日本血吸虫重组IAP蛋白的免疫保护效果评估

为研究日本血吸虫凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis protein of Schistosoma japonicum,SjIAP）重组蛋白诱导BALB/c小鼠的免疫保护效果,利用PCR技术扩增SjIAP基因,构建重组表达质粒pET-28a（＋）-SjIAP,诱导表达重组SjIAP蛋白,并利用重组蛋白制备兔源多克隆抗体血清。然后,选用SjIAP重组蛋白免疫BALB/c小鼠,利用ELISA检测免疫小鼠血清中的特异性抗体水平,以及免疫小鼠脾脏淋巴细胞在SjIAP重组蛋白刺激后产生的细胞因子水平。强化免疫后,将小鼠进行血吸虫尾蚴攻虫试验,感染38 d,进行剖杀,计算虫体减虫率及肝脏减卵率。Western blot结果表明本研究制备的兔源多抗血清能特异性识别SjIAP重组蛋白。ELISA检测表明免疫SjIAP重组蛋白可诱导较高水平的IgG及IgG亚型（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3）抗体和IFN-γ、IL-2及IL-4细胞因子。动物试验表明,免疫SjIAP重组蛋白的小鼠与PBS组相比分别获得了31.5%的减虫率和37.2%的肝脏减卵率。免疫SjIAP重组蛋白能诱导小鼠获得一定减虫和减卵保护效果,提示血吸虫凋亡蛋白抑制因子可作为抗血吸虫病的疫苗候选分子。     

日本血吸虫SjZFP1181-786 bp基因序列编码蛋白的免疫保护效果评估

根据日本血吸虫锌指蛋白SjZFP1的抗原位点预测结果，选取编码基因中抗原表位富集的181~786 bp核苷酸序列(SjZFP1-1)表达制备重组蛋白抗原rSjZFP1-1/His，构建重组真核表达质粒pcDNA-SjZFP1-1，并开展动物免疫实验，评估免疫保护效果。在两次独立的免疫实验中，与相应对照组相比，rSjZFP1-1/His单独免疫组以及pcDNA-SjZFP1-1与rSjZFP1-1/His联合免疫组均产生较高水平的特异性抗体，但平均虫负荷、肝脏虫卵数无显著性减少。研究结果显示rSjZFP1-1/His不能诱导有效的抗感染免疫，今后可进一步开展SjZFP1蛋白N-端肽段编码序列的表达和效果评估。     

日本血吸虫虫卵在BALB/c鼠肝脏各叶中的分布调查

为建立血吸虫虫卵计数的可准确量化和易于操控的小鼠肝脏取样方法,用日本血吸虫人工感染BALB/c系小鼠42 d后,将肝脏分成左叶、中央叶、右叶,分别进行日本血吸虫虫卵计数。结果显示,感染日本血吸虫42 d的BALB/c小鼠肝脏的平均重量为（2.23±0.26）g。左叶、中央叶、右叶和全肝的每克肝脏含卵数（EPG）分别为49.80×103±26.70×103,59.03×103±29.04×103、36.55×103±17.77×103和47.78×103±23.64×103。各肝叶之间差异有统计学意义（P〈0.05）。可见,血吸虫虫卵在肝脏各叶中的分布是不均匀的,以肝中央叶为最多,肝右叶最少。肝脏EPG与各肝叶中EPG符合线性关系,每对配对成虫对肝脏EGP的贡献从3.67×103到6.5×103个虫卵不等。     

