 h后Slr1501蛋白成功表达,表达量随诱导时间的延长而增加,且主要以包涵体形式表达。Western blot检测结果显示Slr1501重组蛋白特异性表达。本试验结果为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

利用同源重组构建蓝藻集胞藻6803ndhM基因突变株及其分子鉴定

蓝藻NADPH脱氢酶(NDH-1)是一种重要的光合膜蛋白复合体,参与CO2吸收、围绕光系统I的循环电子传递和细胞呼吸。迄今为止,人们已在蓝藻细胞中鉴定出15种NDH-1复合体亚基(NdhA-NdhO)。然而,人们对NdhM亚基的研究尚不够,至今未见有反向遗传学等方面的研究。在通过构建同源重组载体、自然转化和多次继代筛选后,对转化子进行了PCR和蛋白免疫印迹鉴定。研究结果表明,壮观霉素基因已成功地插入到ndhM基因的保守区域,并完全破坏了ndhM基因的蛋白表达,从而获得了ndhM基因缺失的突变株,为进一步研究NdhM亚基对NDH-1复合体的稳定性和生理功能等奠定了试验基础。     

光生物反应器中集胞藻6803的光衰减及其生长动力学研究

[目的]分析集胞藻6803细胞培养体系的光衰减及分批培养条件下藻细胞的生长特性。[方法]以集胞藻6803（Synechocystis sp.PCC6803）为供试藻种,用尤尼柯7200型分光光度计测定藻细胞浓度和用ST-85自动量程照度计测定光强在通过不同光程、不同浓度藻液时的变化。[结果]随着藻细胞浓度和光程的增加,光强迅速下降。在同一光程下,光强随着藻细胞浓度的增加而下降。在培养初期藻细胞浓度较低时,光衰减程度较小;在培养后期,随着藻细胞浓度的增加,光衰减程度逐渐增加。在培养过程中藻体细胞的生长规律与微生物发酵过程中菌体的生长规律相似。藻体细胞生物量曲线与微生物发酵时的菌体生长曲线相似。[结论]Lambert-Beer公式Ln（I/I0）=-KaXL能较好描述藻细胞浓度和光程对光衰减的综合影响;Logistic方程能很好描述藻细胞的生长曲线。     

用同源重组法将Δ5 Des整合在集胞藻6803中的表达

从枯草芽孢杆菌染色体中扩增出受冷诱导的Δ5Des去饱和酶,构建出可以与集胞藻PCC6803染色体发生同源双交换的质粒,将Km抗性基因::PpsbA1::Δ5脂肪酸去饱和酶基因和对照基因分别整合入PCC6803的染色体上,获得转化子后,对不饱和脂肪酸进行研究。结果发现,30℃条件下脂肪酸成分的含量发生了较大变化,20℃时有新成分的出现,且长链脂肪酸的含量有所上升。     

集胞藻酰基载体蛋白基因过量表达对脂肪酸合成的影响

酰基载体蛋白(ACP)是微生物脂肪酸生物合成途径中的一个关键蛋白。为了促进集胞藻脂肪酸的积累,以集胞藻PCC6803为研究对象,成功构建了用于过量表达ACP(ssl2084)基因的同源重组质粒ssl2084⁽(+))并在集胞藻PCC6803中进行转化。将ssl2084⁽(+))突变株进行DNA水平和蛋白质水平鉴定,结果表明,ssl2084基因已经得到过量表达。利用气相色谱—质谱联用技术(GC-MS)对突变藻株在不同温度下脂肪酸的含量及组分进行检测,发现在30℃培养条件下ssl2084⁽(+))突变株中C12:0、C16:0和C18:0的含量显著增加,分别为1.50、8.74和0.60 mg·g^-1,与野生型相比分别增加了54.71%、50.82%和155.86%;在20℃低温胁迫培养条件下,C12:0、C16:0和C18:0的含量分别达到1.70、11.85和2.31 mg·g^-1,与野生型相比分别增加了31.94%、47.35%和39.90%。以上结果表明,在集胞藻PCC68...     

