锚定表达猪IFN-λ3重组植物乳杆菌的构建及其抗PEDV效果的检测

为构建锚定表达猪IFN-λ3的重组植物乳杆菌(L.plantarum),并验证其抗病毒活性,本研究将猪IFN-λ3基因插入大肠杆菌-乳酸菌穿梭锚定表达载体pSIP-409-pgsA'中构建重组质粒pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3,将其电转化至植物乳杆菌NC8中获得重组pSIP-409-pgsA'-IFN-λ3/L.plantarum。经清酒乳杆菌素(SPPIP)诱导后用His标签单克隆抗体经westernblot、间接免疫荧光检测目的蛋白的锚定表达情况。结果显示,猪IFN-λ3在重组植物乳杆菌表面锚定表达。利用重组菌刺激细胞后通过荧光定量PCR测定IPEC-J2/PEDV系统中猪流行性腹泻病毒(PEDV)载量,并检测该重组菌刺激细胞后干扰素刺激基因(ISGs)的相对转录水平。结果显示,该重组菌能够显著抑制PEDV在IPEC-J2中的复制,并能诱导细胞中ISGs(OASL、IFITMs)的高转录水平,具有抗病毒作用。本研究为PEDV的预防和治疗提供可行方案。     

重组猪IFN-α原核表达及其活性分析

为了表达猪重组α干扰素(rIFN-α)并对它的生物学特性进行研究,本研究采用RT-PCR从猪脾淋巴细胞中扩增出猪IFN-α基因,以pPROExHTa为载体构建了表达重组质粒polFN-α,转化宿主菌BL21,经IPTG诱导猪rIFN-α获得了表达,其分子量约22 ku.该重组蛋白以包涵体形式存在,其表达量占总菌体蛋白7%.粟用Ni-Ni金属螯合亲和层析方法纯化,其纯度达到80%以上,包涵体经复性后,在WISH/VSV系统上,采用细胞病变抑制法测定表明,其稀释度在小于1:103时才有抗病毒活性.本实验表达的猪rIFN-α具有一定的抗病毒活性,为研究具有广谱抗病毒效应的猪干扰素具有重要意义.     

重组扬州鹅IFN-α的表达与活性研究

为获得具有抗病毒活性的鹅干扰素,本实验参考GenBank中鹅IFN-α基因序列设计引物,采用RT-PCR方法扩增扬州鹅IFN-α的全基因。将去除信号肽的IFN-α克隆至pET32a(+)以构建pET-mGoIFN-α,重组菌经IPTG诱导表达重组蛋白,纯化后的蛋白(mGoIFN-α)免疫BALB/c小鼠,利用ELISA方法测定小鼠血清抗体效价,westernblot检测抗体特异性。同时,将IFN-α全长基因克隆至pcDNA3.1(-)以构建pcDNA-GoIFN-α,间接免疫荧光试验检测rGoIFN-α在鹅胚成纤维细胞(GEF)中的表达,细胞病变抑制法检测其抗水泡性口炎病毒(VSV)活性。结果显示:本研究扩增得到576bp的扬州鹅IFN-α全基因与486bp的成熟基因片段;原核表达的mGoIFN-α为36.3ku,免疫小鼠后可产生具有良好特异性与抗原活性的多克隆抗体,效价为1:16000;pcDNA-GoIFN-α可在GEF中表达,并具有较高的抗VSV活性。本研究为制备安全、高效的重组鹅干扰素,为研制鹅病毒性疾病的新型生物制剂奠定了基础。     

