河北省2010年猪繁殖与呼吸综合征病毒的遗传变异分析

为了解2010年河北省猪繁殖与呼吸综合征病毒变异趋势,用RT—PCR方法对2010年河北省发病猪场的病料进行PRRSV Nsp2和0RF5基因扩增、克隆和测序,利用DNAStar软件对所测序列进行分析。结果显示,扩增的Nsp2基因氨基酸序列相似性为91．4％～98．8％,与GenBank中参考毒株的氨基酸序列相似性为6...     

8株猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的变异分析

本研究拟初步了解中原地区近期猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况。对2011—2012年间从河南及周边省份发病猪场分离的8株PRRSV毒株Nsp2基因变异区进行RT-PCR扩增,同时对主要结构蛋白GP5基因进行克隆测序并与GenBank中登录的中国历年来流行的PRRSV代表毒株的GP5蛋白序列进行遗传进化分析,对主要氨基酸基序进行比对分析。结果表明,2011—2012年在中原地区分离的8株PRRSV分离株均为Nsp2缺失变异株,GP5基因与2006年中国高致病PRRSV代表毒株JXA1同源性较高。     

PRRSV山西株ORF5和Nsp2基因序列分析

采用RT-PCR方法对2009—2011年山西省分离的5株猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的ORF5和Nsp2（2503～3269nt）基因进行克隆和测序,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外毒株进行了同源性分析。序列分析结果显示,5株分离株Nsp2基因与国内分离的PRRSV变异株（JXA1、HuN、HUN4、HUB1）的序列同源性最高,为96．8％～98．2％,且缺失位置一致,均存在2个位点30个氨基酸缺失;ORF5基因大小为603bp,编码200个氨基酸,第13、151位均为具有强毒特性的精氨酸（R）,137位为丝氨酸（S）,表明这5株均为野毒株,与国内分离的PRRSV变异株（JXA1、HuN、HUN4、HUB1）毒株的序列同源性最高,为96．5％～98．0％。结果表明,山西省内目前流行的PRRSV为Nsp2缺失30个氨基酸的变异毒株。     

PRRSV YN-LQ株的全基因序列测定及遗传进化分析

从云南省某发病猪场分离到1株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),将该毒株命名为YN-LQ株。为了研究该毒株的遗传变异及分子生物学特征,根据PRRSV标准毒株NCBI登录号KC422728设计10对引物,对YN-LQ株全基因进行扩增及测序,将测序结果依次拼接获得YN-LQ株的全基因序列,并进行序列的比对分析。结果显示:PRRSV YN-LQ株基因组全长为15 320bp;将YN-LQ株与经典PRRSV病毒株Nsp2、GP5及全基因进行比对分析,发现YN-LQ株与JXA1的同源性最高。Nsp2基因序列同源性为99.0%,其氨基酸序列有15个位点发生了改变;GP5基因序列同源性为97.7%,其氨基酸序列有9个位点发生了改变;全基因的同源性为98.7%。证实该毒株为JXA1变异株,为深入研究该病毒株的遗传与变异及其与生物学特性的关系奠定了基础。     

2014年-2016年广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2和ORF5基因的遗传多样性分析

为了解广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传进化情况,对2014年-2016年来自广西各地的部分PRRSV阳性病料进行Nsp2和ORF5基因的扩增和测序分析.结果获得34个Nsp2基因序列和45个ORF5基因序列,均属于美洲型毒株.Nsp2基因间核苷酸序列的同源性为91.8％~100％,与PRRSV美洲型毒株VR-2332、CH-1a、JXA1及NADC30株核苷酸序列的同源性分别为81.3％~84.3％、88.9％~92.1％、94.3％~99.3％和73.5％~75.1％,而与PRRSV欧洲型毒株LV株核苷酸序列的同源性为51.5％~53.2％.ORF5基因间核苷酸序列的同源性为82.8％~100％,与PRRSV美洲型毒株VR-2332、CH-1a、JXA1及NADC30株核苷酸序列的同源性分别为83.7％~99.5％、85％~95％、83.8％~99.7％和83.2％~86.4％,而与PRRSV欧洲型毒株LV株核苷酸序列的同源性为62.4％~64.5％.基于Nsp2和ORF5基因推导的氨基酸序列绘制的遗传进化树中,广西地区的毒株主要分布在以JXA1为代表的Ⅳ亚群.表明当前广西PRRSV流行毒株以JXA1株为代表的高致病性美洲型毒株为主,各毒株Nsp2和ORF5基因序列存在一定的差异,尚未发现欧洲型毒株和美洲型NADC30类毒株.     