重组铜绿假单胞菌外膜蛋白D的原核表达与多克隆抗体制备研究

为获得铜绿假单胞菌外膜蛋白OprD并研究其分子功能。本研究采用分子克隆构建OprD蛋白重组表达菌株,用正交试验设计方法获得OprD菌株的最优表达条件和培养条件,通过SDS-PAGE切胶的方法纯化OprD蛋白,小鼠免疫制备OprD多克隆抗血清,蛋白质印迹法检测抗血清的特异性。使用DNAMan和MEGA软件对OprD蛋白进行同源性和系统发生分析。结果表明,OprD重组载体双酶切、DNA测序鉴定结果、OprD蛋白表达与纯化条带大小分别与预测相符。正交试验获得OprD菌株的最优培养条件为:葡萄糖浓度为0,转速230r/min,装液量为50mL;最优表达条件为:菌液OD600=0.8时加入终浓度为0.3mmol/L的异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),37℃诱导12h。SDS-PAGE电泳切胶纯化获得纯度较高的OprD蛋白。蛋白质印迹法证实OprD蛋白抗血清具有较好的特异性。OprD蛋白序列系统发生分析发现,同菌属细菌存在较高的同源性,并且亲缘关系较近的细菌中OprD蛋白可能具有相似的分子功能。     

氯霉素对集胞蓝细菌PCC 6803细胞中羧酶体数目及其相关蛋白丰度的影响

羧酶体是由致密的外壳蛋白包裹着核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶和碳酸苷酶形成的细胞内蛋白质小体,是蓝细菌二氧化碳固定的场所。为解析羧酶体在不同培养条件下的功能,本研究构建了原核表达载体pET28a-CcmK2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达带有组氨酸标签的CcmK2重组蛋白,制备了其多克隆抗体,探讨了不同质量浓度氯霉素对细胞内羧酶体数目和羧酶体相关蛋白丰度的影响。首先,确定了不同质量浓度的氯霉素对集胞蓝细菌PCC 6803生长的影响,发现5.0μg/mL氯霉素能够完全抑制菌株的生长,但是可以维持菌株存活。随后,探讨了集胞蓝细菌在葡萄糖异养和光合自养转换过程中,氯霉素对细胞内羧酶体数目及羧酶体相关蛋白的影响。结果显示:氯霉素的加入抑制了细胞内羧酶体数目对环境碳源的响应;同时,Western blot检测发现5.0μg/mL氯霉素能够抑制细胞内新的羧酶体外壳蛋白CcmK2的合成。这些结果表明,氯霉素可能通过抑制羧酶体外壳蛋白的合成来干扰细胞内羧酶体的形成,细胞内羧酶体对环境碳源的响应存在复杂的调控机制。     

Synechocystis sp. strain PCC 6803定量PCR模板制备方法的改进

以Synechocystis sp.strain PCC 6803为实验菌株,设计改良制备定量PCR模板的方法;同时,对Synechocystis sp.strain PCC 6803总RNA的Trizol抽提法进行优化.结果显示,利用改良方法抽提得到的RNA结构更完整;同时,利用改良方法制备的模板可以用于后续定量PCR实验;其中,只有高表达量基因适用于半定量PCR,低表达量基因则需要实时荧光定量PCR检测.     