猪IFN-α14的表达、纯化及抗病毒活性分析

干扰素(interferon, IFN)是一类具有抗病毒和免疫调节功能的细胞因子,目前已经应用于多种人和动物病毒病的预防和治疗。不同猪干扰素亚型的抗病毒活性差异较大,为了解猪IFN-α14的抗病毒活性,将猪IFN-α14基因序列进行分析,去除信号肽、优化密码子,并采用基因合成的方法合成了猪IFN-α14亚型基因,将其克隆入pCSMH原核表达载体,优化诱导条件,利用Ni琼脂糖凝胶纯化柱进行亲和层析,获得高纯度的重组猪IFN-α14蛋白,Western blot检测证明重组蛋白具有较好的特异性。用不同浓度的重组猪IFN-α14处理Vero细胞后,接种1 000 TCID₅₀猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV),24 h收集细胞和上清,通过荧光定量检测细胞内病毒的RNA水平,同时测定细胞上清中病毒的TCID₅₀。猪IFN-α14蛋白被成功表达并纯化,证明了10μg/L的重组猪IFN-α14干扰素能够显著抑制PEDV的复制。与本实验室前期表达纯化的猪IFN-α2、8相比,猪IFN-α14抑制P...     

鸭IFN-α成熟肽基因的原核表达、复性及其抗病毒活性研究

为获得鸭α-干扰素（DuIFN—α）并研究其生物学功能,将DuIFN-α成熟蛋白基因与原核表达载体pET32a＋连接后转化到BL21（DE3）获得工程菌BL21（DE3）／pET32a＋DuIFN—α,对其表达产物的纯化和复性关键技术及其抗水疱性口炎病毒（VSV）、鸭瘟强毒（DPV）活性进行研究。结果表明：BL21（DE3）／pET32a＋-DuIFN-α经0．4mmol／LIPTG诱导获得高效表达,表达的重组蛋白相对分子质量约37ku,以包涵体形式存在;重组蛋白经镍金属螯合介质（Ni—MIAC）进行纯化和复性后获得理想效果,其抗VSV活性的比活力达到12800U／mg;利用定量PCR检测到15U／mL的重组DuIFN-α对鸭瘟强毒表现出抑制作用,为重组DuIFN—α的临床应用提供试验数据。     

猪白细胞介素-2重组蛋白的原核表达及其生物学活性分析

用已构建好的重组表达载体pET30-IL2转化BL-21E.coli,挑取单克隆,利用诱导剂IPTG诱导表达;通过改变诱导剂的浓度、诱导的时间来摸索最佳诱导条件,在最佳诱导条件下大量表达,并利用镍层析柱纯化重组蛋白,用MTS法测定其生物学活性。结果表明,表达产物经SDS-PAGE分析,表达出25ku的融合蛋白,表达产物主要以包涵体的形式存在,最佳的诱导剂浓度为0.1mM,最佳的诱导时间为4h;对表达产物的包涵体处理后,用镍琼脂糖凝胶FF纯化,所得蛋白的纯度约在90%以上。通过透析除去部分尿素,复性后在体外利用MTS法检测其生物学特性,结果表明其仍具有较好的生物学活性,这为进一步大量制备和研究猪IL-2重组蛋白奠定了基础。     

梅花鹿IFN-β1的原核表达及活性鉴定

为表达具有抗病毒活性的梅花鹿干扰素β1(IFN-β1),本研究通过PCR扩增梅花鹿IFN-β1基因,将其克隆至原核表达载体p ET-28a中,构建重组质粒p ET-IFNβ1,并将其转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导后,得到高效表达。SDS-PAGE与western blot分析结果表明,梅花鹿IFN-β1重组蛋白的分子量大小约为24 ku,表达产物主要为不溶性的包涵体,表达量占菌体总蛋白的59.02%。将Ni柱纯化的p ET-IFNβ1诱导表达产物复性后,细胞病变抑制法检测表明表达产物具有抗病毒活性,其抗病毒活性可以达到10×53.81U/0.1 m L。梅花鹿INF-β1的表达为梅花鹿INF-β1的应用奠定了基础。     

