重组马槟榔甜蛋白MabinlinⅡ在大肠杆菌中的表达

MabinlinⅡ是我国所特有且唯一的植物甜蛋白，在体外至今没有得到具有甜味的基因表达产物。本文根据己知马槟榔甜蛋白的序列设计引物克隆MabinlinⅡ基因，对基因进行剪切重组。将重组基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-30a（＋）中，构建了3个重组表达载体，转化大肠杆菌BL21（DE3），得到三株表达重组马槟榔甜蛋白的大肠杆菌工程菌。经IPTG诱导，3个重组MabinlinⅡ基因可在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达。     

油菜黑芥子酶基因重组表达质粒的构建以及在大肠杆菌中的表达

通过RT-PCR从浙双758油菜(Brassica napus)种子的总RNA中扩增出黑芥子酶(EC3.2.1.147)MYR J基因,并克隆测序,测序结果在GenBank中的登陆号为EF583560,其翻译的氨基酸序列与黑芥子酶(GenBank中的登陆号为Q00326)仅有一个氨基酸不同,同源性达到99%.克隆载体经Sal I酶解后将MYRI基因片段插入载体pGEX-4T-1中构建成原核表达载体pGEX-4T-1-MYR1,并转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中.其重组菌株经IPTG诱导表达,在90 kD处有表达量很高的1条带.用0.02 mmol/L IPTG 20℃诱导2 h,得到可溶的GST-MYR1融合蛋白,用10 mg/mL芥子苷作底物,经过检测其比活力为0.003 1 U/mg.     

重组大肠杆菌表达降氰酶的诱导条件优化

采用积分光密度法对产碱杆菌（Alcaligenes sp.）降氰酶基因在大肠杆菌中的高效表达进行了诱导条件优化,以工程菌BL21（DE3）-pET28a-cdE的诱导表达条件进行优化,以提高目的蛋白的产量和活性。结果显示,重组菌表达降氰酶的最佳诱导条件为温度28℃,初始菌体浓度OD600值为0.6,IPTG浓度为0.8mmol/L,诱导时间12h。研究发现,诱导剂的添加浓度对外源蛋白的表达水平具有显著影响,使用终浓度为0.8mmol/L的IPTG,诱导表达12h,降氰酶蛋白收率达到143.27mg/L,比活力达到11560 U/mg。与不添加诱导剂相比,重组蛋白的收率和比活力分别提高了64倍和9倍。     

甘蓝型油菜中黑芥子酶基因在大肠杆菌中重组质粒的构建和表达

实验通过RT-PCR程序从提取的油菜总RNA中扩增出硫代葡萄糖苷水解酶（又称黑芥子酶,EC3.2.1.147）基因,酶解后插入大肠杆菌表达载体（Escherichia coli）pGEX-4T-1,获得克隆菌株。基因测序在 GenBank中的登陆号为EF583560,翻译的氨基酸序列与已报道的黑芥子酶（GenBank中的登陆号为Q00326）中的一段有一个氨基酸不同,同源性达到99%。经过IPTG诱导表达,在91KDa左右处有表达量很高的一条带。     

法氏囊素在大肠杆菌中的表达及其免疫增强活性

选用大肠杆菌(Escherichiacoli)编码赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)和甘氨酸(Gly)的常用密码子按顺序排列成BS基因:5'-AAACACGGT-3'。连续合成10个BS(BS10)串连基因单链及其反向互补链,通过退火使其复性成双链。BS10基因经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后,克隆进表达载体pGEX-6P-1中。获得的重组质粒pGEX-Bur转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,串连的BS10基因获得了高效表达。表达产物经GST亲和层析和胰酶消化处理后,按适当的浓度和新城疫病毒(NDV)混合,免疫90只30日龄的小白鼠。分别在免疫后第7,14和21天,用血凝抑制试验(HI)测定小鼠血清中NDV的抗体水平,结果加入囊素的实验组比不加囊素的对照组HI平均高出22.5个滴度。同样的实验样品免疫100只8日龄SPF(speclficpathogenfree)鸡,15d后实验组的抗体水平比对照组平均高出20.7个滴度。研究结果证实了用大肠杆菌表达的法氏囊素对小鼠和鸡具有免疫增强的作用。     

Prd29A启动子在小麦中的诱导表达活性及大肠杆菌海藻糖合成酶基因的转化

以gus基因为报告基因，通过瞬时表达测定了Prd29A诱导型启动子在小麦愈伤组织中的诱导表达活性。结果表明，Prd29A-gus基因的表达水平可在不同浓度NaCl盐的胁迫条件下得到显著提高。由此证实，Prd29A启动子在小麦中具有较强的诱导表达活性。在此基础上，将Prd29A诱导型启动子驱动下的大肠杆菌海藻糖合成酶基因（otsA）采用花粉管途径导入目的小麦品系，经PCR筛选、Southern鉴定及转化后代海藻糖含量的测定，获得了一批otsA转基因植株及株系，为进一步选育耐盐抗旱的转基因小麦新品系奠定了基础．     

