绵羊伪狂犬病病毒的分离鉴定及其gD基因序列分析

本研究以1例疑似绵羊伪狂犬病病例为研究对象,进行了病毒分离鉴定及其g D基因分析。将病料接种BHK-21细胞,细胞出现病变,经间接免疫荧光和荧光定量PCR检测结果证实,所分离的病毒为伪狂犬病病毒,将其命名为SH1311毒株。在电镜下观察病毒,病毒粒子呈球形,囊膜表面有大量纤突。对分离株g D基因进行PCR扩增、测序和序列分析,并与国内外伪狂犬病病毒株的同源性进行比较发现,该分离株与2012年以来上海市分离的猪PRV毒株g D基因的同源性最高,为99.8%~100%,而与2010年上海市流行毒株相比,同源性只有80.5%。构建的g D基因进化树显示,SH1311分离株与上海市2012~2015年间分离的7株猪伪狂犬病病毒以及国内JS-2012、HNB、HN1201、HLJ8、BJ/RD、ZJ01毒株属于同一个进化分支,亲缘关系最近,与欧美以及韩国的流行毒株都处在不同的分支上。     

猪伪狂犬病病毒ZY-2014株的分离与鉴定

从河南省某规模化猪场的死亡仔猪中分离到1株疑似猪伪狂犬病病毒,命名为ZY-2014株,并对其进行了PCR鉴定、g E基因序列分析、动物感染试验等鉴定。病毒经vero细胞培养可产生典型细胞病变,用Reed-Muench法测定病毒的滴度为107.4TCID50/100μL。分离病毒基因组DNA经过g D、g E、g G、三对特异性检测引物扩增后,均出现伪狂犬病毒特异性目的条带,分别为217 bp、636 bp、1440 bp。测序结果与预期结果相符。将ZY-2014毒株g E基因测序结果与10个新分离毒株、14个经典毒株进行同源性比对分析,其核苷酸及推导的氨基酸序列与国内2012年以来新分离毒株的同源性分别为99.6%~100%和99.1%~100%,与2012年以前分离毒株核苷酸及推导的氨基酸序列的同源性分别为97.7%~99.6%和95.7%~99.3%。遗传进化树结果显示,所分离的ZY-2014毒株与2012年以来新分离毒株同属一分支,与经典毒株分属不同进化分支。动物攻毒试验中,家兔和小鼠均出现明显的伪狂犬病临床症状。鉴定试验表明,分离株ZY-2014是一株猪伪狂犬变异毒株。     

猪伪狂犬病毒流行株的分离鉴定及其毒力试验

本研究采集了猪伪狂犬病阳性样品,通过PK-15细胞对PRV流行毒株进行了分离培养、纯净性检验、中和试验鉴定、遗传进化分析和仔猪毒力试验,对我国当前流行的猪伪狂犬病毒的遗传变异与毒力变化情况进行了分析。通过病毒分离鉴定共获得6株猪伪狂犬病毒,其中SCY1株、HBA1株、JXN1株存在支原体或PCV2污染,SCHS株、SCM1株、JXHS株无外源污染,并能被猪伪狂犬病毒特异性血清中和。6个分离毒株的gB基因片段与JS-2012株的同源性为99.7%～100%,与Bartha K61株的同源性约为95%;g C基因片段与JS-2012株的同源性为99.5%～100%,与Bartha K61株的同源性为90.7%～91.2%;gD基因与JS-2012株的同源性为99.8%～100%,与Bartha K61株的同源性在98.7%～98.9%之间;gE基因与JS-2012株的同源性在99.1%～99.8%之间。用3株纯净毒株感染8～9周龄PRV抗体阴性仔猪后全部出现体温升高,部分试验猪出现呼吸道症状并死亡。试验结果表明,本次分离的猪伪狂犬病毒与我国当前流行毒株的遗传关系接近,但不同毒株的毒力存在一定差异。     

猪伪狂犬病病毒FZ-2012株的分离鉴定及其gE基因的遗传演化分析

从福建省某猪场采集疑似猪伪狂犬病的病料接种PK-15细胞,通过PCR法、动物试验证实所分离的病毒为猪伪狂犬病毒(PRV),命名为FZ-2012,经测定该病毒株TCID50为10-9.40/0.1mL。根据Gen Bank已公布的PRV gE基因序列设计了1对特异性引物,将PCR扩增片段进行克隆测序,与国内外已发表的2012年以来15个新分离毒株、11个经典毒株进行同源性比对分析,并构建遗传进化树。结果表明:FZ-2012株gE基因序列全长1740 bp,编码579个氨基酸,与新分离毒株gE基因氨基酸序列的同源性为97.6%~99.3%,与经典毒株的氨基酸序列同源性为95.0%~98.6%;遗传进化关系表明,FZ-2012毒株与新分离毒株同属一分支,而与经典毒株分属2个不同分支。本研究首次报道福建省存在PRV新流行毒株,为丰富福建省猪伪狂犬病的分子流行病学和开发猪伪狂犬病新型疫苗奠定基础。     