猪干扰素α的原核可溶性表达及抗PEDV活性

旨在利用原核表达系统高效表达具有抗病毒活性的可溶性重组猪干扰素α(soluble recombinant porcine interferon-α,srPoIFN-α)。通过PCR方法扩增姜曲海猪IFNα基因成熟肽序列,将其分别克隆至原核表达载体pCold-Ⅱ、pET22b、pET30a和pET30a-ELP中并在大肠杆菌中进行表达;通过Western blot结合Image J软件或BCA定量分析不同表达载体、密码子偏好优化、培养基类别、纯化方式等因素对猪干扰素α基因在大肠杆菌中可溶性表达的影响,鉴定提高srPoIFN-α表达的有利因素;利用VSV-GFP和PEDV检测srPoIFN-α的抗病毒活性。结果显示,原核表达载体pET30a、密码子优化、HB-PET自诱导培养基和磁珠纯化均能显著提高srPoIFN-α产量(P<0.001);srPoIFN-α有效抑制VSV-GFP复制的稀释倍数为2^-8.1,与重组人干扰素α2b标准品的比活为1.71×10⁸ IU/g,有效抑制PEDV复制的稀释倍数为2^-10.29,抗P...     

从江香猪IFN-β基因的序列分析及原核表达

试验旨在探明从江香猪β-干扰素(interferon-beta,IFN-β)基因编码区分子序列及原核表达产物特征。以从江香猪为研究对象,提取肝脏总RNA并反转录为cDNA,设计特异性引物扩增IFN-β基因编码区,将目的基因片段克隆至原核表达质粒pET-28a上,获得重组质粒pET28a-CJpoIFN-β,并利用生物学软件对江香猪IFN-β基因编码区进行序列分析;将鉴定正确的重组质粒pET28a-CJpoIFN-β转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达、SDS-PAGE与Western blotting分析原核表达蛋白。结果表明,从江香猪IFN-β基因编码区长为561bp,编码186个氨基酸;该蛋白为分泌性蛋白,前21个氨基酸为信号肽序列;二级结构主要以α-螺旋(77.42%)和无规则卷曲(17.74%)为主。从江香猪与其他猪源IFN-β基因核苷酸序列同源性为99.5%～100.0%,与禽的同源性最低(35.2%);从江香猪与巴马猪、梅山猪IFN-β氨基酸同源性均为100.0%,但与贵州白香猪IFN-β同源性为99.5%,存在E43Q、K73R和C161R3处氨基酸的差异。Western blotting结果显示,带His标签的重组表达蛋白能被His单抗识别,条带大小约为24ku。本试验结果为进一步研究IFN-β基因生物学活性及加快从江香猪这一品种资源的有效利用提供参考依据。     

猪α干扰素基因在pET32a表达载体中的表达和鉴定

利用PCR技术从猪瘟免疫猪血中提取基因组,并从中扩增出约500 bp的基因片段;将此基因片段克隆于大肠杆菌pMD18-T载体,经PCR、测序鉴定后,将其片段克隆于pET32a(+)载体进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE检测,结果表明,猪α干扰素在pET32a原核表达载体中成功地获得了分泌表达,且表达蛋白在PK-15细胞上表现出较强的抗病毒活性,这为进一步研究猪α干扰素的功能和开发奠定了基础.     

IFN-α对山羊副流感病毒3型的抗病毒活性

旨在探讨原核表达纯化的山羊α干扰素(IFN-α)对山羊副流感病毒3型(CPIV3)的抗病毒活性。通过分析山羊IFN-α的序列特点,比对不同种属IFN-α的同源性,进而构建山羊IFN-α成熟蛋白编码基因(去除信号肽基因序列)的原核表达载体pET-30a-gIFN-α,将其转化至感受态细胞Rosetta (DE3),IPTG诱导后镍柱及亲和纯化获得山羊IFN-α。利用RT-qPCR测定山羊IFN-α作用于牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidney cell, MDBK cell)后6种干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes, ISGs)的相对表达水平;同时,利用TCID₅₀及Western blot测定其对CPIV3的抗病毒活性。结果表明,原核表达的山羊IFN-α蛋白含量为0.20 mg·mL^-1,Western blot结果表明表达产物相对分子质量约为20 ku,与预期结果相符。RT-qPCR结果显示,山羊IFN-α孵育MDBK细胞后,可显著刺激RSAD2、STAT1及ISG15等6种ISGs基...     