人β-防御素-3与植物甜蛋白Brazzein嵌合基因的合成及其在大肠杆菌中的表达

根据人β-防御素-3(hBD3)和植物甜蛋白Brazzein(Bra)的成熟区氨基酸序列，按照细菌密码子的偏爱人工合成了7对末端具粘合位点的核苷酸序列。经连接和PCR扩增，使人β-防御素-3与植物甜蛋白Brazzein的编码序列通过一段序列（含凝血酶切割位点涟接成为嵌合DNA。将其插入到pET30a的T7启动子之下，构建成了防御素和甜蛋白双价基因的表达载体pET30a-hBDs-Bra，在大肠杆菌(Eschenchia coli)BL21中诱导表达后，得到了与预计分子量相同的蛋白，约占总蛋白的30．5％，产量约为1．4～2．8mg/mL。     

复合多糖酶Viscozyme L在制备燕麦麸分离蛋白中的应用

以脱脂燕麦麸为原料,通过碱溶酸沉工艺制备燕麦麸分离蛋白。在传统工艺基础上增加了复合多糖酶Viscozyme L预处理过程,并通过响应面回归分析方法对预处理条件进行了优化,确定最优的工艺参数为：加酶量3.02 FBG/g,pH 4.6,温度44℃,预处理时间2.8 h。与传统工艺相比,燕麦麸蛋白的提取率由6.6%提高到56.2％,分离蛋白制品纯度由72.9%提高到81.7％。     

黑曲霉木聚糖酶基因xynB在大肠杆菌中的表达及重组木聚糖酶的特性

从黑曲霉(Aspergillus niger) mafic-005中克隆得到木聚糖酶基因xynB。序列分析表明，该基因全长745 bp，含有一个67 bp内含子，编码225个氨基酸，理论分子量为24 kD(GenBank登录号:DQ174549)，与已知黑曲霉xynB基因的同源性均较高。将该基因定向插入大肠杆菌(Escherichia coli )表达载体pET-28a (+)上，并转化E. coli BL21 获得重组菌株。经过IPTG诱导，xynB基因获得特异性表达。经SDS-PAGE分析，重组蛋白分子量约为30 kD。该重组蛋白经镍NTA琼脂糖凝胶FF纯化后达到电泳纯。酶学性质分析表明，重组木聚糖酶最适温度为40 ℃，最适pH值为5.0，在酸性和常温条件下具有良好的稳定性。     

人肥胖基因在大肠杆菌中的表达及生物学活性检测

肥胖基因(ob)编码的瘦蛋白可以反映机体脂肪含量信息,在发育、繁殖、造血及体重调节等方面具有重要功能。利用PCR方法扩增去除信号肽的人肥胖基因cDNA序列,并将位于基因5!端的CCC转变为大肠杆菌(Escherichiacoli)常用密码子CCG,扩增片段经测序证实后,克隆到原核表达载体pET5a,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.1mmol/LIPTG诱导,获得分子量约为16kD的特异蛋白表达带,表达量最高占菌体蛋白总含量的55%。重组蛋白纯化后,注射昆明白小白鼠,小白鼠体重明显下降,说明纯化的重组蛋白具有生物学活性。     

胸腺素家族多肽在大肠杆菌中的表达

为提高胸腺素(又名胸腺肽,thymosin)的体外表达效率,本研究采用设计融合标签的方法对胸腺素α1和β4(Tα1,Tβ4)进行体外重组表达,通过超高效液相色谱-飞行时间质谱联用(LC/MS)法,对融合蛋白的完整分子量进行验证,利用反相超高效液相色谱法对不同表达载体的单位表达量进行测定.结果 表明,A 18-KEKE、...     

小鼠表皮生长因子在Escherichia coli中重组表达

以大肠杆菌（Escherichia coli）BL21为表达宿主，重组表达小鼠表皮生长因子。以pET30a为出发载体，构建了包含mEGF编码序列的重组表达载体pETmEGF，采用低温诱导表达和无破胞程序的冻融法进行纯化，得到了浓度为17．24μg/mL和纯度为57％的mEGF融合蛋白，其活性相当于标准小鼠表皮生长因子的29．16％。     

重组犬IFN-γ在大肠杆菌中的高效表达

提取Concavadin A诱导培养的犬脾细胞总RNA，经RT-PCR扩增出犬IFN-γ，克隆到pMD18-T载体并测序鉴定，然后把IFN-γ基因克隆到原核表达载体PJLA605，构建pRL-Ca／IFN-γ表达质粒；应用M9培养基通过摇瓶发酵，确定诱导时机和诱导表达时间。结果表明，工程菌pRL-CaIFN-γ在30℃培养至OD600为1．5于42℃诱导4h，菌体收获量湿重达20．0gm，目标蛋白表达量约占菌体总蛋白的32％，外源基因在该基因工程菌中得到了高效表达。     