北京1株犬源狂犬病病毒全基因组序列测定及分析

本试验旨在对北京1株犬源狂犬病病毒株(BJ2012ZW株)在全基因组水平上进行分子进化研究,比较与全国流行株及疫苗株之间的差异.试验采集犬脑组织以直接免疫荧光技术和内基氏小体检查方法进行检测,以RT-PCR扩增病毒核酸覆盖全基因组,对产物测序后进行遗传学分析.结果显示,BJ2012ZW株狂犬病病毒属于基因1型,与目前中国的主要流行株全序列同源性为83.9%~99.7%.与同样分离自北京的毒株BJ2011E和CNM1101C的核苷酸全序列同源性最高(99.7%),进化关系近.G蛋白主要抗原位点分析结果表明,BJ2012ZW株与国内疫苗株相比有部分抗原位点发生了替换.BJ2012ZW株属于中国目前的流行株,与目前国内所使用的疫苗株存在一定的差异.     

猪群混合感染伪狂犬病毒及乙型脑炎病毒的鉴定与分离

云南省文山市某规模化猪场2015年7~8月频繁发生以种公猪一侧睾丸肿大,母猪流产、产死胎、木乃伊胎及弱仔为主要临床症状的繁殖障碍疫情。为了查明病因,对送检流产胎猪进行病理解剖,采集胎猪及胎盘病料进行猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒欧洲型及美洲型毒株、猪细小病毒、伪狂犬病毒、乙型脑炎病毒、猪流产衣原体、布氏杆菌及弓形虫PCR和realtime PCR检测,同时应用猪肾原代细胞及BHK-21传代细胞进行病毒分离鉴定以及细菌分离鉴定。检测结果显示,从流产胎猪内脏器官、大脑及胎盘组织扩增出乙型脑炎病毒pr M基因及伪狂犬病毒g E基因目的条带。序列分析结果显示,扩增的乙型脑炎病毒pr M基因序列与NCBI Gen Bank中的参考毒株(Accession no.AB594829.1)序列同源性达99%;伪狂犬病毒g E基因核苷酸序列与NCBI Gen Bank中的参考毒株(Accession no.KT936475.1)序列同源性达100%。应用BHK-21传代细胞盲传分离获得1株可致细胞病变(cytopathic effect,CPE)的病毒株,鉴定为乙型脑炎病毒,并命名为JEV-2015-WS-YN。由此推测,引起此次猪群繁殖障碍极有可能为日本乙型脑炎病毒和伪狂犬病毒共同感染造成。     

一株猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定

为了解广东省猪伪狂犬病病毒（pseudorabies virus，PRV）野毒株的基因变异及遗传演化的情况，本试验对广东佛山疑似暴发伪狂犬病的猪场采集的病料（脑、肺脏、扁桃体、肝脏、脾脏）进行了PCR鉴定，初步鉴定为PRV毒株后，将阳性病料接种非洲绿猴肾细胞（Vero），进行毒株传代培养，对分离毒株进行PCR检测及小鼠感染试验，证实该病毒为PRV，并命名为PRV FS-2015株；并对该毒株进行细胞病变观察、病毒TCID₅₀测定、毒株gC和TK基因扩增及序列分析。结果显示，PRV FS-2015株TCID₅₀为10^-7.5/0.1 mL。PRV FS-2015株的gC和TK基因序列与国内外PRV参考毒株进行同源性比对分析发现，其核苷酸序列同源性分别为95.8%~100.0%和99.4%~100.0%，氨基酸同源性分别为92.3%~100.0%和98.7%~100.0%。遗传进化分析表明，PRV FS-2015株与国内近几年分离的PRV变异株GY、ZJ01、HB1201、HN1201、JS2012、BJ/YT和BP属于同一分支，同源性较高，亲缘关系更近；但与PRV经典株Kaplan、Becker、NIA3、Kolchis、Bartha、Yangsan、Min-A、SS和SL株的同源性较低，基因变异较大，表明PRV FS-2015毒株属于近几年流行的变异株。本研究结果可为广东省伪狂犬病的防控工作和疫苗株的选择提供科学依据。     