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶基因过量表达对集胞藻PCC6803脂肪酸合成的影响

磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶（phosphopantetheinyl transferases,PPTase）是细菌脂肪酸合成中的关键酶。本研究利用同源重组手段构建集胞藻PPTase基因（slr0495）过量表达重组质粒,在集胞藻PCC6803中进行表达研究,并在DNA和RNA水平进行验证,利用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）检测不同条件下突变藻株脂肪酸组分及含量。结果表明：在温度为30 ℃、光照强度为50 μmol ·m^-2 · s^-1培养条件下,过量表达slr0495基因突变藻株中C12:0、C16:0和C18:0的含量分别为1. 31 mg · g^-1、8.07 mg · g^-1和1.35 mg · g^-1,比野生型藻株分别提高了23.58%、25.31%和13.45%;在温度为20 ℃、50% NaNO₃浓度、光照强度为50 μmol · m^-2 · s^-1培养条件下,与野生型相比,突变藻株中C16:0和C18:0含量分别提高了44.71%和41.51%。以上结果表明,过表达slr0495基因增加了集胞藻PCC6803中长链饱和脂肪酸的含量,并且在低温（20 ℃）和缺氮（50% NaNO₃）双重胁迫培养条件下中长链饱和脂肪酸含量得到进一步提高。本研究为探究slr0495基因功能以及在逆境中基因产生的应激反应提供了理论依据,为微藻高产多不饱和脂肪酸代谢研究奠定了基础。     

鱼腥蓝细菌PCC 7120异形胞的分离

鱼腥蓝细菌PCC 7120是一种光合自养型丝状蓝细菌.缺氮条件下,菌丝上5％～10％的营养细胞分化为异形胞,发挥固氮作用.异形胞是研究生物固氮和细胞分化的理想材料.为研究异形胞生理功能及其发育过程中的基因表达变化,需要从菌丝中分离高质量的异形胞.用2 mg/mL溶菌酶与0.1％ Triton X-100同时处理菌丝30 min,得到了完整性好、纯度高的异形胞.     

培养基中几种重要营养元素对Anabaena sp. strain PCC 7120及Synechocystis sp. strain PCC 6803生长的影响

配制KNO3、KHCO3、NaHCO3、FeNa2-EDTA及Na2s2 O3营养盐培养液,并按一定浓度添加至液体或固体培养基中,获得含有不同营养素、不同浓度的液体及固体培养基,检测无机氮(NO3-)、无机碳(HCO3-)、Fe及Na2S2O3对集胞蓝细菌Synechocystis sp.strain PCC 6803和鱼腥蓝细菌Anabaena sp.strain PCC 7120细胞生长的影响.结果显示,集胞蓝细菌Synechocystis sp.strain PCC 6803在10 mmol/L硝酸盐生长较好,鱼腥蓝细菌Anabaena sp.strain PCC 7120在2 mmol/L硝酸盐生长较好.不同浓度KHCO3及NaHCO3都会对蓝细菌的生长产生影响,可能是因为盐离子发挥了主要作用.此外,2种蓝细菌在10 mmol/L Na2S2O3中生长较好,不同浓度的铁盐对蓝细菌的生长产生较大影响,在10μmol/L铁盐中生长最佳.     

鱼腥蓝细菌实时观察微型培养系统的建立和应用

为克服传统方法不能实现对特定菌丝或细胞的连续定点观察的难题,利用低熔点琼脂糖培养基将菌丝包埋在玻底培养皿中,制备了鱼腥蓝细菌PCC 7120菌株实时观察的微型培养体系.结果表明:在该培养体系中,菌丝能进行正常的生长、分裂和分化;利用该系统可以观察细胞分裂蛋白FtsZ和DNA双链损伤修复蛋白RecN在细胞分裂过程中的动态变化,实现对同一菌丝进行长时间的连续定点观察.     

单交换法构建鱼腥蓝细菌ftsZ的gfp原位标记菌株

利用单交换法将gfp整合到鱼腥蓝细菌PCC 7120基因组上,构建ftsZ-gfp的翻译融合菌株,并观察了FtsZ蛋白的亚细胞定位.结果表明:通过同源重组,gfp与基因组中唯一完整的ftsZ融合,既保证了ftsZ基因的正常表达又能准确反映ftsZ蛋白的亚细胞定位,并且实验周期短、操作方便,是研究蛋白质亚细胞定位的一种简单有效的方法.