日本血吸虫基因重组抗原rSj06868对小鼠的免疫保护效果

为克隆、表达日本血吸虫假想蛋白SJCHGC068068编码基因（暂命名为Sj06868）并观察重组抗原的免疫预防效果。应用PCR技术从日本血吸虫7 d童虫、14 d童虫mRNA反转录制备的cDNA中克隆到Sj06868基因的46-438 bp DNA片段,BLASTn分析未发现其他物种中的同源性序列,也未发现其保守序列和相关功能结构域。以pET32a为表达载体、Sj06868基因在大肠杆菌Rosetta（DE3）中获得高效表达,表达产物rSj068068分子量为36 kDa,能被感染血吸虫14 d兔血清识别。将纯化的重组抗原与佐剂ESSAI ISA 206 CELL混合后免疫BALB/c小鼠,与佐剂对照组和PBS对照组相比,分别获得了31.63%、29.19%减虫率以及55.63%、56.27%肝脏虫卵减少率。用ELISA检测各组血清中抗rSj068068特异性抗体结果显示,免疫组在攻击感染前、佐剂对照组和PBS对照组在感染后均产生了较高水平的特异性抗体。本研究结果说明,Sj068068是日本血吸虫特有的童虫期高表达基因,rSj068068在抗血吸虫疫苗和血吸虫感染的诊断方面均有潜在应用价值。     

日本血吸虫谷胱甘肽S－转移酶小鼠免疫试验

用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱纯化中国大陆株日本血吸虫成虫谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）。把纯化的ＧＳＴ结合福氏性剂免疫了二批达ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，获得了２９．５８～３２．７１％的减虫率和５２．９４～６８．１３％的粪便减卵率。ＥＬＩＳＡ试验表明免疫小鼠产生了体液免疫应答，免疫印迹试验（ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｔｉｎｇ）显示日本血吸虫水溶性成虫抗原和ＧＳＴ抗原的２６、２８ｋＤ蛋白被免疫小鼠血清所识别。     

日本血吸虫谷胱甘肽S—转移酶小鼠免疫试验

用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析柱纯化中国大陆株日本血吸虫成虫谷胱甘肽Ｓ－转移酶（ＧＳＴ）。把纯化的ＧＳＴ结合福氏佐剂免疫了二批ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，获得了２９．５８～３２．７１％的减虫率和５２．９４～６８．１３％，粪便减卵率，ＥＬＩＳＡ试验表明免疫小鼠产生了体液免疫应答，免疫印迹试验（Ｗｅｓｔｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）显示日本血吸虫水溶性成虫抗原和ＧＳＴ抗原的２８、２８ｋＤ蛋白被免疫小鼠血清所识别。     

IL-18增强日本血吸虫DNA疫苗Sj23的免疫保护效果

将小鼠IL-18基因和日本血吸虫Sj23膜蛋白基因分别插入pVAX1载体,构建真核表达质粒pVAX/mIL-18和pVAX/Sj23,联合或单独免疫小鼠,以pVAX1空载体作对照,免疫2次,间隔2周,2次免疫后4周攻击日本血吸虫尾蚴.体液和细胞免疫检测结果表明,联合免疫组能诱导小鼠产生较强的抗日本血吸虫成虫可溶性抗原(SWAP)IgG,较高水平的IFN-γ和IL-2.攻虫试验表明,联合免疫小鼠成虫减虫率和肝脏减卵率分别达41.6%和49.4%,明显高于pVAX/Sj23单独免疫组(减虫率和肝脏减卵率分别为26.5%和41.4%).以上试验结果表明,IL-18能明显增强Sj23 DNA疫苗在小鼠体内的免疫应答,并且产生较强的保护作用.     

日本血吸虫GSK3蛋白编码cDNA的克隆、表达及其重组蛋白的免疫保护研究

本研究利用生物信息学分析了日本血吸虫(Schistosoma japonicum,sj)Glycogen synthase kinase 3(GSK3)蛋白,并对其中一个GSK3蛋白的编码cDNA进行了克隆和原核表达,制备了特异性的多克隆抗体.同时,还初步评估了重组蛋白的免疫保护效果.生物信息学分析表明在日本血吸虫数据库存在两种GSK3蛋白,且其中一个SjGSK3在日本血吸虫不同发育时期均有转录.Western blot结果表明本研究制备的抗体能特异性识别日本血吸虫SjGSK3重组蛋白,表明该重组蛋白具有良好的免疫原性.动物实验表明免疫SjGSK3重组蛋白的动物与佐剂对照组比较分别获得了平均10.6％减虫率和40.5％肝脏减卵率.     