猪伪狂犬病病毒AH02LA株的分离鉴定及其对仔猪致病性研究

从安徽六安某爆发伪狂犬病猪场送检的流产仔猪脑组织样品中分离获得1株病毒,经鉴定为伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV),命名为PRV AH02LA株。PRV AH02LA株的糖蛋白g D和g I基因序列与2011年以来我国分离的变异株同源性最高(99.5%~100%),而与其他毒株同源性低。该分离株在BHK21细胞上增殖能力强,最高滴度达到109.0TCID50/m L。该分离株对4~5周龄和9~10周龄的PRV阴性猪能引起100%发病和死亡。临床上4~5周龄猪有严重的神经症状,也有明显的呼吸道症状;而9~10周龄猪主要表现呼吸道症状。说明本研究分离获得的PRV AH02LA是一株伪狂犬病毒变异株,其对仔猪的致病力较强。     

猪圆环病毒2型北京株的分离及基因组序列分析

为了解北京地区猪圆环病毒2型(PCV2)毒株的遗传变异特性,本研究对2010年病料中分离的2株PCV2通过PCR、IPMA进行初步鉴定,并扩增病毒全基因组,用DNAStar进行序列分析,用MEGA5进行PCV2ORF2序列比对,构建系统进化树。结果表明,分离得到的BJ2010LC株(登录号为JQ002671)、BJ2010PG株(登录号为JQ002672)2个PCV2毒株其全基因组长度均为1 767bp,与国内外参考毒株核苷酸序列同源性为94.2%～99.5%,2个分离株之间的核苷酸序列同源性为96.6%。BJ2010LC株属于基因型PCV2d,BJ2010PG株属于基因型PCV2b。     

伪狂犬病病毒FJ-2015株主要免疫原基因的遗传进化分析

为了解伪狂犬病病毒(PRV)变异株主要免疫原相关基因的序列遗传特征,本研究对PRV FJ-2015株g B、g C和g D基因进行克隆和测序分析。结果显示,FJ-2015株3个主要免疫原基因推导氨基酸序列与2012年以来国内新分离PRV变异株同源性较高,分别为99.7%~100%、99.6%~100%和98.5%~99.8%;而与国外分离株氨基酸同源性较低,分别为96.9%~97.5%、93.1%~93.3%和97.3%~98.8%,其中与疫苗株Bartha-K61同源性最低,为96.9%、93.1%和97.3%;氨基酸比对显示,与经典病毒株相比,该病毒株发生多个位点的一致性替换、插入或缺失,并处于重要的抗原表位区;遗传进化关系表明,该病毒株g B基因遗传演化与分离时间和分离国家相关,g C基因显示遗传多样性,而g D基因具有一定的福建区域性遗传演化关系。以上结果表明,PRV FJ-2015属于PRV变异株,与其它分离株存在一定的遗传差异。本研究丰富了猪PRV流行的分子特征。     

一株猪伪狂犬病病毒变异株的分离鉴定

为了解广东省猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒株的基因变异及遗传演化的情况,本试验对广东佛山疑似暴发伪狂犬病的猪场采集的病料(脑、肺脏、扁桃体、肝脏、脾脏)进行了PCR鉴定,初步鉴定为PRV毒株后,将阳性病料接种非洲绿猴肾细胞(Vero),进行毒株传代培养,对分离毒株进行PCR检测及小鼠感染试验,证实该病毒为PRV,并命名为PRV FS-2015株;并对该毒株进行细胞病变观察、病毒TCID50测定、毒株gC和TK基因扩增及序列分析。结果显示,PRV FS-2015株TCID50为10-7.5/0.1mL。PRV FS-2015株的gC和TK基因序列与国内外PRV参考毒株进行同源性比对分析发现,其核苷酸序列同源性分别为95.8%~100.0%和99.4%~100.0%,氨基酸同源性分别为92.3%~100.0%和98.7%~100.0%。遗传进化分析表明,PRV FS-2015株与国内近几年分离的PRV变异株GY、ZJ01、HB1201、HN1201、JS2012、BJ/YT和BP属于同一分支,同源性较高,亲缘关系更近;但与PRV经典株Kaplan、Becker、NIA3、Kolchis、Bartha、Yangsan、Min-A、SS和SL株的同源性较低,基因变异较大,表明PRV FS-2015毒株属于近几年流行的变异株。本研究结果可为广东省伪狂犬病的防控工作和疫苗株的选择提供科学依据。     