PRRSV流行株Nsp2、ORF5和ORF3基因序列的分析

采用RT-PCR方法扩增2006年--2007年从江西、湖南、海南、广东等4省的不同猪场病猪体内分离的11株猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）流行株的Nsp2、ORF5和ORF3基因,并进行序列分析。结果表明,11个PRRSV流行株的Nsp2均发生30个氨基酸的不连续缺失,缺失位置与JXA1毒株相同;11个PRRSV流行株的ORF5、ORF3基因和JXA1相应序列的核苷酸同源性分别为99．2％～99．8％、99．1％～99．6％,氨基酸同源性分别为98．0％～99．5％、98．4％～99．6％;11个PRRSV流行株之间ORF5基因的核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为98．8％～100．0oA、98．0oA～100．0％,其中5个流行株的ORF3基因的核苷酸和氨基酸同源性分别为99．0％～99．6％、98．8％～99．69,6。根据Nsp2所建立的遗传系统发育树可知这11个PRRSV流行株与JXA1株的亲缘关系很近。     

四川省猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查

为了解2012-2013年四川省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异背景和分子流行病学情况,对PRRSV阳性病料中的Nsp2、ORF5基因进行RT-PCR扩增和序列测定,所获得的序列分别与美洲型代表株(VR2332)、欧洲型代表株(LV)、标准毒株和变异毒株进行相似性分析。结果本研究成功获得8条Nsp2基因序列和17条ORF5基因序列,序列分析表明所有PRRSV流行毒株均属于美洲型,其中8株Nsp2基因序列与标准毒株和变异毒株的核苷酸相似性分别为75.2%~88.6%和94.8%~97.1%,推导的氨基酸相似性分别为58.7%~79.2%和92.8%~94.8%;17株ORF5基因序列与标准毒株和变异毒株的核苷酸相似性分别为90.1%~96.6%和95.6%~99.4%,推导的氨基酸相似性为77.2%~93.0%和88.0%~96.8%;与标准毒株相比,8株Nsp2基因有30个不连续氨基酸缺失,17株ORF5基因序列有点突变。从遗传进化分析看,所有流行毒株均属于PRRSV亚群Ⅲ。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒江苏分离株ORF5及Nsp2基因部分序列分析

对2006—2007年分离于江苏省部分发病猪场的PRRSV,采用RT-PCR技术,进行ORF5基因序列以及Nsp2基因部分序列的扩增、克隆并测序。应用DNAStar软件将测序结果与已发表的国内外参考毒株进行比对分析。结果表明,分离的21株病毒ORF5基因大小均为603bp;与国内分离株之间同源性为87.7%～97.0%,与国外美洲型分离株同源性为85.6%～90.5%;21株PRRSV分离株与欧洲型毒株之间的同源性仅为54.1%～56.6%。14株用于扩增Nsp2基因部分序列的PRRSV在全基因组第2778～2780位及第2947～3033位分别缺3个和87个碱基,其中的2个江苏扬州分离株在第2747～2836位又缺失了90个碱基;14个毒株之间同源性为93.2%～99.0%,与VR-2332相比同源性为74.9%～78.5%,与国内河北、河南等地2006年的PRRSV分离株相比同源性为94.1%～99.1%。     

2007-2010年河北省部分地区猪繁殖与呼吸综合征分子流行病学

为了弄清河北省秦皇岛、唐山、廊坊、邯郸等部分地区流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的ORF5和Nsp2基因变异情况,对采自以上地区在2007—2010年期间的临床发病猪肺组织,提取其RNA,通过RT—PCR扩增样本中PRRSV的ORF5和Nsp2基因,对目的基因测序,并以VR-2332、CH—la、MLV、LV、HB-1、HB-2、JXA1、HUB1、HEB1等毒株为参考序列,进行序列分析和进化树分析。扩增出42个ORF5基因,14个Nsp2基因,通过完整的ORF5和部分Nsp2基因序列比较分析发现所有毒株均为美洲型,且大多数毒株与国内2006—2007年间分离的JXA1、HUB1、HEB1等高致病力毒株同源关系很近。42个ORF5基因编码的氨基酸序列分析表明GP5蛋白的糖基化位点数量和位置已发生变异,主要中和表位存在氨基酸变异（L／F^35→I^39）,与毒力相关的13位和151位点为强毒株的氨基酸特性（R^13、R^151）。14个Nsp2基因推导的氨基酸系列比较发现,1株PRRSV Nsp2基因未发生缺失突变,而剩余的13个毒株Nsp2基因均发生了氨基酸缺失,在481位和532～560位2处分别缺失1和29个氨基酸。系统发育进化树结果显示河北部分地区流行株分为2个小分支,1个毒株与HB-1聚为1支;河北流行株的大多数毒株在另一个分支,与高致病力毒株JXA1等聚为一支。本研究结果揭示了河北省部分地区流行的PRRSV ORF5和Nsp2基因的变异特征,丰富了河北省的PRRSV分子流行病学资料,提示要针对ORF5和Nsp2基因的变异采取PRRSV的防控措施。     