重组日本血吸虫抱雌沟蛋白诱导的免疫机制研究

应用大肠杆菌表达日本血吸虫抱雌沟蛋白（Schistosoma japonicum gynecophoral canal protein, SjGCP）。将重组蛋白rSjGCP与FCA、ISA206、ISA70M三种佐剂混合后免疫BALB／c小鼠,分析重组抗原诱导的免疫保护机制。用流式细胞术检测三次免疫后小鼠体内CD4＋、CD8＋T淋巴细胞亚群和IL-2、IL-4、γ—IFN、IL-10等细胞因子,应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗SjGCP特异性1gG抗体及其亚型lgG1水平。和空白对照组相比,GCP—FCA组和GCP-206组小鼠脾细胞中CD8＋T淋巴细胞比例显著下降,而GCP-70M组的CD4＋T淋巴细胞显著下降;GCP—FCA组、GCP-206组中IL-4、IL-10表达水平均显著上升;GCP—FCA组、GCP-206组、GCP-70M组血清中特异性IgG1亚型抗体含量显著升高。本研究为探讨重组日本血吸虫抱雌沟蛋白诱导的免疫保护机制积累了有价值的数据。     

日本血吸虫丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶基因的表达及其免疫保护试验

为研究日本血吸虫丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶（SjPP）的免疫功能，构建了原核表达重组质粒pET28a（＋）-SjPP，转化大肠埃希氏菌BL21（DE3）进行诱导表达，并用重组蛋白进行了小鼠免疫保护试验，免疫剂量为每次20μg／只，共免疫3次。结果表明，pET28a（＋）-siPP／BL21（DE3）在0．1mmol／L IPTG诱导2h时，每1g菌体可产生17．8mg以包涵体形式存在的重组蛋白；重组蛋白免疫小鼠后诱导产生了高效价的血清特异性IgG抗体，并获得了部分减虫率、肝组织减卵率和显著的粪便减卵率，具有一定的免疫保护作用。     

日本血吸虫含EF手性结构域分子序列的分析和初步鉴定

为分离鉴定日本血吸虫含EF手性结构域分子及分析其序列结构特征,首先找到含有EF—hand结构域的分子,按照序列一级结构进行分类,之后进行生物信息学分析。然后用PCR方法以虫卵和成虫cDNA文库为模板扩增分类后的分子,构建重组质粒,诱导蛋白表达并纯化,选取14个纯化蛋白用Western blot进行初步免疫原性鉴定。结果269个原始含EF-hand结构域分子按照序列一级结构分为70个;成功表达和纯化了49个含EF手性分子,进化树分析将其分为9类;Western blot显示,14个纯化蛋白均可被日本血吸虫感染小鼠阳性血清识别。本研究结果为下一步采用这类分子进行动物保护性效果评价以及保护性免疫机制的研究奠定了基础。     

日本血吸虫多价核酸疫苗的构建及免疫保护试验

利用PCR技术获得日本血吸虫GST抗原基因,通过分子克隆技术将GST、FABP基因克隆至pVAX1载体,并将其克隆至舍有Sj23基因表达核的plRESneo栽体,构建重组质拉pVAX-GST、pVAX-GST-FABP、pIRESneo-Sj23和pIRESneo-GST-FABP-Sj23.将50只昆明小鼠随机分成5组,每组10只,分别以肌肉注射质粒pIRESneo-GST-FABP-Sjz3、plRESneo-Sj23、pVAX-GST、pVAX-GST-FABP和空白质粒plRESneo,50μg/只,免疫2次,每次间隔21 d.测定小鼠免疫前后血清抗体水平,30 d经腹部皮肤感染血吸虫尾蚴,45 d后剖杀小鼠,计数各组小鼠虫卵数及成虫数.结果表明.重组质粒pVAX-GST、plRESneo-Sj23、pVAX-GST-FABP和pIRESneo-GST-FABP-Sj23均能诱导小鼠产生特异性的IgG抗体,plRESnecrGST-FABP-Sj23免疫组所诱导的IgG水平最高;减虫率分别为26.1%、30.8%、33.2%和47.5%,减卵率分别为25.4%、45.0%、48.4%和69.8%.pIRESneo-GST-FABP-Sj23的减卵率和减虫率明显高于其他DNA疫苗.结果表明,日本血吸虫多价核酸疫苗能产生较强的免疫反应,并能获得较好的免疫保护效果.     