猪伪狂犬病病毒NP株gE、gI基因的克隆及序列分析

根据GenBank中已发表的猪伪狂犬病病毒(PRV) gE、gI基因的序列设计了2对引物,对PRV NP株的gE、gI基因进行了PCR扩增、回收、克隆、测序,测序结果与预期的PRV gE、gI基因片段相符。同源性比对分析结果显示,PRV NP株gE、gI基因推导的氨基酸序列与国内分离的PRV毒株的同源性分别为95.7%~99.8%、89.9%~99.5%。遗传进化树分析和氨基酸序列比对结果发现PRV NP株的gE氨基酸序列发生变化的位点与2012年国内分离到的PRV流行株相同,从而推测NP株为PRV变异毒株,本研究为PRV的流行病学调查分析奠定了基础,也为开发科学、有效的新型猪伪狂犬病(PR)疫苗提供科学依据。     

山东某猪场一起猪伪狂犬病的诊断与控制

从疑似发生猪伪狂犬病(PR)的山东某猪场中,采集流产母猪的血清及发病仔猪和死胎等样品,进行实验室血清学和病原学检测。检测结果是:流产母猪血清PRV-g E抗体检测阳性率为100%(12/12);同群表现正常母猪血清g E抗体阳性率100%(10/10)。病料提取DNA的g E-PCR检测阳性率为80%(8/10);同时从阳性病料中分离到猪伪狂犬病病毒SD2015,对分离株g B、g C、g E、TK、RR1和RR2基因进行测序发现,该分离株与Ea株和Bartha株的g B基因同源性分别为99.5%和98.1%,且与我国近年分离的PRV毒株同源性高,亲缘关系近。此外,该场分离株与我国2012年以来流行毒株在g C、g E、TK、RR1和RR2基因序列同源性在99.3%~99.9%。结合临床表现,可确诊该场发生了猪伪狂犬病。使用伪狂犬病疫苗(HB98株)紧急接种,1个月后,疫情得到有效控制。     

猪伪狂犬病毒SD株的分离鉴定及TK基因序列分析

从山东某猪场送检的肺、脾脏、肾等病料中分离出1株病毒,经鸡胚成纤维细胞接种、病毒中和试验、PCR扩增试验证实分离的病毒为伪狂犬病毒(PRV),并命名为SD株。根据GenBank已公布的PRV胸苷激酶(TK)基因序列设计了1对引物,对SD株的TK基因进行PCR扩增及序列测定,并比较了该序列与国内外8个PRV毒株的同源性。结果表明,扩增的SD株TK基因片段全长1 139 bp,包含一个963 bp的开放阅读框,编码320个氨基酸组成的多肽;SD株TK基因与国内外8个PRV毒株序列相比,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.1%～99.7%和97.6%～99.7%;另外SD株TK也具有疱疹病毒胸苷激酶催化结构域的保守氨基酸共有序列和亚结构域特征序列;通过猪伪狂犬病毒TK基因与鸡、牛、猫科、马科、人类疱疹病毒的TK基因进化分析可知,猪伪狂犬病毒TK基因与哺乳动物疱疹病毒亲缘关系较近,而与禽类的亲缘关系相对较远。     

潍坊某猪场一起伪狂犬病的诊治

2014年9月山东潍坊某猪场发生疑似猪伪狂犬病疫情,采集病死仔猪的脑组织等,利用Vero细胞做病毒分离,并设计一对伪狂犬病病毒(PRV)g E基因片段的特异性引物对分离病毒进行PCR鉴定及家兔接种试验。结果表明:脑组织上清液接种Vero细胞后有典型的细胞病变;PCR扩增产物电泳后显示出990bp长的目的片段,目的片段基因序列与6株PRV毒株的g E基因序列核苷酸同源性在97.7%~100%之间,证实该病毒为PRV;分离病毒接种家兔出现典型的伪狂犬病症状。临床诊断结合实验室鉴定以及动物接种试验,确诊该病例为猪伪狂犬病。     

伪狂犬病病毒BJ/YT株毒力相关基因gE和TK序列分析

本试验对2012年从北京地区约克夏犬体内分离得到的伪狂犬病病毒(PRV)BJ/YT株主要毒力基因gE和TK的分子特征和进化关系进行了分析。结果显示,BJ/YT株gE基因与参考序列的核苷酸和氨基酸同源性分别为98.9%～100.0%和98.3%～100.0%;TK基因核苷酸和氨基酸同源性分别为99.2%～99.9%和99.0%～100.0%。BJ/YT株与同期河北猪源分离株进化关系较近,各毒株之间同源性高,并且存在一致的核苷酸突变位点;与其他参考序列比对分析结果显示,BJ/YT株主要毒力基因存在变异位点,但这些位点均不在已知的主要功能区和抗原表位区内。因此,从分子流行病学角度来看,BJ/YT毒株是近年北京及其周边地区PRV流行毒株,但gE和TK基因的变异对流行毒株的毒力无明显影响。     