猪流产胎儿中猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测及GP5抗原分析

河南某规模化猪场,按照每年4次高致病性猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗免疫接种,2016年11月,妊娠后期母猪陆续产死胎。为确诊病因,采集死产胎儿肺脏组织,采用RT-PCR方法,扩增PRRSV NSP2基因部分片段(根据产物片段大小,能区分高致病性与经典毒株)和ORF5全长基因,结果显示,NSP2片段扩增大小约为418bp,表明检测毒株是高致病性PRRSV毒株;ORF5全长基因扩增结果,与预期大小片段一致。为分析猪繁殖与呼吸综合征疫苗免疫失败的原因,利用DNA Star软件,将检测毒株ORF5基因序列与其他17种PRRSV毒株ORF5基因序列构建遗传进化树,并对检测毒株与其他9种高致病性PRRSV毒株ORF5基因推导的氨基酸序列进行分析、比较及GP5抗原性分析。结果显示,ORF5序列分析表明,检测毒株与2015年福建分离毒株FJYR、河南分离毒株TJbd14-2同源性最高,分别为97.2%和97.0%,与美洲型经典毒株VR-2332同源性为87.7%,与欧洲型毒株Lelystad virus、NMEU09-1亲缘关系最远,分别为62.8%和62.6%;根据ORF5DNA序列推导氨基酸序列分析表明,与其他9种高致病性PRRSV毒株相比,从病料中检测毒株的GP5共有13个位置发生变异;GP5抗原指数分析表明,第30-40、51-63位抗原性,相比其他9种高致病性PRRSV毒株显著降低,据此推测这是导致免疫失败的根本原因,导致该猪场母猪流产的病原为一种变异的美洲型高致病性猪繁殖与呼吸综合征毒株。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒国内分离经典株与变异株的全基因组序列分析

通过分段设计引物,对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)LX、JX株基因组进行RT-PCR扩增,对各片段cDNA进行克隆和序列测定,拼接后获得全基因组序列。结果,PRRSV LX株全基因组序列长度为15 412 bp(不包括PolyA尾),PRRSV JX株全基因组序列长度为15 320 bp(不包括PolyA尾)。序列分析表明,JX株全基因组核苷酸序列与LX株、JXA1、VR2332、CH-1a、BJ-4、LV同源性分别为91.1%、98.6%、91.0%、94.6%、90.9%、61.7%;LX株全基因组核苷酸序列与JX株、JXA1、VR2332、CH-1a、BJ-4、LV同源性分别为91.1%、89.7%、99.7%、91.5%、99.7%、62.2%。对不同分离株的5′-UTR、Nsp2进行了序列比较,并根据5′-UTR、Nsp2、ORF5的基因序列和氨基酸序列,对国内外分离株进行了系统进化分析。根据5′-UTR核苷酸序列,可将PRRSV美洲型毒株分为4个亚群,LX株和JX株分别属于经典美洲型和"高热病"变异型。根据Nsp2氨基酸序列分析了不同分离株的分子进化关系,表明依据Nsp2序列美洲型分离株可初步划分为5个亚群,JX株独立于其他毒株,独自处于一个分支。依据ORF5序列也可将美洲型分离株划分为5个亚群。本研究为探讨PRRSV的分子进化奠定了基础。     