猪肺巨噬细胞源IFN-λ1的分子克隆、表达与活性分析

Ⅲ型干扰素(interferon lambda,IFN-λ)在机体抗病毒固有免疫、适应性免疫、黏膜免疫及抗肿瘤免疫等方面发挥重要作用。本研究利用RT-PCR技术从猪肺巨噬细胞CRL2845中扩增获得猪IFN-λ1基因(pIFN-λ1),并进行遗传进化分析和信号肽预测;将含信号肽的pIFN-λ1基因分别克隆至真核表达载体pcDNA3.1中,通过常规的质粒转化、阳性菌落筛选、质粒提取及酶切鉴定,获得重组质粒pcDNA-pIFNλ1;利用脂质体转染CRL2845细胞,转染48h后通过qRT-PCR、Western blot、间接免疫荧光方法分析pIFN-λ1表达及胞内定位;收集转染细胞总RNA,通过qRTPCR方法分析OAS1、ISG15、PKR、IFITM3等干扰素刺激基因的表达,并利用含报告基因的痘病毒VTT-EGFP感染瞬时表达pIFN-λ1的CRL2845细胞,通过流式细胞术分析pIFN-λ1抗痘病毒效果。结果显示,成功在猪肺巨噬细胞中扩增获得pIFN-λ1基因,并在CRL2845细胞内成功表达;瞬时表达后选择性诱导OAS1、ISG15的表达,并可抑制约38%的痘苗病毒感染CRL2845细胞。结果表明,瞬时表达pIFN-λ1能选择性诱导部分干扰素刺激基因的表达,且具有抗病毒活性,为深入研究猪IFN-λ1在宿主抗病毒免疫和黏膜免疫中的作用机理及其应用奠定基础。     

惠阳胡须鸡IFN-α、IFN-β基因在大肠杆菌中的表达及其抗病毒活性比较

构建了惠阳胡须鸡IFN-α/pGEX-6P-1I、FN-β/pGEX-6P-1的重组质粒,并在BL21中表达,对重组蛋白进行了抗病毒活性测定,结果表明IFN-αI、FN-β重组蛋白的抗病毒活性分别为7.9×105U/mg和6.4×104U/mg,IFN-α的抗病毒活性是IFN-β的12倍。IFN-αI、FN-β与干扰素受体具有不同的结合位点和结合途径可能是使IFN-α和IFN-β的生物学活性存在较大差异的原因。     

重组猪干扰素α的原核表达及抗病毒活性

为了探究重组猪干扰素(PoIFN-α)在体内外的抗病毒活性,利用pET-32a载体系统,构建了PoIFN-α的原核表达体系。在体外,MTT法在猪肾细胞(PK-15)和猪睾丸细胞(ST)上测定了其细胞毒性,并利用细胞病变抑制法测定其抗水泡性口炎病毒(VSV)、猪脑心肌炎病毒(EMCV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的活性,同时测定了重组蛋白作用PK-15细胞后干扰素刺激基因(ISGs)的转录水平;之后通过小鼠攻毒保护试验,测定了rPoIFN-α治疗后各组织器官的病毒载量,ELISA测定了小鼠血清中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-6的动态变化,并对整个试验期间小鼠出现的临床症状进行打分。结果显示,成功获得了原核表达的特异性重组蛋白rPoIFN-α,在细胞上抗病毒比活性达到1.67×10⁶ IU,对细胞没有损害作用,且显著上调了Mx1、OAS等因子的转录水平;在小鼠体内能明显拮抗EMCV和PRV的增殖,减少促炎因子的产生,延缓临床症状的出现。结果表明,原核表达重组蛋白rPoIFN-α在体内外均具有抗病毒活性,为进一步推进蛋白药物在临床上的应用奠定了基础。     