一株猪捷申病毒的分离与鉴定

北京地区某猪场猪群疑似感染猪捷申病毒(porcine teschovirus,PTV),为了分离与鉴定该病毒,从采集的脑组织样品中分离出病毒,并从病毒中提取总RNA,根据已报道的引物序列,经RT-PCR扩增得到部分编码主要结构蛋白的VP1基因和高度保守的5'-UTR区基因序列,将这些基因克隆到pEASY-Blunt载体中,经序列测定,与GenBank上的毒株序列进行比对。试验结果表明,分离的毒株与猪捷申病毒同源性为95%~100%。本试验成功分离获得一株猪捷申病毒北京地方流行毒株,命名为 10BJ02株。     

2012-2014年河南省猪伪狂犬病病毒gE基因和TK基因的遗传变异分析

为了解河南地区猪伪狂犬病病毒(PRV)流行株的遗传变异情况,本研究对2012-2014年14株河南PRV分离株的2个主要毒力基因gE和TK进行扩增、克隆测序和遗传进化分析。结果显示:14株河南分离株的gE基因氨基酸同源性为95.7%~99.8%,与2012年之前国内分离的毒株同源性较低(96.6%~98.9%),并在多个部位存在碱基的插入与替换,与2012年之后中国流行的毒株的同源性较高(除XX1外同源性为98.7%~99.5%);14株TK基因的氨基酸同源性为98.1%~100.0%,与疫苗株Bartha株同源性为98.1%~99.4%,与2012年之后流行株的氨基酸同源性为98.4%~99.7%。进化树分析显示:PRV流行毒株gE基因和TK基因均可分为3个群,与国内分离的大多数毒株同处于基因1群。分析结果表明:14个分离株与ZJ-01株、TJ株亲缘关系较近,与Ea株、Min-A株、LA株次之,与Becker株、Kaplan株和P-Prv株亲缘关系较远。TK基因较为保守,gE基因存在很多点突变,提示可能是当前流行毒株毒力增强从而导致当前疫苗免疫保护力下降的主要原因。     

陕西省部分地区猪圆环病毒2型全基因组的遗传变异分析

为了解陕西省猪圆环病毒2型(PCV2)的遗传变异情况,根据GenBank登录的PCV2全基因组序列,设计1对引物,从陕西省部分地区规模化猪场疑似PCV2感染的病猪采集病料9份,应用PCR扩增PCV2的全基因,其中6份为阳性,并对扩增的6个PCV2全基因组序列进行测序和序列分析。基因测序表明,PCV2基因组全长为1 767bp;对6株病毒序列进行同源性比较,6个毒株全基因之间核苷酸同源性为98.3%~100%,与GenBank上已发表的国内外毒株全基因组比较,同源性为96.3%~97.8%;与近几年陕西株比较发现基因变异程度不稳定,与2013年分离株(KX352154.1)同源性最高,2015年分离株(KX352159.1)次之,反而与2014年分离株(KX068219.1)最低;对6个毒株的ORF1和ORF2基因进行同源性比较,6个毒株的ORF1和ORF2基因的核苷酸同源性分别为98.1%~100%和98.2%~100%,与GenBank上已发表的国内外参考株ORF1和ORF2基因进行同源性比较,同源性分别为97.6%~99.8%和91.5~96.0%。陕西省流行的PCV2基因组较为保守,变异不大,同源性很高。     

2013~2018年江西省猪伪狂犬病病毒流行株gE和gB基因遗传变异分析

为掌握江西省猪伪狂犬病病毒（PRV）的分子流行病学及遗传变异情况,本研究运用实验室已建立的PCR方法对2013~2018年采集自江西南昌、宜春、赣州、吉安、九江、上饶、抚州、新余8个地区的PRV阳性猪病料进行gE和gB基因扩增,并对PCR产物进行测序和序列分析。结果显示,共获得64株PRV的gE基因序列和12株PRV的gB基因序列;gE基因遗传进化树表明,64株PRV同属一个大分支,与亚洲毒株及近年来国内分离株亲缘关系较近,全部为GⅠ型,而与GⅡ型的欧美经典毒株亲缘关系较远;江西毒株gE基因与19株参考毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.2%~100%和94.6%~100%;gB基因与11株参考毒株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为98.2%~100%和96.5%~100%;相较于Bartha-K61疫苗株,江西流行毒株的gB基因存在碱基缺失、插入和位点突变现象。本研究从分子流行病学角度证实了江西省PRV的流行与变异情况,为江西省科学防控PRV提供理论依据。