2株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒分子特征分析

为进一步掌握黔西南州猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）流行变异趋势,对2株高致病性PRRSV（HR-PRRSV）贵州分离株GZLPS、GZSB进行Nsp2与GP5基因克隆和测序,并分析毒株分子变异特征。结果显示,2株分离株Nsp2基因有90个核苷酸不连续缺失,不同位置的36个核苷酸发生突变;GP5基因存在不同位点置换。同源性比对与系统进化树分析显示,2株分离株Nsp2与GP5基因与HP-PRRSV JXA1株及贵州省2011年以前流行毒株的核苷酸同源性在96%以上,氨基酸同源性在95%以上,但在分子变异上存在差异。结果表明黔西南州PRRSV变异方式已呈多样性。     

一株针对猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30-like毒株GP5蛋白的单克隆抗体的制备及鉴定

为获得针对猪繁殖与呼吸综合征病毒NADC30-like毒株GP5蛋白的单克隆抗体,采用表达纯化的PRRSV NADC30-like毒株的GP5蛋白按常规方法免疫小鼠,采用间接免疫荧光方法筛选出1株阳性杂交瘤细胞（命名为3E10）,经3次亚克隆后制备腹水并进行纯化鉴定。结果显示：该杂交瘤细胞连续传代20代后细胞上清液的IFA效价仍不低于1:40。纯化后的单克隆抗体腹水浓度为0.204 mg/mL,亚类鉴定为IgM,且未发现有中和活性。特异性检测显示3E10单克隆抗体能与2株PRRSV NADC30-like毒株发生荧光反应,而与4株高致病性PRRSV疫苗毒株、2株经典株PRRSV疫苗毒株以及CSFV、PCV2、BVDV及Marc-145细胞均无荧光反应,显示出较好的应用前景。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株FS的分离鉴定与全基因组序列分析

从一例疑似高致病性猪繁殖与呼吸综合征病例中分离到一株病毒,经全基因组测序分析可知此毒株在Nsp2部位发生了30个氨基酸的缺失,GP5蛋白相对保守。本毒株与VR-2332同源性达到88.7%,与欧洲型代表株LV株的核苷酸同源性为58.5％,与国内报道的JN-HS毒株相似性最大,核苷酸同源性达到98.8%。     

Complete Genome Comparison and Analysis between Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Parental and Its Attenuated Strains

To study the attenuation molecular basis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV),whole genomes of PRRSV JXA1-5 (parental strain) and JXA1-86 (attenuated strain) were sequenced,compared and analyzed.And genomic sequences of JXA1/JXA1-86 were compared with the other two pairs of virulent parental/attenuated vaccine strains.The results showed that there was higher amino acid mutation rate in structural proteins among the three pairs of strains indicating that PRRSV JXA1 strain virulence changes were more related to structure proteins variations.Compared with JXA1,the amino acids encoding Nsp5,Nsp6,Nsp8,Nsp12,M and N proteins of JXA1-86 strain did not change,suggesting that virulence attenuating might not be relevant to those proteins.The genomic sequences of each generation PRRSV sequence were compared and analyzed,and the results showed that the variations among A₉₂₈V,I₁₁₅₅M,E₁₆₂₉D in ORF1a,I₁₁₈V in GP2,H₇₉N in GP3,I₁₂₄V in GP4 and K₅₉N in GP5 between 70th and 86th generations were found,which turned out that virulence attenuating might be associate with those variations.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒强弱毒株全基因序列比对分析

为了解猪繁殖与呼吸综合病毒（PRRSV）致弱的分子学基础,对PRRSV JXA1株第5代（强毒）与第86代毒株（致弱毒）进行全基因组测序,将JXA1原始毒株和JXA1致弱毒株与其他2对PRRSV原始毒株/弱毒疫苗株进行基因序列比对分析。结果显示,这3对毒株（1对JXA1原始毒株/致弱毒株、2对PRRSV原始毒株/弱毒疫苗株）中结构蛋白的氨基酸突变率较高,表明毒力的改变与结构蛋白的改变关系更大;将JXA1株与JXA1-86株序列比对分析,发现编码Nsp5、Nsp6、Nsp8、Nsp12、M、N蛋白的氨基酸未发生变化,表明JXA1株毒力的降低可能与这些蛋白无关;将各代次PRRSV序列比对分析,发现在第70代到第86代序列之间,ORF1a中A₉₂₈V、I₁₁₅₅M、E₁₆₂₉D,GP2中I₁₁₈V,GP3中H₇₉N,GP4中I₁₂₄V,GP5中K₅₉N发生了改变,表明其毒力的减弱可能与以上几处变异有关。     