猪白细胞介素-2的原核表达及其生物学活性研究

本研究采用RT-PCR方法自刀豆素（Con A）刺激的猪外周血淋巴细胞总RNA中扩增克隆了猪白细胞介素-2（porcine interleutin-2,PoIL-2）成熟肽基因,并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的融合重组猪白细胞介素-2（rPoIL-2）蛋白通过尿素变性、低浓度复性液复性、PBS溶液透析等步骤进行纯化,采用MTT法测定rPoIL-2蛋白促小鼠细胞毒性淋巴样系CTLL-2株细胞增殖活性以评价rPoIL-2的活性。结果表明,成功克隆了rPoIL-2的成熟肽基因,基因全长405 bp,编码134个氨基酸;表达的rPoIFN-α蛋白分子质量大小约为16.5 ku,与预期大小相一致;经纯化后的蛋白质纯度在96%以上;纯化的rPoIL-2蛋白促小鼠CTLL-2株细胞增殖活性最高值是对照细胞的3倍。本研究成功表达了具有生物学活性的PoIL-2蛋白,为新型基因工程抗病毒制剂和免疫增强剂的开发奠定了基础。     

猪捷申病毒3D蛋白的原核高效表达及其反应活性

根据猪捷申病毒（PTV）Swine／CH／IMH／03株核苷酸序列，设计了1对特异性引物，以全长基因组重组质粒pSK—PTVFL为模板扩增了3D基因，并将扩增产物定向克隆到原核表达载体pET30a（＋）中，阳性质粒转化BL21（DE3），阳性菌经0．3mmol／L IPTG诱导后，进行Western—blotting检测。结果显示，3D蛋白获得了高效表达，表达量占菌体总蛋白的66．1％，且重组蛋白能与PTV Swine／CH／IMH／03株阳性血清发生特异性反应。表明，3D蛋白能在大肠杆菌中高效表达，并具有良好的免疫原性，这为开发相应的鉴别诊断技术奠定了基础。     

鸡α干扰素基因的原核表达及其活性测定

应用RT-PCR技术,从被刺激诱导的鸡脾脏淋巴细胞中扩增鸡α-干扰素(ChIFN-α)基因cDNA,经克隆和测序后,构建原核表达重组质粒pGEX-proChIFN-α(全长序列)和pET-ChIFN-α(不含信号肽序列),并分别转化相应的表达菌.重组菌经IPTG诱导,SDS-PAGE结果表明,ChIFN-α基因均获得表达,重组蛋白大小分别为45 ku、26ku左右,表达的蛋白以包涵体形式存在.表达产物经变性、提纯、复性,重组蛋白的含量约为1 mg/mL.复性后的ChIFN-α能够在鸡胚成纤维细胞上抑制H5N1禽流感病毒的复制;用水泡性口炎病毒检测结果表明,重组ChIFN-α具有较高的抗病毒作用,其生物学活性达到2×106 u/mg.     

猪白细胞介素-6的原核表达及其生物学活性研究

本研究采用RT-PCR方法自细菌脂多糖(LPS)刺激的猪脾脏细胞总RNA中扩增、克隆猪白介素-6(porcine interleukin-6,PoIL-6)成熟肽基因,并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的重组融合猪白介素-6(rPoIL-6)蛋白通过尿素变性、低浓度复性液复性、PBS透析等步骤进行复性、纯化,采用PoIL-6 ELISA试剂盒检测rPoIL-6蛋白与抗PoIL-6单抗发生特异性免疫反应的活性;采用MTS法检测rPoIL-6蛋白促猪脾脏细胞的增殖活性。结果表明,成功克隆了全长555 bp的PoIL-6成熟肽基因;表达的rPoIL-6蛋白分子质量大小约20 ku;纯化后的rPoIL-6蛋白纯度在95%以上,可和抗PoIL-6单抗发生特异性免疫反应,并且具有显著促猪脾脏细胞增殖活性。