日本血吸虫蛋白质组学研究

蛋白质组学是研究一种细胞、组织或完整生物体在特定时空上全部蛋白质及其存在方式的学科。近年来,应用蛋白质组学技术开展了日本血吸虫尾蚴、童虫、成虫蛋白质组,成虫性别差异和排泄分泌物蛋白质组,体被蛋白质组,与药物和诊断相关的蛋白质组等多方面的研究,增加了人们对日本血吸虫的生长发育、免疫逃避等机制的了解,为发掘血吸虫病疫苗、诊断和药物靶点提供了新的线索。     

猪链球菌2型三种重组表达蛋白对BALB/c小鼠的免疫保护性评价

将150只BALB/c小鼠随机分成5组。用猪链球菌2型pET32a-Sly、pET32a-38ku和pET32a-Sly-38ku表达的重组蛋白制备的疫苗,以及猪链球菌2型全菌灭活疫苗分别免疫A、B、C、D组小鼠,E组为生理盐水对照。首免后第2周加强免疫1次,二免后第2周,用致死量强毒猪链球菌2型四川分离株和江苏分离株以及马链球菌兽疫亚种安徽分离株攻毒,观察攻毒后对小鼠的免疫保护率。结果,A组与C、D组对猪链球菌2型感染的保护率差异显著（P〈0.05）,而C组与D组之间保护率无显著差异;A、B、C、D组之间对马链球菌兽疫亚种安徽分离株感染的保护率差异不显著;各免疫组的保护率极显著高于对照组。结果表明,3种重组疫苗具有良好的免疫原性,能对强毒株猪链球菌2型的攻击感染起到保护作用。     

编码日本血吸虫CIAPIN1 cDNA的克隆及其重组蛋白的原核表达

本研究利用生物信息学并结合分子生物学实验对日本血吸虫细胞因子诱导凋亡因子CIAPIN1（cytokine induced apoptosis inhibitor 1）基因进行了初步研究。研究表明日本血吸虫存在CIAPIN1同源基因,将其命名为SjCIAPIN1,SjCIAPIN1基因已知cDNA长1143 bp,包括完整的CDS,编码276个氨基酸,预测分子量为30.55863 kDa。通过原核表达系统对该蛋白进行了重组表达和纯化,并制备了多克隆抗体制备。Western blot分析表明,本研究制备的多克隆抗体能与SjCIAPIN1重组蛋白特异识别。     

日本血吸虫尾蚴分泌蛋白水解酶的初步研究

为了解日本血吸虫尾蚴转化为童虫过程中是否分泌蛋白水解酶，进行了日本血吸虫尾蚴在DSM培液中进行机械转化和尾蚴接种于复盖DSM培液液面的人工小鼠皮上进行自然转化时酶活性测定，测定应用酪蛋白溶液。结果证实日本血吸虫尾蚴转化为童虫过程中和新转化的童虫均能分泌一种蛋白水解酶。根据报道，曼氏血吸虫的这种酶起到钻透结缔组织的蛋白水解和促使尾蚴转化为童虫时糖萼脱落两个作用，并随之而起到抵抗免疫杀伤功能。说明日本血吸虫尾蚴和童虫，与曼氏血吸虫一样有这方面的功能。     

牦牛日本血吸虫Sjp38MAPK基因克隆、原核表达及免疫保护效果研究

为了分析牦牛日本血吸虫Sjp38MAPK重组蛋白的免疫效果,试验采用RT-PCR方法克隆出牦牛日本血吸虫Sjp38MAPK基因,构建重组表达载体pET-30a(+)-Sjp38MAPK,转化到BL21 (DE3)中,IPTG诱导表达,采用SDS-PAGE和Western-blot方法检测其蛋白的表达情况.结果 表明,获...