1株类NADC30与类JXA1重组的猪繁殖与呼吸综合征病毒基因组遗传特征分析

旨在分析本实验室2017年从临床病料中分离的1株猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）的分子遗传特征,测定了其全基因组序列,并运用生物信息学软件对其遗传特点进行了分析。结果显示,该毒株基因组全长15 054 bp,与代表性毒株VR-2332、NADC30、CH-1a、JXA1和QYYZ的核苷酸相似性分别为84.5%、93.4%、84.2%、83.9%和82.1%。系统进化树分析显示,该毒株与NADC30-like毒株处于同一进化分支,属于lineage 1。基于GP5和Nsp2蛋白的氨基酸序列分析显示,分离株GP5蛋白糖基化位点位于34位、44位和51位;在37-45 aa的线性表位区较为保守,在27-30 aa和37-45 aa的线性表位区存在特异的氨基酸位点变异;Nsp2蛋白存在NADC30-lke毒株特征性的131个（323-433位、483位、504-522位）不连续氨基酸的缺失。基因重组分析显示,该毒株以类NADC30为主要亲本、以类JXA1为次要亲本,在Nsp2的氨基端（1 340-2 082 nt）发生了基因重组。本研究成功绘制了1株NADC30-like毒株的基因组遗传特征,确定了其在Nsp2区域发生了基因重组,提示PRRSV通过基因重组在不断发生遗传演化,开展持续的PRRSV流行及遗传变异监测对于该病的防控具有重要意义。     

一株类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离及遗传变异分析

为了解广西地区的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的遗传变异及流行情况,本实验室从广西某发病猪场采集到的猪肺脏组织中检测到1株PRRSV,命名为GXNN1839,并对该毒株进行病毒的分离鉴定、GP5和Nsp2的测序分析.结果 显示:该毒株可在PAM细胞上分离增殖,有明显的细胞病变,通过IFA试验可以检测到细胞内PRR...     

PRRSV分离株Nsp2基因和ORF5基因的遗传变异分析

为了解山东省PRRSV流行毒株的遗传变异情况和分子流行病学背景,对2007~2009年分离到的14株山东省内的PRRSV流行毒株进行了Nsp2和ORF5基因序列的测定和分析。结果显示,与参考毒株JXA1相比,14株PRRSV Nsp2与ORF5基因的核苷酸同源性分别达到96.1%~99.8%和98.0%~99.8%,氨基酸序列同源性分别达到92.9%~100%和97.5%~99.5%。序列分析结果表明,14株毒株在Nsp2蛋白内部均存在编码30个氨基酸的碱基对的不连续缺失;ORF5基因编码的GP5蛋白不存在缺失,但存在点突变。遗传进化分析表明,07年分离毒株JQ与参考毒株JXA1亲缘关系很近;09年分离的12株PRRSV,2株仍与国内2006~2007年间的分离株在同一分支,9株已经处在不同分支,1株单独处在一个分支。2007~2009年山东地区流行的PRRSV分离株具有年度特征,无明显的地域特征。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒HuN4株致弱毒株特异性抗原表位的鉴定

通过对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virtls,Hp-PRRSV）HuN4株亲本毒及其不同代次传代毒株Nsp2（Nonstnduralprotein2）蛋白氨基酸序列比较分析,发现不同代次的Nsp2蛋白存在4处氨基酸点突变,针对每个突变点分别人工合成编码短肽的核苷酸序列,经原核表达后进行Western blot分析。结果表明表达的融合蛋白F65-11（^749KGEPvsdqpak^759）能够特异性的与HuN4-F40、HuN4-F65和HuN4-F112感染猪的血清发生反应,而与HuN4 F5感染猪的阳性血清和CH-1a株阳性血清不发生反应,证实第4个氨基酸点突变（S754）处存在一个免疫优势抗原表位。将该表位肽段由N端和C端逐步缩短继续鉴定,当N端缩短到第5个氨基酸（^754SDQPAK^759）C端缩短到第3个氨基酸（^749KGEPVSDQ^757）时,表达的融合蛋白不能与PRRSV阳性血清反应,最终推测该抗原表位必需氨基酸为^753VSDQ^756。选取GenBank中提交的部分高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的Nsp2氨基酸序列,对该表位氨基酸所在位置进行序列比较,分析结果显示位于Nsp2蛋白749→759位氨基酸序列高度保守,F65—11变异位点C^754→7^754为HuN4株系列传代毒株所特有。本研究结果证实抗原表位F65—11可以作为鉴别HuN4-F112弱毒疫苗所诱导产生的特异性抗体的候选抗原。