在大肠杆菌内高效表达大分子量拟蜘蛛牵丝蛋白

依据已报道的蜘蛛(Nephilaclavipes)牵丝蛋白部分cDNA序列,设计合成两种不同结构的拟蜘蛛牵丝蛋白基因单体,大小分别为360和390bp。多聚化得到8倍体和16倍体后,克隆到表达载体pET-30a,得到4种表达载体,转化大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)诱导表达。用自制的抗蜘蛛牵丝蛋白血清Westernblot检测,表达产物呈梯度排列,主带与预计大小一致。蜘蛛牵丝蛋白表达量最高为800mg/L。     

粘虫痘病毒增效蛋白的重组表达及其生物活性

昆虫病毒增效蛋白(enhancin)在体外能促进核型多角体病毒(NPV)对昆虫离体细胞系的感染;在体内能显著提高NPV对昆虫幼虫的感染效果,并可增强苏云金芽孢杆菌(Bt)对幼虫的毒力(Hashimoto et al.,1991;Roelvink et al.,1995)。粘虫痘病毒(Pseudaletia separata entomopoxvirus,PsEP     

近年来大肠杆菌K88ac菌毛的变异和生物学特性

2000~2005年，从猪大肠杆菌病 (colibacillosis)中分离到一些表达K88菌毛的大肠杆菌(Escherichia coli )，这些分离株只与K88 a因子单抗反应，而不与K88 b、c和d因子单抗反应。分离的菌株 (13/16)以O149为常见血清型，且全部拥有STb毒素基因，通过K88常规血清交叉吸收试验、SDS-PAGE和Western印迹，表明这些菌株不仅与K88ac参考菌株C83907制备的c因子血清反应，而且与以分离株SEC586制备且经K88ab、K88ac和K88ad参考菌株吸收后的血清也反应，表明这些分离株仍为K88ac大肠杆菌。对新近分离的SEC464、SEC525、SEC586、SEC799和EC910株及80年代我国分离的TM128株的K88主要亚单位结构基因faeG进行克隆、测序，发现新近分离株的faeG基因由846对核苷酸组成，编码菌毛主要亚单位的261个氨基酸及21个氨基酸的信号肽，比国内外报道的K88ac FaeG亚单位 (262个氨基酸)少了一个氨基酸，比K88ab、K88ad (264个氨基酸)少了3个氨基酸。TM128株的FaeG氨基酸序列与K88ac(M29375)的同源性为100.0%，SEC464、SEC525、SEC586、SEC799和SEC910株的FaeG亚单位氨基酸序列的同源性为97.7%~99.6%，它们与K88ac的同源性为94.6%~96.6%；与K88ab的同源性为90.0%~91.6%；与K88ad的同源性为87.0%~88.9%。 结果表明新分离的K88ac大肠杆菌黏附素主要亚单位已发生了部分变异。     

人乙醛脱氢酶2的原核表达及其条件优化

为实现人乙醛脱氢酶2（ALDH2）基因在原核生物中高效表达,将含有6×His标签和SUMO融合蛋白标签的人乙醛脱氢酶2基因的表达载体转化至宿主菌BL21（DE3）中。在异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导下,目的基因在大肠杆菌内高效表达。通过对表达条件的优化,37℃使用终浓度0.3mmol/L的IPTG诱导3h,重组大肠杆菌的表达量可占全菌蛋白的16%。SUMO融合蛋白标签的加入以及较低的诱导温度（16℃）有利于提高人乙醛脱氢酶2基因在大肠杆菌内的可溶性表达。     

鸡白介素-2基因在大肠杆菌中表达及多克隆抗体制备*

将编码鸡(Gallus gallus)白细胞介素-2(interleukin-2,IL-2)蛋白的基因亚克隆到大肠杆菌(Eschetichia coli)原核表达载体pPROEX^HT中，构建重组质粒并进行确证性序列测定。然后将重组质粒转化大肠杆菌DH5α并用IFTG于37℃诱导培养。SDS-PAGE和Western blot分析显示，表达的鸡IL-2融合蛋白分子量约为19kD。融合蛋白经薄层扫描发现目的蛋白表达量约占菌体蛋白的30％。包涵体被6mol／L，盐酸胍裂解后，通过镍离子亲和树脂进行了纯化。用所获得的重组鸡IL-2融合蛋白及其纯化产物免疫家兔，制备兔抗鸡IL-2多克隆抗血清，并用琼脂扩散实验对多克隆抗血清进行鉴定，表明其与纯化的重组鸡IL-2蛋白具有良好的反应性，而且该反应是特异的。